Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Салициловая кислота. Общая характеристика 12
1.2 Салицилат - ключевой интермедиат бактериальной деградации ряда ароматических соединений 12
1.2.1 Катаболизм индолил 3-уксусной кислоты - гормона растений 13
1.2.2 Салицилат - промежуточный продукт деградации карбарила 15
1.2.3 Салицилат - ключевой промежуточный продукт микробной деградации нафталина, фенантрена и антрацена 16
1.3 Биохимические пути биодеградации салицилата 18
1.4 Разнообразие генетических систем деградации салицилата у бактерий 27
1.4.1 Организация генов катаболизма нафталина и салицилата плазмиды NAH7...27
1.4.2 Генетические системы катаболизма салицилата аналогичные пак-гсшм плазмиды NAH7 29
1.4.3 ш^-гены штаммов-деструкторов нафталина Ralstonia sp. штамм U2
и Polaromonas naphthalenivorans CJ2 31
1.4.4 Гены биодеградации салицилата штамма Polaromonas sp. JS666 33
1.4.5 hyb-гепы Pseudomonas aeruginosa JB2 и Achromobacter xylosoxidans A8 33
1.4.6 Гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingobium и родственных им родов 34
1.4.7 Гены катаболизма салицилата грам - положительной бактерии Streptomyces sp. WA46 35
1.5 Регуляция генов биодеградации салицилата.
Салицилат - индуктор экспрессии некоторых оперонов 36
1.6 Распространенней эволюция катаболических оперонов...37
2 Материалы и методы 39
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 39
2.2. Питательные среды и условия роста 41
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов 41
2.4 Выделение тотальной ДНК бактерий 42
2.5. Выделение плазмидной ДНК 42
2.6. Приготовление блок-вставок 43
2.7. Конъюгационный перенос плазм ид 44
2.8. Полимеразная цепная реакция 44
2.9. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 46
2.10. Электрофорез в агарозном геле 46
2.11. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 47
2.12 Мечение ДНК методом рассеянной затравки 47
2.13 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах 48
2.14. Лигирование ДНК 48
2.15. Приготовление компетентных клеток E.coli 48
2.16 Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК 49
2.17 Определение нуклеотиднои последовательности ДНК 49 -
2.18 Определение удельных активностей ферментов 50
2.19 Выделение тотальной РНК 50
2.20 Синтез первой цепи кДНК 51
2.21 Картирование стартовой точки транскрипции 52
3 Результаты 53
3.1. Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов салицилата 53
3.2. Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата 55
3.3. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации салицилата 57
3.4. Амплификация ключевых генов биодеградации салицилата 59
3.5. Поиск последовательностей, отвечающих за утилизацию салицилата, в исследуемых штаммах 60
3.6. Анализ генов nahGl штаммов-деструкторов салицилата 62
3.7. Изучение экспрессии гена nahGl у исследуемых штаммов 64
3.8. Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P. putida 66
3.9. Анализ генов nahUштаммов-деструкторов салицилата 67
3.10. Деградация салицилата штаммом P. putida АК5 69
3.11. Клонирование генов катаболизма нафталина плазмиды рАК5 69
3.12. Клонирование генов катаболизма салицилата плазмиды рАК5 70
3.13. Анализ нуклеотидной последовательности
генов биодеградации салицилата плазмиды рАК5 72
4. Обсуждение 84
Выводы 95
Список литературы
- Катаболизм индолил 3-уксусной кислоты - гормона растений
- Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
- Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата
- Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P. putida
Введение к работе
Актуальность проблемы
Салицилат является широко распространенным в природе соединением, важным звеном метаболизма животных, растений и микроорганизмов. Он служит ключевым интермедиатом в бактериальных путях биодеградации нафталина, фенантрена, антрацена, карбарила и других токсичных и канцерогенных соединений, загрязняющих окружающую среду (Davies and Evans, 1964; Evans et al., 1965; Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). Салицилат также играет важную роль в регуляции экспрессии некоторых бактериальных генов. Многие микроорганизмы способны использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако накопление салицилатов в среде может подавлять рост микроорганизмов. К настоящему времени биохимические пути деградации салицилата у микроорганизмов достаточно хорошо исследованы. Бактерии рода Psendomonas могут утилизировать салицилат двумя способами: во-первых, трансформируя его в катехол с помощью салицилат гидроксилазы с дальнейшим расщеплением последнего по орто- или мета-путп; во-вторых, окисляя его посредством салицилат 5-гидроксилазы в гентизиновую кислоту.
