Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Технология биологических микрочипов 9
1.2. Аналоги клеточных микрочипов 11
1.3. Иммобилизация клеток. Гелевые основы для иммобилизации живых клеток 15
1.3.1. Агароза 16
1.3.2. Альгинат 17
1.3.3. Полиакриламид 18
1.3.4. ПАА-гидразид 19
1.4. Влияние иммобилизации микроорганизмов в ПААГ на их жизнеспособность 19
1.5. Физиология и морфология иммобилизованных клеток, характер роста в геле 21
1.6. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток... 22
1.7. Выводы к главе 1 24
Глава 2. Материалы и методы 25
2.1. Реактивы, штаммы и условия культивирования 25
2.2. Компоненты гелеобразующих растворов 26
2.2.1. Акриламид и бисакриламид... ..26
2.2.2. Персульфат аммония 26
2.2.3. ТЭМЕД 27
2.2.4. Полиакриламид-гидразид 27
2.2.5. Агароза, альгинат 28
2.2.6. Глицерин 29
2.3. Подготовка подложки для ГКМ 29
2.4. Оценка токсичности компонентов 29
2.5. Введение флюоресцентной метки в живые бактериальные клетки 30
2.6. Регистрация флюоресценции и люминесценции ячеек ГКМ. Обработка данных 31
2.7. Инкубационная камера 34
Глава 3. Конструирование гидрогелевого клеточного микрочипа 35
3.1. АгарозныйГКМ 35
3.2. Полиакриламидный ГКМ 38
3.2.1. Влажность атмосферы 39
3.2.2. Размер ячеек 42
3.2.3. Температураполимеризиции 44
3.2.4. Скорость полимеризации 44
3.2.5. Акриламид и бисакриламид 48
3.2.6. Глицерин 49
3.2.7. Осмолярность ГР 49
3.2.8. Персульфат аммония 50
3.2.9. ТЭМЕД 50
3.2.10. Изготовление полиакриламидного клеточного микрочипа 50
3.2.11. Установки для полимеризации ПКМ 52
3.3. Полиакриламид-гидразидный ГКМ 55
3.4. Альгинатный КМ 56
3.4.1. Способ химической пришивки альгината к поверхности подложки 57
3.4.2. Изготовление альгинатного клеточного микрочипа 58
3.5. Хранение КМ: 60
3.6. Выводы к главе 3 61
Глава 4. Исследование внутриклеточных процессов и детекция химических соединений с помощью км 63
4.1 Детекция антибиотиков 63
4.2. Количественный анализ антибиотиков 65
4.3. Мониторинг синтеза НК и белка у прокариот и дрожжей. Оценка влияния веществ на синтез НК и белка у Е.соН на примере хлорамфеникола 67
4.4. Обнаружение и количественое определение веществ, индуцирующих флюоресцентные и биолюминесцентные репортеры 73
4.5. Выводы к главе 4 79
Заключение 80
Список литературы 83
- Иммобилизация клеток. Гелевые основы для иммобилизации живых клеток
- Влияние иммобилизации микроорганизмов в ПААГ на их жизнеспособность
- Регистрация флюоресценции и люминесценции ячеек ГКМ. Обработка данных
- Изготовление полиакриламидного клеточного микрочипа
Иммобилизация клеток. Гелевые основы для иммобилизации живых клеток
В связи с необходимостью фиксирования клеток в элементах микрочипа, важно рассмотреть способы и особенности иммобилизации живых клеток. Еще в 1823 году Шутценбах в Германии использовал закрепленные на буковой стружке бактерии для производства уксуса, основываясь на еще более раннем прототипе XVIII века [45, 92]. Интенсивные исследования по иммобилизации клеток начались в конце 60-х - начале 70-х годов XX века. И к концу 70-х сформировалось мощное научное направление в этой области.
