Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 5
1. Общая характеристика структурных и функциональных свойств ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. colt 6
2. Особенности нуклеотидной последовательности промотора 9
3. Образование транскрипционных комплексов РНК-полимеразы с промотором 16
4. Структурные и функциональные свойства а-субъединицы РНК-полимеразы 21
5. Топология мест связывания а-субьединиц с промоторной ДНК 23
6. Участие а в формировании тройных комплексов с белками-активаторами. 24
7. Общая характеристика структуры комплекса а-субъединицы с промоторной ДНК 25
8. Взаимодействие свободной а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli с ДНК 30
а-субъединица РНК-полимеразы как потенциальный модулятор транскрипции (заключение и постановка задачи) 32
Глава 2 Материалы и методы 3 5
Глава 3 Результаты и их обсуждение 42
1. Свободная а-субъединица РНК-полимеразы может взаимодействовать с промотором T7D и влиять на его матричные свойства. 42
2. Комплексообразование свободной а-субъединицы с ДНК зависит от нуклеотидной последовательности в области контакта . 46
3. Избыток в клетках Е. coli а-субъединицы, способной взаимодействовать с ДНК, влияет на экспрессию многих генов. 83
4. Свободные димеры а-субъединицы влияют на активность промоторов/es ufepA-F2 in vitro. 64
Заключение 76
Выводы 78
Список Используемой Литературы 79
Благодарность 88
- Особенности нуклеотидной последовательности промотора
- Структурные и функциональные свойства а-субъединицы РНК-полимеразы
- Комплексообразование свободной а-субъединицы с ДНК зависит от нуклеотидной последовательности в области контакта
- Избыток в клетках Е. coli а-субъединицы, способной взаимодействовать с ДНК, влияет на экспрессию многих генов.
Введение к работе
У Е.соН известно множество различных по своей природе механизмов, адаптирующих экспрессию генома к изменяющимся условиям среды. Тем не менее, детальное изучение способов регуляции индивидуальных генов все еще продолжает вскрывать принципиально новые механизмы. Так, например, относительно недавно была обнаружена пост-транскрипционная регуляция экспрессии с помощью антисмысловых РНК. Интерес к механизмам, осуществляющим регуляцию транскрипции, обоснован тем, что именно транскрипция является первым этапом в реализации генетической информации. В настоящее время накоплен фактический материал, описывающий структурно-функциональные особенности промоторов и РНК-полимеразы, а регуляцию транскрипции принято подразделять на несколько уровней. Одним из важнейших факторов, определяющих эффективность транскрипции конкретного гена, является РНК-полимераза нужного полипептидного состава. В условиях вегетативного роста наиболее представлен фермент, содержащий белковый продукт гена rpoD- а°. Такая полимераза способна взаимодействовать с большинством бактериальных промоторов и транскрибировать почти все гены. Кроме нее, у Е. coli известны еще шесть о-субъединиц: os, а?, оЕ, 0е, о и aFecI. Они заменяют о° в комплексе с кор-ферментом и узнают характерные для них последовательности оснований. Альтернативные о нужны клетке на определенных этапах развития (as) и в условиях различных стрессов (0Е, он И as), но и во время нормального роста содержащие их полимеразы транскрибируют ряд оперонов. Относительное содержание разных а определяется эффективностью транскрипции соответствующих генов, стабильностью мРНК и белка и присутствием анти-а-факторов. Гены, высокий уровень экспрессии которых необходим при разных условиях, обычно содержат промоторы нескольких типов.
Помимо альтернативных о, на эффективность транскрипции индивидуальных генов влияют специальные регуляторные белки, которые связываются с РНК-полимеразой и/или со специальными нуклеотидными последовательностями в промоторах. Таких белков у Е. coli более 200, а набор используемых ими молекулярных механизмов чрезвычайно разнообразен. Он включает простую конкуренцию с полимеразой или другими регуляторными белками за места специфического контакта; стабилизацию образованных комплексов; модификацию структурно-конформационного состояния промотора и др. Уровень синтеза специфических регуляторов транскрипции без индукции обычно низок. При необходимости он возрастает в сотни раз, а размеры контролируемых регулонов варьируют от одного до сотен генов. Причем в их состав могут входить промоторы разных а. Один и тот же регуляторный белок может активировать синтез РНК с одних промоторов и ингибировать с других, взаимодействуя с а-, а-, 0- или Р -субъединицами РНК-полимеразы или вообще с ними не взаимодействуя.