Изучение как биохимических, так и генетических аспектов метаболизма салицилата тесно связано с исследованием системы утилизации его высокомолекулярного предшественника - нафталина. Имеющиеся данные указывают на то, что генетический контроль катаболизма как нафталина, так и салицилата у флуоресцирующих псевдомонад является весьма консервативным. Вероятно, это объясняется тем, что организацию генов деградации салицилата изучали на штаммах-деструкторах нафталина. Кроме того, у этой группы микроорганизмов исследование касалось в основном генов, контролирующих деградацию салицилата по мета-пути расщепления катехола. Несмотря на широкое распространение салицилата в природе разнообразие генетических систем биодеградации данного соединения у штаммов-деструкторов салицилата (но не нафталина) до настоящего времени не изучалось. Штаммы, метаболизирующие только салицилат, могут иметь отличную от деструкторов нафталина организацию катаболических генов и, возможно, другие пути утилизации данного соединения.
Особый интерес представляет изучение менее распространенного среди псевдомонад альтернативного пути деградации салицилата через гентизиновую кислоту.
У флуоресцирующих псевдомонад гены катаболизма различных ароматических углеводородов, в том числе салицилата, могут располагаться на конъюгативных плазмидах большого размера (Yen and Serdar, 1988; Herrick et.al., 1997). Известно, что гены биодеградации могут находиться в составе различных транспозонов (Tsuda and lino, 1990; Bosch et.al., 1999b; Tan, 1999). Транспозонная организация катаболических генов, их расположение на конъюгативных плазмидах способствует распространению биодеградативных признаков как внутри, так и между микробными популяциями и играет ключевую роль в адаптации микробных сообществ к возрастающему загрязнению окружающей среды. Рекомбинация между гомологичными областями может привести к делеции несущественных генов и последовательностей ДНК. В результате образуется структура оперона, наиболее эффективная для транскрипции всего катаболического пути. Исследование разнообразия и распространения генетических систем биодеструкции ароматических углеводородов позволяет понять молекулярные1 механизмы адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками.
Цель и задачи работы
Целью данной работы являлось изучение разнообразия и распространения генетических систем катаболизма салицилата у штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из загрязненных нефтепродуктами почв различных географически удаленных регионов.
В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:
Определение субстратной специфичности и генотипический анализ штаммов-деструкторов салицилата бактерий рода Pseudomonas изолированных из образцов почв, загрязненных нефтепродуктами.
Определение путей биодеградации салицилата вновь изолированными штаммами-деструкторами.
Исследование разнообразия генов салицилат 1-монооксигеназы, ключевого фермента биодеградации салицилата.
Изучение генетического контроля деградации салицилата штаммом Р. putida АК5, метаболизирующим данное соединение через гентизиновую кислоту.
Научная новизна
В настоящей работе проведен анализ генетических систем деградации салицилата 16 штаммов P. putida, изолированных из загрязненных почв различных географических регионов.
Подобраны новые специфические праймеры для обнаружения методом ПЦР и характеристики генов салицилат гидроксилаз, nahGl и nahU, негомологичных «классическим». Впервые изучено разнообразие данных генов, обнаружены два новых варианта последовательностей гена nahGl и один новый вариант гена nahU. Исследованы штаммы, содержащие несколько негомологичных друг другу последовательностей, кодирующих салицилат гидроксилазу.
Изучена организация генов катаболизма нафталина и салицилата штамма P.putida АК5, утилизирующего нафталин через салицилат и гентизиновую кислоту. Исследована организация нового, не описанного ранее, sgp-оперона, контролирующего деградацию салицилата в данном штамме.
Практическая значимость работы
Результаты, полученные в настоящей работе, представляют интерес как с фундаментальной точки зрения, так и имеют практическое применение.
Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить представления о молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению ксенобиотиками, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов.