В целом, иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение клеток и окружающей их среды, при котором сохраняется возможность обмена субстратами и продуктами реакций [96]. В литературе описано включение в гель бактериальных, дрожжевых, грибковых, растительных и животных клеток [25, 39, 49, 50, 62, 73], любая клетка может быть иммобилизована [58]. Для живых клеток чаще применяют метод адсорбции [21] и включения в различные гели как природные [10], так и синтетические [5], используемые в большинстве случаев в форме мембран и гранул [86]. Многие обзоры посвящены иммобилизации клеток [41,68,99,100].
Для нас наибольший интерес представляет иммобилизация в массе геля: включение клеток в полимерную сетку, например, полиакриламидного геля [5, 50, 54, 95, 100, 101, 103, 107] или альгината кальция [26], путем проведения полимеризации или реакции поперечного сшивания. Родственными методиками являются инкапсулирование в липосомы, нейлоновые, коллодиевые мембраны, физическая изоляция клеток от других компонентов в аппаратах для ультрафильтрации. Достоинством иммобилизации путем включения в гель является удержание делящихся клеток в массе геля (в отличие от адсорбции, где дочерние клетки освобождаются от связи с носителем), причем в случае применения высокоэластичных гелей (ПААГ), деление клеток приводит к формированию микроколоний внутри геля [100], которые можно наблюдать в световой микроскоп.
Многие гели опробованы для иммобилизации живых клеток: альгинаты [75], каррагинан [11], коллаген [49], желатин [15], силикагель [7, 34], ксантан, агароза [19], полиуретаны [52], поливиниловый спирт [83], фоточувствительные полимеры [102]. Обычно гель с клетками используют в виде гранул, полученных при механическом дроблении крупных фрагментов через сито [99]. Чтобы подобрать условия иммобилизации бактерий в микрокаплях геля, необходимо представлять себе свойства используемых гелевых основ и изучить имеющийся опыт по их применению. Этому вопросу посвящен следующий раздел обзора.
Агароза — полисахарид, образующий гель при охлаждении горячего раствора. Суспензию клеток вносят в раствор и охлаждают смесь. Температура гелеобразования легкоплавкой агарозы 25—30С. Для понижения температуры гелеобразования агарозу можно химически модифицировать введением гидроксиэтильных групп. Структурная целостность, жесткость и пористость агарозного геля определяются его вторичной структурой, характеризующейся наличием водородных связей между агарозными цепями. Гель обладает порами достаточными для проникновения белков массой до нескольких мегадальтон. Иммобилизация в агарозном геле используется преимущественно для животных клеток [19]. Преимуществом агарозы является её стабильность в отсутствие противоионов. Однако механическая прочность агарозного геля ниже, чем альгинатного или геля каррагинана при одинаковой концентрации полимера [96], с этим, возможно, связана немногочисленность работ по иммобилизации клеток в агарозном геле.
Альгинат — основной структурный полисахарид бурых морских водорослей - состоит из регулярных последовательностей, связанных между собой в положениях 1 и 4 остатков p-D-манно-пиранозилуроната и a-L-гулопиранозилуроната [56]. Во всех молекулах альгината представлены обе гомополимерные последовательности, хотя и в разной степени. В присутствии моновалентных катионов полисахариды даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор, а в присутствии двухвалентных катионов (Са , Ва ) образуют гель. Мягкие условия гелеобразования позволяют включать в альгинат животные клетки. Именно это применение альгината получило наиболее широкое распространение [26, 58, 72, 75, 96].
Следует отметить, что несмотря на хорошие диффузионные свойства Са-альгината, его механическая прочность недостаточна для длительного использования. В ходе длительных непрерывных и особенно многократных периодических процессов носитель разрушается, что приводит к ухудшению его диффузионных характеристик и вымыванию клеток [102]. Кроме того, недостатком альгинатных гелей является их нестабильность в растворах, содержащих хелатирующие агенты. Хелаты разрушают структуру геля, связывая образующий его поливалентный металл [72].