Продуктивность транскрипции зависит от множества различных по своей природе небелковых соединений (ppGpp, TPHKFmet), от солевого состава цитоплазмы, суперскрученности ДНК, а также от 10-20 ДНК-связывающих белков, упаковывающих ее в относительно компактный нуклеоид. Часть из них обладает специфичностью к определенным последовательностям оснований, другие - к структурным особенностям двойной спирали, а некоторые взаимодействуют с ДНК только неспецифически. Изменяя конформационное состояние ДНК, белки нуклеоида влияют на все ее функциональные свойства. Это влияние может как активировать, так и ингибировать транскрипцию. Белки нуклеоида содержатся в клетке в больших количествах и необходимы для адекватной экспрессии многих генов.
Очевидно, что эффективность регуляторного воздействия зависит от прочности полимераза-промоторного комплекса. Кроме ст-субъединиц, взаимодействующих с консервативными элементами промоторов, эта прочность зависит от ДНК-белковых контактов, формируемых двумя ос-субъединицами РНК-полимеразы. Эти субъединицы способны в свободном состоянии избирательно связываться с ДНК, олигомеризоваться и взаимодействовать с регуляторами транскрипции. Мы обратили внимание на эти свойства а-субъединицы и высказали предположение о том, что свободная а сама по себе может влиять на транскрипцию таких генов, которые в своих промоторах имеют мишени для взаимодействия с этими субъединицами. От специфических регуляторов транскрипции а в таком случае будет отличать высокий уровень экспрессии в клетке. От регулирующих транскрипцию структурных белков нуклеоида - специфичность к функциональным участкам промоторов. Настоящая работа посвящена проверке этого предположения.
Актуальность предпринятого нами исследования обусловлена ключевой ролью транскрипции в регуляции клеточного метаболизма и фундаментальной значимостью принципов ДНК-белкового взаимодействия для эффективного управления процессами транскрипции. Полноценное понимание целостной картины невозможно без всестороннего учета всех потенциально значимых регулирующих транскрипцию факторов, одним из которых, как оказалось, является а-субъединицы РНК-полимеразы.
Особенности нуклеотидной последовательности промотора
Промотором является участок ДНК, специфически узнаваемый РНК-полимеразой при инициации транскрипции, и представляющий собой сигнальную последовательность нуклеотидов, расположенную перед кодирующей частью генов на расстоянии от 0 (некоторые гены нетранслируемых РНК) до нескольких сотен оснований. В этой области располагается ряд регуляторных последовательностей, взаимодействующих с а- и а-субъединицами РНК-полимеразы, а также с факторами регуляции белковой природы.
В настоящее время общепризнанным является представление о промоторе как о модульном образовании, в котором каждый элемент распознается отдельным доменом РНК-полимеразы либо фактором регуляции. Наиболее изученными структурными элементами промотора являются консервативные гексануклеотиды, в той или иной степени присутствующие во всех промоторах [Harley & Reynolds, 1987]. Речь идет о так называемых элементах -10 и -35. Первый из них чаще всего располагается на расстоянии 12 нуклеотидов против хода транскрипции от точки старта и представляет собой последовательность, гомологичную ТАТААТ. Второй чаще всего расположен на расстоянии тридцати пяти нуклеотидов от точки старта и гомологичен последовательности TTGACA. Положение элементов, гомологичных консервативным мотивам в промоторах, не является строго заданным и варьирует в широких пределах. Так, расстояние между стартовой точкой транскрипции и элементом -10 измеряется от 4 до 11 нуклеотидных пар (н.п.), а расстояние между двумя консервативными элементами (спейсер) может быть от 15 до 21 н.