Специфические праймеры для детекции генов салицилат гидроксилаз, подобранные в ходе данной работы, могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных деструкторов в загрязненной почве. Подобранные праймеры,
наряду с праймерами для детекции других ключевых генов биодеградации ароматических углеводородов (например, гена большой субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы - nahAc и катехол 2,3-диоксигеназы - naliH) можно использовать для создания ГЩР тест - систем для более точной оценки биодеградативного потенциала загрязненной территории. Поскольку полученные данные свидетельствуют о большей каталитической активности салицилат гидроксилазы NahU по сравнению с «классическими» салицилат гидроксилазами NahG, этот факт следует учитывать при выборе штаммов, используемых в биотехнологиях очистки окружающей среды.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB, Leipzig, 2006; Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», 2006; международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения СИ. Алиханяна. 2006; Российская школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 40-летию создания института ГосНИИгенетика, 2008. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 тезисов. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц и 32 рисунка. Библиография включает 181 наименования, из них 8 отечественных и 173 зарубежных работ.
Катаболизм индолил 3-уксусной кислоты - гормона растений
Карбарил (1-нафтил-/У-метилкарбамат) относится к группе высоко токсичных карбаматных инсектицидов, которые составляют большую часть пестицидов, применяемых в сельском хозяйстве. Известно, что многие почвенные микроорганизмы способны к деструкции карбаматных пестицидов (Rajgopal et al., 1984; Larkin and Day, 1986; Chapalmadugu and Chaudhry, 1993; Doddamani and Ninnekar, 2001).B водном растворе карбарил гидролизуется до более токсичного, чем исходное соединение, 1-нафтола, метиламина и С02 (Vontor, 1972) (Рис. 3). Кроме того, 1-нафтол образуется в результате микробной трансформации карбарила при участии карбарил гидролазы (Chapalmadugu and Chaudhry, 1993; Chaudhry et al., 2002; Hayatsu et al., 2001; Mulbry and Eaton, 1991). Микроорганизмы способны утилизировать 1-нафтол через 1,2- гидроксинафталин до салицилата, и далее через гентизат или катехол до интермедиатов цикла Кребса (Chapalmadugu and Chaudhry, 1991; Doddamani and Ninnekar, 2001; Larkin and Day, 1986; Svvetha and Phale, 2005).
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), состоящие из двух и более слитых бензольных колец, широко распространены в природе и представляют опасность для живых организмов и экосистем. Известно множество грибов, бактерий, водорослей, способных полностью утилизировать или трансформировать ПАУ с образованием менее токсичных продуктов, чем исходные соединения (Cerniglia, 1984). В настоящее время микробная деградация ПАУ является наиболее изученной, поэтому микроорганизмы чаще используются для биоремедиации загрязненных территорий (Sims et.al.,1990).
Процесс биодеструкции ПАУ детально изучен у Pseudomonas и родственных им бактерий на примере деградации простейшего ПАУ, нафталина (Wackett, 2003). Еще в 1943 году Стравински и Стоун установили, что промежуточным продуктом метаболизма нафталина является салицилат (Strawinski and Stone, 1943). Несмотря на это, полная метаболическая цепочка и основные ферментативные реакции деградации нафталина были установлены только в 1964г. (Davies and Evans, 1964). Катаболизм нафталина аэробными бактериями может осуществляться либо через неполное окисление нафталина до салициловой кислоты, с высвобождением пирувата и накоплением салициловой кислоты в ростовой среде, либо через полный катаболизм нафталина через салицилат с дальнейшей утилизацией последнего до интермедиатов цикла Кребса (Рис. 3).
Ферменты, катализирующие превращение нафталина, могут также принимать участие в трансформации фенантрена и антрацена в салицилат через похожие стадии. В данном случае фенантрен в результате серий реакций превращается в 1-гидрокси-2-нафтоат, а антрацен - в 2-гидрокси-З-нафтоат, которые затем через 1, 2-дигидроксинафталин или 2, 3-дигидроксинафталин, соответственно, утилизируются далее до салицилата и катехола (Menn et al., 1993; Sanseverino. et al., 1993).