Влияние иммобилизации микроорганизмов в ПААГ на их жизнеспособность
Наибольшее количество работ 70х -80х годов в области иммобилизации клеток связано с включением в ПААГ. Уже в первых публикациях отмечалось, что клетки в данном геле могут оставаться жизнеспособными [79]. Затем появились работы, свидетельствующие о размножении клеток в геле [101, 107]. На основании результатов морфологических и биохимических исследований некоторые авторы [95, 104] утверждают, что наиболее токсичным для бактерий веществом является акриламид, в то время как МБАА влияет мало, т.к. используется в более низких концентрациях, чем АА. Минимальное воздействие мономеров на клетки достигается путем быстрого проведения реакции полимери-зации. При увеличении температуры и времени контакта отрицательное влияние этих компонентов на- активность возрастает; Интересные результаты получены при изучении влияния температурного режима и длительности процесса полимеризации на 1,2-дегидрогеназную активность и жизнеспособность Mycobacterium globiforme. Значения обоих показателей резко падали с повышением температуры и с увеличением длительности полимеризации (Табл. 1).
Еще одним источником повреждения биологических функций микроорганизмов являются свободные радикалы. С компонентами клеток могут реагировать как радикалы инициатора, так и радикалы растущих цепей, в результате чего синтетический полимер обнаруживается даже в глубине клетки [33].
Известно, что влияние мономеров и процесса полимеризации весьма специфично для клеток разных микроорганизмов. К примеру, 85-90% клеток А. globiformis могут сохранять жизнеспособность в найденных условиях иммобилизации в ПААГ, тогда как в этих же условиях лишь 30% Saccharomyces cerevisiae остаются жизнеспособными. Т.о., метод может быть использован не для всякой культуры,
По изучению живых клеток в иммобилизованном состоянии накоплено значительное количество экспериментальных данных, позволяющих охарактеризовать физиолого-биохимические особенности таких клеток. Мы кратко рассмотрим некоторые особенности физиологии и метаболизма клеток, растущих в гелях.
По данным исследователей (1985) Калифорнийского технического института [18], метаболизм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выросших в желатине, отличен от свободных клеток. Удельная скорость роста ниже на 45%, удельная скорость образования этанола на 40-45% выше, глюкоза потребляется в 2 раза быстрее. Выход биомассы на 30% меньше. Измерение внутриклеточных полисахаридов показало, что иммобилизованные клетки (ИК) имеют больше резервных углеводов и содержат больше полисахаридов. Количество ДНК, РНК и белка было в 2 раза больше у иммобилизованных дрожжей. Авторы предполагают, что это может быть связано с изменением клеточного цикла деления, репликации ДНК и синтеза клеточной стенки. Согласно данным других авторов, удельная скорость роста клеток Salmonella typhimurium, иммобилизованных в желатине, не отличается от таковой, полученной для свободных клеток [8]. Повышение концентрации полимера приводило к снижению инвертазнои активности дрожжей [5]. Следует отметить сохранение функциональной активности ИК, как это видно из работ по биосинтезу большого ряда веществ, например: глутаминовой кислоты клетками Corynebacterium glutamicum, заключенными в ПААГ [ПО], лимонной кислоты — клетками Aspergillus niger и Candida lipolytic включенными в ПААГ и коллаген [85]. Было установлено, что именно условия иммобилизации определяют жизнеспособность клеток сразу после иммобилизации и длительность ее сохранения в ходе использования [102].
Увеличение- количества клеток Saccharomyces cerevisiae в гранулах кубической формы отмечено Сие и Девис [71] в процессе получения этанола из глюкозы. Показано, что возрастание содержания белка, а также увеличение объема гранулы после 96 ч ферментации происходило в результате роста в верхних слоях гранулы. При этом 95% от общей метаболической активности также локализовано в верхних слоях, в то время, как активность внутри куба составляла всего 2-4%. По данным Егорова с соавт. [99] в процессе деления количество бактериальных клеток, иммобилизованных в каррагинане возрастает с 3-Ю6 до 5-10 Исследовано влияние структуры фотопоперечносшитых полимеров на характер роста и распределение в геле мицелия Curvularia lunata. Споры гриба включали в полимеры, отличающиеся между собой длиной цепи преполимеров. Увеличение длины цепи исходных преполимеров от 10 до 60 нм способствовало усилению роста мицелия в полимере [73].