п. Соответственно, расположение 5-конца элемента -10 в разных промоторах может варьировать в пределах полувитка двойной спирали ДНК (от положения -17 до положения —10), а расположение 5-конца элемента -35 можно ожидать в диапазоне от -44 до -31. Как уже указывалось выше, с консервативными элементами взаимодействуют структурные домены 2.4 и 4.2 а-субъединицы [Dombroski et.al., 1992, 1996, 1997; Murakami et.al., 2002], промежуточные структурные модули которой должны, следовательно, обеспечивать наблюдаемую (до 1 витка спирали) степень позиционной вариабельности в продольном направлении. Кроме этого, во взаимодействии с промотором может быть задействован еще один структурный домен а-субъединицы - 2.5. Он распознает динуклеотид TG, фланкирующий элемент -10 на 5 -конце и присутствующий у —15% промоторов. Любопытно, что данные рентгеноструктурного анализа комплексов РНК-полимеразы с синтетической промоторной ДНК [Murakami et al., 2002], подтверждая взаимодействие обоих доменов а70 с ДНК, свидетельствуют о смещении взаимодействующего с элементом -35 структурного домена а70 вдоль оси ДНК на 6А в более удаленную от стартовой точки транскрипции область по сравнению с его расположением в свободном ферменте. Так как функциональная значимость элемента TTGACA, подтвержденная множеством генетических и биохимических данных, не вызывает никакого сомнение, а в использованной конструкции длина спейсера между консервативными элементами была оптимальной (17 н.п.), факт только частичного взаимодействия элемента -35 с с-субъединицей, в принципе, свидетельствует и о конформационной подвижности структурных модулей а-субъединицы, разделяющих домены 2.4. и 4.2., указывая на возможность эффективного взаимодействия домена 4.2. с участками ДНК, расположенными рядом с TTGACA в структуре модельной матрицы.
Области ДНК, расположенные по ходу синтеза РНК за точкой старта транскрипции, принято назьшать "нижележащими" (downstream region), а последовательности, расположенные выше элемента -35 против хода транскрипции от стартовой точки, обозначаются как "вышележащие" (upstream region).
Долгое время считалось, что наличие консервативных элементов является необходимым и достаточным условием для распознавания промотора РНК-полимеразой. Однако, по мере накопления данных о промоторных последовательностях разных генов, обнаруживалась значительная вариабельность их первичной структуры даже в области консервативных элементов. Так, среднестатистический промотор содержит только 7 или 8 консервативных пар из 12. Такая степень соответствия идеальному промотору очень часто встречается и в кодирующих участках генов и, следовательно, непонятно, почему РНК-полимераза не использует их для инициации транскрипции. На основании этих и ряда других данных было сделано предположение о наличии дополнительных элементов, дискриминирующих промоторную ДНК от других последовательностей [Ozoline, 1995; Ozoline, 1997]. Было установлено, что приближение последовательности промоторов к консенсусной, как правило, приводит к увеличению их активности, а удаление, наоборот, к уменьшению. В некоторых случаях, однако, была обнаружена прямо противоположная зависимость. Так, например, мутация, увеличивающая степень соответствия промотора XPL идеальному, приводила к уменьшению его силы [Knaus & Bujard, 1988], а замена консервативного G в элементе -35 у промоторов araBAD и lacUVS на А увеличивает эффективность их транскрипции. Это, тем не менее, не противоречит представлению о функциональной важности каждой из консервативных пар, так как увеличение степени соответствия консенсусу может приводить к чрезмерной стабилизации транскрипционного комплекса, затрудняя переход РНК-полимеразы к продуктивной элонгации и, таким образом, к ингибированию промотора, а уменьшение этого соответствия для сильных промоторов, наоборот, может приводить к активации транскрипции.
В 1993 году впервые было установлено, что в непосредственный контакт с промоторной ДНК в "upstream" области может вступать а-субъединица РНК- полимеразы [Ross et al., 1993]. Взаимодействующие с этой субъединицей структурные модули (далее UP элемент) были впервые описаны для промотора rrnBPl, контролирующего синтез рибосомных РНК [Estrem et al., 1998; Estrem et al., 1999]. В этом случае UP элемент охватывает последовательности от положения -40 до -60 и характеризуется наличием большого числа А/Т-пар. Было установлено, что с UP элементом рибосомного промотора взаимодействует С-концевой домен сс-субъединицы (далее aCTD) [Ross et al., 1993; Jeon, et.al., 1995], который узнает в ДНК зауженную, из-за присутствия гомонуклеотидного А/Т-трека, малую бороздку двойной спирали.