В настоящее время у микроорганизмов наиболее распостранены два пути деградации салицилата: либо через образование катехола, либо - гентизата (Рис. 5). На данный момент наиболее исследованной является деградация салицилата через катехол. Ключевым ферментом данного пути является салицилат гидроксилаза (салицилат 1-монооксигеназа), которая осуществляет стехиометрическую трансформацию салицилата в катехол в присутствии кислорода и НАД(Н) (Рис.4) Впервые фермент, названный авторами «салицилат гидроксилаза», был выделен и частично очищен Katagiri с соавторами при исследовании механизма ферментативного гидроксилирования ароматических соединений из почвенного штамма, впоследствии определенного Pseudomonas sp. (Katagiri et al.. 1962). Было показано, что ФАД необходим для восстановления активности данного фермента после обработки сульфатом аммония.
Yamamoto и др. (1965) показали, что салицилат 1-гидроксилаза (салицилат 1-монооксигеназа) катализирует реакцию образования катехола путем гидроксилирования и одновременного декарбоксилирования салициловой кислоты в присутствии НАД(Н). Также были установлены: механизм реакции гидроксилирования молекулы салицилата, роль ФАД и некоторые свойства самого фермента (Yamamoto et al., 1965а b). Оказалось, что исследуемый фермент является мономером с молекулярной массой 57 kDa и флавопротеином, 1 моль которого свободно связан с одним моль ФАД. Последний не только является переносчиком в электрон-транспортной цепи гидроксилирования салицилата, но и, вероятно, защищает фермент от инактивации (Yamamoto et al., 1965 а). Эксперименты с 02 позволили установить, что салицилат гидроксилаза внедряет один атом кислорода в молекулу катехола, т.е. является монооксигеназой (Yamamoto et al., 1965b). Кроме того, показано, что реакция гидроксилирования первого атома углерода бензольного кольца сопряжена с декарбоксилированием. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и масс-спектроскопия продукта (катехола), полученного из меченого дейтерием салицилата при участии салицилат гидроксилазы, также подтвердили, что гидроксилирование и декарбоксилирование происходят в одной и той же позиции бензольного кольца (Hamzah and Ти, 1981).
Со временем салицилат гидроксилазы были очищены из разных почвенных микроорганизмов (White-Stevens, 1970; You et al., 1990; Bosch et.al., 1999b, Tu et.al., 1981; Balashova et al., 2001; Zhao 2005). Они отличались молекулярной массой, субъединичной структурой, субстратной специфичностью, кинетическими свойствами.
К настоящему времени механико-кинетические свойства салицилат 1-монооксигеназ хорошо изучены (Einarsdottir et al., 1988; Suzuki and Katagiri, 1981; Wang and Tu, 1984; Wang et al., 1984). Фермент связывает салицилат с образованием фермент-субстратного комплекса (Wang and Tu, 1984; Suzuki et al., 1969; Takemori et.al., 1969 a and b; Takemori et.al., 1970; White-Stevens, 1972b). В таком комплексе ФАД становится чувствительным к восстановлению в форму ФАДН2 при участии НАДН или НАДФН. Затем уже с восстановленным фермент-субстратным комплексом связывается молекула кислорода, которая окисляет флавин до ФАД и гидроксилирует молекулу салицилата. Конечными продуктами реакции являются катехол, С02 и Н20 (Suzuki and Katagiri, 1981).
Химическая обработка салицилат гидроксилазы из штамма P. putida SI глиоксалем превращали оксигеназную активность фермента в салицилат-зависимую НАДН-дегидрогеназную, при этом ФАД не являлся акцептором электронов (Suzuki and Onishi, 1990). Оказалось, что такая обработка вызывала модификацию одного из 12 остатков аргинина (Argi67) изучаемого фермента, который, вероятно, не только важен для связывания НАД(Н), но и в результате химической модификации способствовал возникновению конформационньтх изменений в активном сайте фермента, что обеспечивало смену каталитической активности с гидроксилирующей на дегидрогеназную.
Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
А) Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Маниатис и др., 1984) с некоторыми модификациями. Культуры Psendomonas выращивали в 200 мл обогащенной среды Эванса (Evans et al., 1970) при интенсивной аэрации в течение 16 часов при 28С, в качестве источника углерода использовали салицилат в концентрации 1 г/л. Клетки осаждали центрифугированием при 7000 об/мин в течение 5 минут при 4С, суспендировали в 4 мл охлажденного раствора I (10 мМ Трис-С1, рН 8.0, 5 мМ ЭДТА), затем добавляли 8 мл раствора II (0.2н NaOH, 1% SDS).CMecb инкубировали при комнатной температуре до полного лизиса, затем добавляли 6 мл охлажденного раствора III (ЗМ СН3СООК, рН 5.2) и инкубировали 10-20 минут в ледяной бане. Далее смесь центрифугировали 20 минут (13000 об/мин, 4С), ДНК осаждали из супернатанта добавлением 0.6 объема изопропилового спирта в течении 20 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут (13000 об/мин, 20С). Осадок, содержащий ДНК, растворяли в 0.6 мл буфера ТЕ (10 мМ Трис-CI, рН 8.0, 1мМ ЭДТА), добавляли 200 мкл ЮМ LiCl и инкубировали 5-Ю мин на ледяной бане. Центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин в настольной центрифуге 5414С фирмы "Eppendorf" (Германия). ДНК осаждали из супернатанта добавлением равного объема изопропанола. Инкубировали 10 мин при комнатной температуре, центрифугировали 7 минут при 12000 об/мин в настольной центрифуге "Eppendorf. Осадок промывали 80% этанолом, подсушивали и растворяли в 20-100 мкл деионизованной воды. Качество и количество препарата плазмидной ДНК оценивали электрофорезом в 0.8% агарозе в 0.5х Трис-боратном буфере (Маниатис и др., 1984).
Плазмидную ДНК дополнительно обрабатывали РНКазой (раствор 10 мкг/мл добавляли к препарату ДНК до конечной концентрации 0.1-0.2 мкг/мл) и очищали последовательными экстракциями фенол/хлороформом (1:1) и смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). Б) Также плазмидную ДНК выделяли с помощью "Qiagen" Plasmid Purification Midi Kit ("Qiagen"GmbH, Германия) по протоколу фирмы-изготовителя. В) В некоторых случаях визуализацию плазмидной ДНК проводили методом инвертированного электрофореза (FIGE) в 1% агарозном геле по протоколу фирмы - производителя («Bio-Rad», США).
Для приготовления блок-вставок выращивали ночную бактериальную культуру в синтетической среде Эванса с добавлением салицилата в качестве единственного источника углерода и энергии (Alonso R. et al., 2005). Данной культурой инокулировали 5 мл LB и подращивали до OD6oo=0,6-0,8. Центрифугировали 1мл культуры при 13000 об/мин. и ресуспендировали в 300 мкл ТЕ-буфера. К бактериальной суспензии добавляли 300 мкл предварительно охлажденной до 37С 2%-ой легкоплавкой агарозы, тщательно перемешивали. Заливали в ячейки по 40-50 мкл. Инкубировали в 5 мл буфера I (ЮтМ Tris-HCl рН=7,2, lMNaCl, 0,1М EDTA рН=8,0, 0,2% дезоксихолина, 0,5% лаурилсаркозина) с добавлением 1мг/мл лизоцима в течение 16 часов при 37С. Затем отмывали 5 мл буфера II (20mM Tris-HCl pH=8,8, 50мМ EDTA рН=8,0, 1% лаурилсаркозина) с добавлением 0,2мг/мл протеиназы К (около 20-50 мкл) в течение 24 часов при 50С. Промывали 3-4 раза ТЕ по 10 мл в течение 20-30 мин. Добавляли 10мл ТЕ и хранили на +4С.