Регистрация флюоресценции и люминесценции ячеек ГКМ. Обработка данных
Для вышеуказанной цели использовали установку для анализа микрочипов (УAM, рис.1) состоящую из широкопольного люминесцентного микроскопа (ЛОМО) 1), CCD-камеры (Roper Scientific, США) 1024x1536 пикселей (2), термостатируемого столика (3), термоконтроллера Model 3751, Wavelength Electronics, Inc (США) (4), узла фильтров (5) и компьютера Intel Pentium II (9). Прибор был разработан, как средство для регистрации слабых световых потоков от микрообъектов, меченных флюоресцентными красителями. Световой поток, возбуждающий флюоресценцию красителя излучается ртутно-кварцевой лампой ДРШ 350-2, проходит через интерференционный светофильтр, входной зрачок нижней части объектива и фокусируется на микрочипе. Свет флюоресценции микрочипа собирается нижней частью объектива, проходит через светоделительную пластину, запирающий интерференционный светофильтр и фокусируется верхней частью объектива на светочувствительную поверхность CCD-камеры (2). Запирающий светофильтр отсекает свет возбуждения и пропускает свет флюоресценции красителя. Светофильтры и светоделительная пластина выполнены в виде отдельного спектрального блока. Узел фильтров (5) включает в себя 4 блока, что позволяет параллельно анализировать флюоресценцию до четырех различных флюоресцентных меток. УАМ позволяет регистрировать люминесцентный сигнал, что также было использовано в работе. Для этого из спектрального блока удаляли фильтры и светоделительную пластину. В результате на светочувствительную поверхность CCD-камеры попадал собственный свет микрочипа.
При работе с люминесценцией, использовали дополнительный светонепроницаемый чехол. Термостолик закреплен на подвижном по трем осям основании, что дает возможность фокусировки и позиционирования микрочипа. Управление температурой микрочипа осуществляется термоконтроллером (4). Размер поля микроскопа 8x12 мм. Увеличение объектива 1,7х или 3х. Ниже, в табл. 4, приведены параметры фильтров двух блоков, которые использовались в работе. Информация с CCD-камеры обрабатывалась и анализировалась посредством разработанных фирмой «Биочип-ИМБ» (Москва) программ ChipExpert, Analyze и ImaGel 2.0, а также Winview 2.5.12.2 (Roper Scientific, США). Нормированный флюоресцентный (F„) или люминесцентный (Z„) сигнал вычисляли по формуле: Fn(mu LJ S-BJ/B, где - сигнал от ячейки, В - фоновый сигнал вокруг ячейки. УАМ позволяет записывать изображение микрочипа и получать данные зависимости флюоресценции (люминесценции) от времени и температуры микрочипа. 1 - эпифлюоресцентный микроскоп, 2 - CCD-камера, 3 - термостолик, 4 - термоконтроллер, 5 - узел фильтров, 6 - компьютер. Для экспериментальной работы с готовыми микрочипами была изготовлена инкубационная камера (рис.2). На основание камеры (1) помещали микрочип (2), п/э прокладку с двумя липкими сторонами (3) и крышку камеры (4), состоящую в свою очередь из алюминиевой рамки (4а) и кварцевого стекла (4Ь) с двумя отверстиями, в которые вставлены силиконовые трубки (4с). Крышка (4) привинчивается к основанию (1), после чего через трубку (4с) камера может быть заполнена изучаемым раствором. Всю конструкцию закрепляли на термостатируемом предметном столике (4, рис.1) УАМ. Объем инкубационной камеры зависит от толщины прокладки (3), и в нашей работе он составлял 100 мкл. Эта глава посвящена разработке технологии изготовления клеточного микрочипа. Здесь приведены результаты поиска гелевой основы для КМ, некоторые характеристики опробованных гелей и критерии выбора наиболее подходящего из них. Мы исследовали четыре вещества: агарозу, акриламид, ПАА-гидразид и альгинат. Результаты по каждому приведены в том порядке, в каком проводился поиск. Критериями для отбора служили: влияние на жизнеспособность ИК и технологичность, т.