Структурные и функциональные свойства а-субъединицы РНК-полимеразы
NTD образован аминокислотными остатками с 20 по 235 ( 28 kD) и является компактным глобулярным доменом. Он играет ключевую роль в сборке коровой части фермента, так как несет на себе сайты для димеризации двух а-субъединиц, и участки связывания р- и р -субъединиц РНК-полимеразы [Igarashi, Fujita & Ishihama, 1991; Hayward et al., 1991]. Исследование способности к образованию функционально активного фермента для ряда мутантных форм а-субъединицы, несущих точечные вставки или делеции, позволило определить аминокислотные остатки, необходимые для ее димеризации и последующего взаимодействия с Р и Р [Kimura & Ishihama, 1995]. В процессе димеризации а-субъединиц принимают участие Arg44, Glu76 и Vail 73. Их замены на аланин существенно уменьшали эффективность взаимодействия 2-х субъединиц. Кроме этого, образование нестабильных димеров отмечалось у мутантов с заменами Thr3 8Ala, Asp 174Ala, Pro 179Ala, Asp 199Ala, Leu201Ala и Pro213Ala. Таким образом, в процессе димеризации а-субъединиц принимают участие несколько различных сайтов на поверхности белковой глобулы. Наиболее важной для образования димеров считается обширная часть белка между Vail73 и Рго213. Только часть из этих аминокислотных остатков экспонируют свои боковые группы на поверхность белковой глобулы и, следовательно, для димеризации а-субъединиц важна не только целостность контактирующих модулей, но и адекватность их взаимной пространственной ориентации.
Использование гидроксил-радикального протеолиза (белковый футпринтинг) показало, что взаимодействие с р-субъединицей защищает аимнокислотные остатки от 30 до 75, а взаимодействие с Р - от 175 до 210 [Heyduk et al., 1996]. Место контакта с р-субъединицей, по-видимому, формируется несколькими аминокислотными остатками вблизи Arg45-Leu48, но прочность взаимодействия зависит и от Glu80, Ключевую роль играет аминокислотный остаток Arg45, замена которого на аланин останавливает процесс комплексообразования с р-субъединицей. Замена Leu48Ala только замедляет его. Таким образом, сайты связывания р-субъединицы преимущественно располагаются на N-конце NTD. Glu80 участвует и в комплексообразовании с Р -субъединицей, но роль этого участка белковой поверхности во взаимодействии с двумя большими субъединицами отличается, так как мутантная форма а-субъединицы Lys86Ala способна образовывать стабильный димер и комплекс с Р-субъединицей, но не способна связывать Р -субъединицу. Кроме этого, в контакте с р принимают участие аминокислотные остатки между Vail73 и Пе200, а замена Vail73 Ala влияет только на процесс присоединения р\ Т.е. поверхность контакта с р образована двумя пространственно отдельными участками, один из которых частично перекрывается с областью связывания р-субъединицы, а второй формируется аминокислотными остатками 173-200, примыкающими к С-концевому домену а-субъединицы.
Помимо сайтов димеризации и связывания Р- и Р -субъединиц, на NTD также расположен сайт связывания по крайней мере с одним регулятором транскрипции: cAMP-CRP [Niu et al., 1996]. В этом взаимодействии участвуют аминокислотные остатки 162-165, распознающие так называемый AR2 (acnivanion region 2) CRP. Более подробно особенности взаимодействия а-субъединицы с этим белком будут рассмотрены ниже. С-концевой домен а-субъединицы РНК-полимеразы образован аминокислотными остатками с 257 по 329 [Igarashi, 1991] ( 8Ю) и ответственен за взаимодействие с UP-элементами промоторов и большинством белковых регуляторов транскрипции класса І. В настоящее время накоплен обширный фактический материал, позволяющий судить о структуре этого домена и о его модулях, принимающих участие в активации транскрипции благодаря взаимодействию с UP-элементом промоторов (лучше всего изучен процесс взаимодействия с промотороми irnBVl, lacUVS м T7D) и рядом белковых факторов (лучше всего изучен белок-активатор катаболитных генов, CRP).