Ночную культуру клеток доноров и реципиентов наносили на фильтры в соотношении 1:1. Конъюгационный перенос плазмид в реципиентный штамм P.putida КТ2442 осуществляли на мембранных фильтрах («Millipore», США, 0.45 мкм) на агаризованной среде в течение ночи. После 16-18 часов инкубации культуры смывали с фильтров 1 мл среды Эванса, разведения высевали на селективную агаризованную среду Эванса. содержащую канамицин (50мкг/мл) и салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии. Трансконьюганты тестировали на присутствие плазмид и гена gfp. Частоту коньюгационного переноса рассчитывали как отношение числа трансконьюгантов к числу клеток донора.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в циклере Mastercycler Gradient ("Eppendorf , Германия). Реакцию проводили в объеме 25 или 50 мкл в стандартных условиях. Смесь для ПЦР содержала: буфер для фермента (10 мМ Трис-С1 (рН=8.4), 50 мкМ КС1, 0.1 мкг/мкл желатина), 5-Ю нг ДНК-мишени, 18 пМ каждого праймера, дезоксирибонуклеотид-трифосфаты в конечной концентрации 200 мкМ, 1.5 мМ MgCl2 и 1.5-2.5 единицы ДНК полимеразы Taq фирмы "Fermentas" (Литва). Для амплификации гена салицилат гидроксилазы inahG) в смесь в качестве денатурирующего агента добавляли 5% диметилсульфоксид (ДМСО) ("Sigma", США). Нуклеотидная последовательность, температура отжига праймеров и размер ПЦР продуктов сведены в таблице 2.
Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата
Известно, что у штаммов флуоресцирующих псевдомонад гены утилизации салицилата могут иметь как хромосомную локализацию, так и находиться на коньюгативных плазмидах большого размера (Herrick J.B. et.al., 1997).
Для штаммов коллекции лаборатории P. putida BS202, BS3701, BS3790 и АК5 участие плазмид в деградации салицилата было показано ранее.
Установлено, что в штамме BS202 присутствует одна плазмида - NPL-1 (Кошелева и др., 1986; Соколов и др., 1998). Штаммы P. putida BS3701 и BS3790 содержат по две плазмиды: pBS1141, pBS1142 и pBSl 191, pBS1192, соответственно. Плазмиды NPL-1, pBS1141 и pBSl 191 являются конъюгативными, имеют одинаковый размер (100 т.п.н.) и проявляют значительное сходство рестрикционных профилей. Общим для них является наличие функционирующего ш/гУ-оперона и неэкспрессирующегося «классического» nahG гена. Кроме того, показано, что в штаммах BS202, BS3701, и BS3790 присутствует второй функциональный гена салицилат гидроксилазы (nahGl), негомологичный гену nahG (Кошелева и др., 2003). В штаммах P. putida BS202 и BS3701 функциональный ген салицилат гидроксилазы локализован в составе хромосомной ДНК. В штамме P. putida BS3790 функциональный ген салицилат гидроксилазы находится на плазмиде pBSl 192 размером 60 т.п.н.
В данной работе кроме исходных штаммов P. putida BS202, BS3701, и BS3790 были использованы элиминанты данных штаммов BS203, BS3701-E и BS3790-E5, соответственно. Данные элиминанты утратили плазмиды NPL-1, рВS1141 и рВS1191, обладают Nah"Sal+ фенотипом и не содержат гена «классической» салицилат гидроксилазы. Также был использован трансконъюгант P. putida BS394, содержащий плазмиду pBSl 192 с Nah Sal+ фенотипом.
Штамм P. putida АК5 содержит неконъюгативную плазмиду рАК5 размером 135 т.п.н., которая контролирует утилизацию нафталина через гентизат и содержит последовательность гена салицилат 5-гидроксилазы (Измалкова и др., 2005).
Методом инвертированного электрофореза установлено, что у вновь выделенных 12 штаммов P. putida присутствуют плазмиды размером более 180 т.п.н., причем у пяти из них также присутствует вторая плазмида гораздо большего размера, что было подтверждено обработкой блок-вставок эндонуклеазами рестрикции ЕсоШ и Hindlll (Рис. 14). Тем не менее, эксперименты по коньюгационному переносу в реципиентный штамм P. putida КТ2442 на селективной среде с салицилатом не дали положительных результатов. Таким образом, роль данных плазмид в деградации салицилата остается неизвестной.