е. применимость для массового производства КМ. В отношении последнего, значимыми признаками являлись: температура жидкого состояния ГР, наличие способа фиксации к подложке, контролируемый запуск полимеризации. Однако изначальной целью был поиск геля, условия полимеризации которого были бы достаточно мягкими для иммобилизации живых бактерий, и получение экспериментального подтверждения сохранности физиологической активности ИК. Ниже приведены результаты по каждому гелю. В ходе проделанной работы получен ряд протоколов изготовления КМ, а также выработаны общие рекомендации по изготовлению КМ на основе ПААГ и альгината. Большую часть главы составляет оценка влияния компонентов акриламидного ГР и физических условий, значимых для жизнеспособности ИК. Чтобы получить экспериментальное подтверждение сохранности бактерий, иммобилизованных в микрообъемах геля, был изготовлен прототип КМ на агарозном геле. Для фиксации микрокапель агарозы, на предметном стекле формировали полиакриламидную подложку следующим образом. Между кварцевой маской и обработанным, как указано в п.2.3, предметным стеклом, 36 помещали две полоски спейсера (20 мкм), по краям. Пространство между ними заполняли раствором следующего состава: 5% АА:МБАА, 19:1, 60% глицерин, 0.4% раствор 1-кратного метиленового синего, 1.2% ТЭМЕД. Конструкцию помещали на трансиллюминатор (294 нм) кварцевой стороной к источнику УФ на 20 мин. После чего, отделяли кварцевую маску, промывали и просушивали предметное стекло с фиксированным на нем слоем ПААГ. Микрокапли агарозы, нанесенные на такую подложку, механически удерживались на ее поверхности. Расплав агарозы (2.5%) охлаждали до 37С, смешивали с глицерином (20%), суспензией клеток и наносили на охлажденную до 0С подложку, в результате чего формировался гель. Согласно схеме (рис. ЗА), в микрокаплях агарозы, были иммобилизованы клетки четырех штаммов Е.соІі (№№ 1, 2, 4, 7; табл.2), отличающихся устойчивостью к ряду антибиотиков. Количество бактерий оценивали по содержанию нуклеиновых кислот в гелевых ячейках, путем введения в питательную среду проникающего через мембрану клеток и связывающегося с нуклеиновыми кислотами витального флюоресцентного красителя SYTO 9. В наших экспериментах 1 ОЕ (относительная единица) соответствовала 1.02±0.12х105 клеток E.coli К12, TG-1. Согласно Haugland [30] и по нашим наблюдениям, в живой клетке происходит накопление SYTO 9, а после гибели бактериальной клетки краситель частично возвращается в питательную среду. Чтобы подтвердить физиологическую сохранность иммобилизованных клеток, четыре микрочипа были проинкубированы в питательной среде LB с SYTO 9 (в разведении 1:300), в том числе, в присутствии антибиотиков (рис.3) при 37С в течение 20 ч.
Изготовление полиакриламидного клеточного микрочипа
В результате проведенной оценки влияния отдельных компонентов ГР и этапов изготовления ПКМ на жизнеспособность ИК, была разработана следующая технология изготовления. Процедура получения ПКМ включает в себя три основных этапа: (а) приготовление гелеобразующего раствора ПААГ, содержащего иммобилизуемые клетки; (б) нанесение микрокапель полученной смеси на подложку; (в) полимеризация микрокапель с последующей отмывкой от непрореагировавших мономеров, глицерина и свободных клеток. (а) Приготовление ГР. Гелеобразующие растворы для ПААГ приготавливались на денонсированной воде Milli Q и в качестве обязательных компонентов содержали: - смесь мономеров АА (Sigma) и МБАА (Bio-Rad) в соотношении 19:1; глицерин (Serva, GmbH или Sigma); ПСА (Хеликон, Москва); - rPBS(Sigma). Смесь АА, МБАА, глицерина и PBS хранили при 4С. Во всех экспериментах использовали клетки, выращенные до стационарной фазы. ПСА и суспензию микроорганизмов (в конечной концентрации 10-20 об%) вносили непосредственно перед нанесением КМ. Для снижения токсического действия компонентов гелеобразующего раствора на клетки, внесение культуры в ГР производили на льду. Несмотря на наличие в ГР инициатора полимеризации (ПСА), в отсутствие катализатора раствор находится в жидком состоянии и доступен для нанесения. В плашку на 384 колодца (Genetix) вносили по 20 мкл ГР. (б) Нанесение микрокапель ПААГ. Микрокапли растворов наносили на стекло либо вручную, пином диаметром 0.4 мм, либо роботом GMS 417 Аггауег (Genetic MicroSystems, USA), пином 0.6мм. Между нанесениями в обоих случаях пин стерилизовали этанолом. Во избежание гибели клеток в результате высыхания микрокапель, при нанесении вручную подложку охлаждали до 2-10С, а нанесение роботом проводили в увлажненной атмосфере (точка росы 0-5 С) при комнатной температуре.