По современным представлениям aCTD РНК-полимеразы образован четырьмя a-спиральными модулями, соединенными друг с другом неструктурированными линкерами. Альфа-спиральные участки образованы аминокислотными остатками: a-спираль I - 263-272; а-спираль II - 278-283, а-спираль Ш - 286-292 и а-спираль IV - 297-309 [Jeon et аі. 1995]. По своей структурной организации С-концевой домен a-субъединицы лучше всего описывается формулой (HhH)2, то есть, представляет из себя удвоенный мотив двух антипараллельных а-спиралей, соединенных короткой шпилькой (HhH) [Shao & Grishin, 2000]. Первый HhH формируется плохо структурированным участком аминокислотной цепи, прилегающей к N-концу альфа-спирали I и самой альфа-спиралью I, второй HhH хорошо выражен и формируется альфа-спиралями Ш и IV и находящимся между ними линкером. Два мотива (HhH) соединены между собой альфа-спиралью П. Анализ белковых последовательностей, имеющихся в современных банках данных [Shao & Grishin, 2000], позволяет предполагать наличие подобных мотивов в структуре ряда других ДНК-связывающих белков, наиболее изученными из которых являются человеческий фактор транскрипции BAF и ДНК-полимераза р, вьщеленная из нескольких организмов. Ниже более подробно будут рассмотрены данные, позволяющие судить о локализации сайтов взаимодействия с UP-элементами промоторов и белками-активаторами.
Комплексообразование свободной а-субъединицы с ДНК зависит от нуклеотидной последовательности в области контакта
Как уже указывалось в Обзоре литературных данных, последовательности промоторов в области контакта с а ранее были исследованы методом кластерного анализа. Это позволило выявить несколько доминирующих в этих местах мотивов, в число которых, в частности, входит СТТТА [Озолинь и Деев, 1998], причем участок его преимущественного присутствия (-50/-46) практически совпадает с расположением одного из повторяющихся элементов в промоторе T7D. Кроме этого в участках -90/-78 и -77/-65 находятся два идеальных повтора с последовательностью GTCTTTAGGTCTG. Повторяющиеся элементы CTTTA-G расположены симметрично относительно элемента -35 и регулярно распределены вдоль промоторной ДНК (период 13 нуклеотидных пар). Наличие таких элементов может быть причиной формирования сдвинутых петельных структур (slipped-loop structures), затрагивающих соседние участки. Поэтому нельзя было исключить, что именно они создают структурную основу для взаимодействия с а-субъединицами фермента. Для того, чтобы проверить такую возможность, было проведено две серии экспериментов. Прежде всего была определена матричная активность нескольких укороченных в области UP-элемента промоторов (Рис. 3). Эксперимент проводили в условиях конкуренции с контрольным промотором lacUVS, а эффективность синтеза T7D-PHK определяли по отношению РНК-продуктов, синтезированных с этих двух промоторов в условиях однократной инициации транскрипции (Рис. 4). Из UP-элемента первой конструкции (T7D) были удалены все мотивы СТТТА, но размер контактирующей области с учетом размера ДНКазы и асимметрии в расположении ее активного цента был сохранен. Это привело к значительному уменьшению активности промотора. Восстановление первого мотива СТТТА (конструкция R1) практически не отразилось на относительной активности промотора. Удлинение UP-элемента до верхней границы соседнего мотива (конструкция R2), но без введения его в структуру промотора, увеличило конкурентноспособность этой матрицы за РНК-полимеразу, но не до исходного значения.