В настоящее время у микроорганизмов наиболее распостранены два пути деградации салицилата: либо через образование катехола, либо - гентизата, при участии салицилат гидроксилазы или салицилат 5-гидроксилазы, соответственно. Ранее было показано, что штаммы P. putida BS202, BS3701, BS3790 и их Nah Sal+ производные (BS203. BS3701-E и BS3790-E5) деградируют салицилат через катехол по орто-пути. К деградации салицилата по мета-пути способны только исходные штаммы BS3701 и BS3790, в отличие от штамма P. putida BS202, который содержит «молчащий» ген катехол 2,3-диксигеназы. В штамме P. putida АК5 отсутствовали удельные активности салицилат гидроксилазы и катехол 2,3-диоксигеназы, а активность катехол 1,2-диоксигеназы была крайне низка и не зависела от индукции салицилатом. При росте на салицилате в штамме АК5 проявлялась активность гентизат 1,2-диоксигеназы. Это позволило предположить, что P. putida АК5 утилизирует салицилат через гентизат при участии салицилат 5-гидроксилазы (Измалкова, 2005а).
Для определения пути деградации салицилата остальными штаммами-деструкторами проводился анализ удельных активностей ключевых ферментов деградации этого соединения (Табл. 3).
У всех исследуемых штаммов обнаружена активность салицилат гидроксилазы, индуцируемая салицилатом. Причем у всех штаммов, за исключением P. putida NS22 и g24f, уровень активности данного фермента был высоким (Табл. 3). Салицилат гидроксилаза исследуемых штаммов оказалась более эффективна в отношении метилированных производных салицилата, по сравнению с хлорированными производными. Во всех штаммах была также обнаружена активность катехол 1,2-диоксигеназы - фермента орто-иут расщепления катехола (Табл. 3). Активность катехол 2,3-диоксигеназы - ключевого фермента расщепления катехола по мета-пут не выявлялась ни в одном из вновь изолированных штаммов - деструкторов салицилата.
Для изучения генетического контроля деградации салицилата у исследуемых штаммов использовали один из наиболее быстрых, специфичных и чувствительных методов - полимеразиую цепную реакцию (ПЦР). Для ПЦР - анализа были выбраны гены, кодирующие ключевые ферменты деградации салицилата микроорганизмами: салицилат гидроксилазу (nahG), катехол 2,3-диоксигеназу inahH) и катехол 1,2-диоксигеназу (catA). Кроме того, поскольку, как следует из полученных данных, у изучаемых штаммов активности салицилат гидроксилазы и катехол 1,2-диоксигеназы являются индуцируемыми, штаммы проверяли на наличие регуляторного гена nahR.
Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P. putida
Альтернативный путь утилизации салицилата через гентизиновую кислоту при участии салицилат 5-гидроксилазы у флуоресцирующих псевдомонад является менее распространенным, в отличие от хорошо изученного пути деградации салицилата через катехол. На данный момент генетический контроль «гентизатного» пути деградации салицилата детально изучен только у представителей р-протеобактерия {Ralstonia, Polaromonas и Achromobacter). Однако впервые деградация салицилата через гентизат была описана Старовойтовым с соавторами именно у псевдомонад еще в 1975 году на примере деструктора нафталина P. Fluorescens (Старовойтов и др., 1975), тем не менее, его генетическая организация не была исследована. Кластер генов, кодирующих салицилат 5-гидроксилазу, недавно был обнаружен у деструктора 2-хлорбензоата и салицилата P. aeruginosa JB2, однако остальные гены, отвечающие за полный путь утилизации салицилата, не были найдены (Hickey et al., 2001).
В настоящей работе исследована организация генов биодеградации нафталина и салицилата штамма P. putida АК5. Данный штамм способен к росту на нафталине, 2-метилнафталине (2Мег Ґ), салицилате и гентизате в качестве единственных источников углерода и энергии. Шгамм P. putida АК5 содержит неконъюгативную катаболическую плазмиду рАК5 размером 135 т.п.н., которая контролирует утилизацию нафталина через салицилат и гентизиновую кислоту (Измалкова и др., 2005а).