Время между нанесением и полимеризацией не превышало 1 часа. (в) Полимеризация микрокапель ПААГ. На этапе полимеризации микрочип помещали в камеру, которую заполняли азотом, охлаждали подложку до 10С, вносили в камеру ТЭМЕД из расчета 1 мкл/дм3 и выдерживали от 5 до 20 мин. ТЭМЕД, диффундируя в гелеобразующий раствор, инициировал полимеризацию. После полимеризации, микрочип промывали в питательной среде для удаления свободных клеток и реагентов. Для отмывки применяли ростовую среду, 0.9% NaCl или PBS. Хранили в питательной среде или PBS при 4С, либо сразу использовали в экспериментальной работе. В ряде успешных экспериментов (с точки зрения жизнеспособности ПК) полимеризацию проводили при температурах подложки 6 и 15С, что позволяет считать значения внутри этих границ, диапазоном допустимых температур полимеризации. Для контроля условий полимеризации микрокапель ПААГ были изготовлены две установки для полимеризации ПКМ: УП-1 и УП-2. УП-1 (рис.11) позволяет полимеризовать микрочипы в камере с инертным газом, парами ТЭМЕДа, и при заданной температуре поверхности микрочипа. В полимеризационную камеру (1), на теплообменник (2) помещали требуемое количество (до 21 шт) неполимеризованных образцов (3), и продували камеру азотом или аргоном через увлажнитель в течение 1 мин. Затем, разъединив «функциональное соединение» (6), на фильтр (7) микродозатором наносили ТЭМЕД, вновь сочленяли соединение и пропускали газ еще несколько секунд, чтобы испарившийся ТЭМЕД проник в камеру. На время полимеризации камеру герметизировали.
Для охлаждения теплообменника (2) использовался термостат 2219 Multitemp II Thermostatic circulator, LKB Bromma (Германия); скорость охлаждения 2С мин 1. УП-2 (рис. 12) отличается от УП-1 возможностью подавать газ с заданной температурой и относительной влажностью и оперативно варьировать температуру поверхности микрочипа со скоростью до 10С мин" . В качестве контейнера использовали чашку Петри, закрытую эластичной полиэтиленовой пленкой. Для получения газа с требуемой влажностью и температурой был изготовлен (ЦКБ Геофизика, Москва) термовлагостат (6) состоящий из двух, последовательно расположенных блоков: радиатора и ванночки с водой (площадь зеркала 10 см ). Каждый блок снабжен элементом Пельтье и управляется контроллером (8). Заданную температуру газ приобретает, проходя через радиатор; испарение воды из ванночки приводит к его увлажнению. Датчик температуры и влажности (4) располагается в полимеризационной камере. Контроллер (8) снабжен цифровым индикатором, показывающим заданную и реальную температуру каждого из блоков и относительную влажность газа в камере. УП-2 является более совершенной установкой, позволяющей оперативно подбирать условия полимеризации заготовок ПКМ. УП-1 менее удобна для варьирования условий, но более предпочтительна в мелкосерийном производстве ПКМ.