Практически полностью восстановленная активность промотора наблюдалась только для конструкции R3, содержащей СТТТА в участке -62/-58. Дальнейшее удлинение фрагмента было мало существенным. Это значит, что контактирующий по нематричной нити с ферментом участок промотора, расположенный в области -61/-59, важен для формирования транскрипционного комплекса. Во второй серии экспериментов была использована гибридная матрица DR, состоящая из коровой части промотора rrnBPl (от положения -36 и далее в транскрибируемую часть гена) и UP-элемента промотора T7Z) (от позиции -77 до позиции -37). Этот участок T7Z) содержит два коротких повтора, начинающихся в позициях -62 и -49 и один длинный повтор (-77/-65). Отсутствие остальных повторов снижало вероятность формирования вторичных структур. Матричная активность DR составила 90±10% от активности rrnBPl, т.е. UP-элементы T7Z) и rrnBPl вполне взаимозаменяемы. На Рис. 5 показан результат ДНКазного тестирования структуры промотора DR и его комплексов с белками. В области UP-элемента профили гидролиза DR и T7D оказались одинаковыми (сравн. Рис. 5А и Рис. 1В). Для комплексов с белками в области контакта интегрированных в структуру фермента а-субъединиц а также не наблюдалось существенных отличий от нативного промотора. В комплексе со свободными димерами несколько более защищенными, чем в T7Z) оказались связи вблизи позиции -60, что, вероятно, объяснятся нарушенной структурой ДНК на конце фрагмента. В области контакта двух интегрированных в фермент а топология взаимодействия от T7D не отличается. Это значит, что топология формируемых контактов не зависит от генетического окружения узнаваемых модулей и, следовательно, причину избирательного связывания ( с UP-элементом T7D следует искать в нуклеотидной последовательности контактирующих участков, а не в особенностях его структурной организации фрагмента. В промоторе ггпВРХ, как известно из литературных данных, для взаимодействия с а важны протяженные А/Т-треки. На Рис. 6. показан результат тестирования контактов, формируемых РНК-полимеразой и аг с ггпБ?\. В соответствии с опубликованными другими авторами данными (см. Обзор литературы), в контакт с а-субъединицей вступает обширная область промотора, но степень защиты каждой конкретной связи невелика. Обычно это объясняется тем, что при взаимодействии с ггпБР\ свободные димеры а с одинаковой или приблизительно одинаковой вероятностью могут присоединиться к разным участкам промотора. Нуклеотидная последовательность rrnBVX на участке —50/- 45 похожа на контекст участка -49/-44 в Т7Д но имеет ТТТТ-трек, достаточный для формирования зауженной малой бороздки ДНК, и не содержит C/G-пары. Фосфодиэфирная связь между Т.50 и Т.49 в треке наименее защищена о . Это дало возможность сравнить влияние C/G-пары на топологию контактов этого участка с белками. Поэтому на основе ггпВ?\ была сделана матрица RC с заменой Т на С в позиции -50. Это создавало мотив СТТТА на участке от -50 да -46 и сокращало длину Т-трека (Рис. 6).
Избыток в клетках Е. coli а-субъединицы, способной взаимодействовать с ДНК, влияет на экспрессию многих генов.
Видно (Рис. 14), что у промоторов,/ёрЛР2 и fes почти полностью перекрываются элементы -10, а элемент -10 fepAPl частично перекрывается с элементом -35 fepAPl. Подобная организация регуляторных участков довольно часто встречается в геноме и обычно предполагает конкуренцию промоторов за фермент. Однако в случае этих промоторов в литературе обсуждался вопрос о возможности их независимого и одновременного функционирования fEscolar et al., 1998], хотя фактических данных для такой точки зрения пока недостаточно. Все три промотора инициируют транскрипцию не с одной, а 2-х или 3-х стартовых точек. Расстояние между основными точками старта fepAVl и fes составляет 17 н.п.
Сайт связывания Fur в той или иной степени охватывает участки, принадлежащие всем трем промоторам (Рис. 14). Он расположен практически инвариантно относительно стартовых точек fes и fepAPl (-33/-14 и -34/-15, соответственно). Относительно промотора fepAPl он находится в позициях -5/+14. Указанная ранее замена G на А в последней позиции сайта связывания Fur ( -15 относительно fepAPl или -33 относительно fes) не влияет на его способность взаимодействовать с регуляторным белком, но практически полностью исключает регуляцию транскрипции fepA и fes репрессором. Было установлено, что взаимодействие Fur с нативным промотором препятствует формированию полимераза-промоторного комплекса, но после образования этих комплексов Fur не может вытеснить РНК-полимеразу с ДНК [Escolar et al., 1998]. Несмотря на то, что Fur является ингибитором, как для fes, так и для обоих промоторов fepA, мутации в его операторном участке по-разному влияли на регуляцию этих промоторов, указывая на различия молекулярного механизма ингибиторного воздействия. Никаких сведений о существовании позитивного регулятора для гена fepA в литературе обнаружено не было. На первом этапе работы была исследована способность этих промоторов формировать приемлемые для исследования комплексы с РНК-полимерзой. Для этого был использован фрагмент ДНК (294 н.п.), содержащий все три промотора. Он эффективно связывался с РНК-полимеразой (Рис. 15), причем большая часть ДНК взаимодействовала с ферментом уже при двукратном избытке белка.
Для оценки регуляторного потенциала a in vitro было необходимо установить ее способность связываться с матрицей, несущей дивергентные промоторы fes и fepA, оценить специфичность этого взаимодействия и определить влияние свободной а на транскрипционную активность присутствующих на матрице промоторов. Использованная матрица содержала три промотора, поэтому характер связывания фермента с каждым из них и влияние на это взаимодействие аг установить было невозможно. Поэтому было изготовлено две укороченных матрицы, одна из которых содержала промотор гена fepAP2 (fepAu), а другая полноценный промотор fes и редуцированный промотор fepAVl (fesu)- Фрагмент ДНК, несущий промотор /ерА2г имел 222 н.п, (-203/+22) и содержал элементы -35 и -10 промотора fes. Чтобы исключить возможность комплексообразования фермента с промотором fes, в его элемент -35 было введено 2 замены (Рис.14). Фрагмент ДНК, содержащий промотор /es; имел 191 н.п (-159/+22) и содержал элементы -35 и -10 промотора fepAP2. Чтобы исключить возможность комплексообразования фермента с промотором fepAP2, в его элемент -35 было также введено 2 замены (Рис.14). Одновременно это увеличивало число G/C-nap в UP-элементе fepAPl, а укорочение матрицы приводило к удалению наиболее протяженного ТТТТТ-трека в UP-элементе этого промотора. Так как активность этого промотора зависит от взаимодействия с a [Hunt et al., 1994], мы надеялись, что удаление наиболее вероятной мишени для связывания этой субъединицы инактивирует и этот промотор. Была исследована способность этих матриц взаимодействовать с РНК-полимеразой, со свободной а, а также изучено влияние свободной а на комплексообразование фермента с ДНК.
На Рис.16 представлены результаты тестирования ДНК-белковых комплексов с фрагментом fepM- Видно, что с ним взаимодействуют не только РНК-полимераза, но и свободные димеры а. Популяция полимераза-промоторных комплексов не гомогенна, наблюдается, по крайней мере, две полосы. Так как использованная конструкция не содержит промотора fepAPl, а связывание с fes в результате сделанных замен не должно иметь места (см. ниже), наблюдаемая картина, скорее всего, отражает разные стадии комплексообразования фермента с промотором fepAP2, которые наблюдается для многих промоторов (см. например Straney, Crothers для промотора lacUVS).
Присутствие а влияет на равновесие между этими комплексами, уменьшая долю комплекса, имеющего меньшую подвижность в геле. Этот эффект наблюдается независимо от того, добавлена ли она до взаимодействия промотора с ферментом или после образования транскрипционного комплекса. Кроме этого на границе геля наблюдается фракция агрегатов. В присутствии а их количество увеличивается, но часть полимераза-промоторных комплексов сохраняет прежнюю подвижность в геле, причем доля этих комплексов выше в том случае, когда а была добавлена после фермента. Эта разница свидетельствует о конкурентном связывании РНК-полимеразы и а. Так же, как и в случае с промотором Т7Д при последовательном добавлении свободной а и РНК-полимеразы, вся ДНК вступает в комплексы с белками, но при добавлении а к уже образованному комплексу с ферментом небольшая часть ДНК остается свободной.
Результаты аналогичного тестирования матрицы fesu представлены на рисунке 17. Формирование ДНК-белковых комплексов с этим промотором существенно отличалось от предыдущего. Так, свободные димеры а образуют 2 типа комплексов с этим фрагментом ДНК. Это может означать, что на/езм имеется несколько независимых мест связывания димеров аг , или взаимодействие одного димера с предпочтительным сайтом приводит к олигомеризации а-субъединиц, причем, судя по подвижности в геле и компактности полосы, размер олигомеров строго фиксирован и содержит 8-Ю мономеров а. Еще одним объяснением может быть конформационный переход в ДНК. Так, образование значительного изгиба, которое наблюдается во многих ДНК-белковых комплексах, может привести к сильному снижению электрофоретической подвижности. Важно, однако, что оба типа комплексов мигрируют в геле как гомогенные препараты, что указывает на локализованность контактов, формируемых с а-субъединицами.