На сегодняшний день генетический контроль деградации нафталина через гентизат детально описан для двух представителей р-протеобактерия: Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2 (Fuenmayor et al., 1998; Jeon et al., 2006). Гены, отвечающие за конверсию нафталина в салицилат, за исключением внедрения генов nagGH, кодирующих две субъединицы салицилат-5-гидроксилазы, в кластер генов, кодирующих нафталин 1,2-диоксигеназу, гомологичны по структуре и порядку расположения псевдомонадным генам «классического» nahl-оперона, который контролирует "верхний" путь утилизации нафталина до салицилата. В отличие от ш/г/-оперона, эти гены транскрибируются совместно со следующими далее генами, отвечающими за дальнейший катаболизм гентизата до фумарата и пирувата, как единый оперон (Zhou et al.. 2001; Zhou et al., 2002). Также как и в случае nahl- и ш/г2-оперонов, nag-onepou находится под позитивным контролем регуляторного гена nahR. Однако его расположение отличается от наблюдаемого в системе nahl-nahl. Тем не менее, сходство в организации nah- и flag-onepoHOB привело к предположению о происхождении nah- и «og-генов от общей «ag-подобной последовательности - предшественника (Zhou et al., 2002).
Исследованная в настоящей работе организация генов деградации нафталина и салицилата в штамме P. putida АК5 отличается как от организации «классических» катаболических оперонов плазмид NAH7 и pDTGl, так и от nag-генов штаммов Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2. Обнаружено, что за деградацию нафталина до салицилата в штамме АК5 отвечает «классический» nahl -оперон под контролем регуляторного гена nahR, подобный шМ-оперонам плазмид катаболизма нафталина pDTGl, pND6-l и рЬРба. В отличие от вышеназванных плазмид, в штамме АК5 отсутствует ш/г2-оперон, отвечающий за деградацию салицилата через катехол до интермедиатов цикла Кребса. Данный оперон либо был утерян плазмидой рАК5, либо не приобретался вовсе. Гены катаболизма салицилата, в отличие от штаммов U2 и CJ2, локализованы отдельно от генов «верхнего» пути деградации нафталина и имеют оперонную структуру. Исследованный в данной работе оперон деградации салицилата, названный sgp-опєрон (salicylatc-gentisate pathway), включает 6 структурных генов, sgpAIKGHB, кодирующих четыре субъединицы салицилат 5-гидроксилазы (SgpAGHB), гентизат 1,2-диоксигеназу (Sgpl) и фумарилацетоацетат гидролазу (SgpK). Данный оперон предположительно находится под позитивным контролем регуляторного гена sgpR, который располагается выше гена редуктазы и ориентирован от него в противоположном направлении. Таким образом, в данной работе показано, что утилизация нафталина через салицилат и гентизат в штамме P.ptitida АК5 осуществляется при участии 2-х катаболических оперонов, каждый из которых регулируется своим собственным регулятором. P. putida АК5 является первым природным штаммом, в котором было обнаружено сочетание оперона деградации салицилата через гентизат с «классическим» nah\ - опероном.
Структурная организация sgp-onepona несколько напоминает организацию оперонов деградации салицилата морской бактерии Marinomonas sp. MWYL1 и штаммов-патогенов растений с широким кругом хозяев, в частности Ralstonia solanacearum GMI1000 (Рис.32). Основным отличием sgp-оперона является инсерция генов гентизат 1,2-диоксигеназы (sgpl) и фумарилацетоацетат гидролазы (sgpK) в кластер sgpAGHB, после гена sgpA, кодирующего редуктазный компонент салицилат 5-гидроксилазы. Подобным образом организован кластер генов деградации салицилата в штамме Polaromonas sp. JS666 (Mattes et al., 2008) (Рис.32). Различия между sgpl и sgpK генами и другими областями р-оперона, которые были обнаружены в G+C составе и при анализе филогенетического родства отдельных полипептидов с соответствующими гомологами, позволили предположить, что гены гентизат 1,2-диоксигеназы и фумарилацетоацетат гидролазы могли эволюционировать отдельно от остальных последовательностей .sgp-оперона и приобретены штаммом - хозяином независимо от них.
Инсерция генов sgpl и sgpK в кластер салицилат 5-гидроксилазы напоминает ситуацию, наблюдаемую в штаммах Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2. В данных штаммах гены nagGH, кодирующих субъединицы Салицилат 5-гидроксилазы, встроились в кластер генов нафталин 1,2-диоксигеназы, также после ее редуктазного компонента (Рис.32).
Похожие диссертации на Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад
