Содержание к диссертации
1.ВВЕДЕНИЕ. 1
2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. З
2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНСУЛЯТОРОВ 3
2.2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНСУЛЯТОРОВ 4
2.2.1.8и(Н\у)-ИНСУЛЯТОР. 5
2.2.2. ИНСУЛЯТОРЫ ЛОКУСА ТЕПЛОВОГО ШОКА hsp70-scs 10
2.2.3. ИНСУЛЯТОРЫ РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ Abd-B ГЕНА 12
2.2.4. КУРИНЫЙ Р-ГЛОБИНОВЫЙ ИНСУЛЯТОР. 15
2.3. МОДЕЛИ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛЯТОРОВ: 17
2.3.1.СТРУКТУРНЫЕ МОДЕЛИ. 18
2.3.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ МОДЕЛИ. 20
З.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
3.1. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 23
3.1.1. ЛИНИИ И МУТАЦИИDrosophila melanogaster, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ДАННОЙ РАБОТЕ 23
3.1.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СКРЕЩИВАНИЯ 24
3.1.3. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНОВ Drosophila melanogaster И ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ. 26
3.1.4.ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ yellow И miniwhite В ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЯХ. 27
3.2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. 27
3.2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ДРОЗОФИЛЫ. 27
3.2.2 САУЗЕРН-БЛОТ АНАЛИЗ. 28
3.2.3. МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР). 29
3.2.4. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД И ПЦР ПРОДУКТОВ. 30
3.2.5. МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ. 30
3.2.6. ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЛАЗМИДАМИ.
3.2.7. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ПЛАЗМИД МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ЛИЗИСА. 30
3.2.8. СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИЙ. 31
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ АНАЛИЗА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ БЕЛКАМИ ИНСУЛЯТОРОВ. 36
4.2. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ БЕЛКАМИ. Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА И САЙТАМИ СВЯЗЫВАНИЯ ДЛЯ GAF БЕЛКА. 39
4.3. САЙТЫ СВЯЗЫВАНИЯ ДЛЯ БЕЛКА GAF ЧАСТИЧНО НЕЙТРАЛИЗУЮТ БЛОКИРОВАНИЕ ГЛАЗНОГО ЭНХАНСЕРА Su(Hw) ИНСУЛЯТОРОМ. 44
4.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ БЕЛКАМИ GAF И Mod(mdg4) ПРИВОДИТ К НЕЙТРАЛИЗАЦИИ Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА В КОНСТРУКЦИИ Eye(G8)Y(S)W. 46
4.5. G8 ФРАГМЕНТ ЧАСТИЧНО НЕЙТРАЛИЗУЕТ ИНСУЛЯЦИЮ ЭНХАНСЕРОВ ГЕНА yellow Su(Hw) ИНСУЛЯТОРОМ. 48
4.6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ БЕЛКАМИ GAF И Mod(mdg4) НЕ ВЛИЯЕТ НА НЕЙТРАЛИЗАЦИЮ АКТИВНОСТИ Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА G8 ФРАГМЕНТОМ
В КОНСТРУКЦИИ Ey(G8)(S)YW. 51
4.7. G8 ФРАГМЕНТ УСИЛИВАЕТ РЕПРЕССИЮ ГЕНА yellow Su(Hw) ИНСУЛЯТОРОМ В ПРИСУТСТВИИ ГОМОЗИГОТНОЙ МУТАЦИИ Mod(mdg4)ul. 53
4.8. РОЛЬ G8 ФРАГМЕНТА В ВОССТАНОВЛЕНИИ ЧАСТИЧНО ИНАКТИВИРОВ АННОГО ПРОМОТОРА ГЕНА yellow 56
4.9. МУЛЬТИПЛИКАЦИЯ Zeste САЙТОВ НЕ СОЗДАЕТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ИНСУЛЯТОРА.. 58
5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ: 63
5.1. РОЛЬ GAF БЕЛКА В ИНСУЛЯЦИИ 63
5.2. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА G8 ФРАГМЕНТОВ МОЖЕТ ПРОИСХОДИТЬ ПО НЕСКОЛЬКИМ МЕХАНИЗМАМ. 65
5.3. РОЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ МУЛЬТИМЕРНЫМИ БЕЛКОВЫМИ КОМПЛЕКСАМИ В ИНСУЛЯЦИИ НА ПРИМЕРЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ Zeste САЙТАМИ.
5.4. АНАЛИЗ СУЩЕСТВУЮЩИХ МОДЕЛЕЙ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛЯТОРОВ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. 67
6. ВЫВОДЫ 69
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и элементов их регуляции, таких как энхансеры и сайленсеры. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации и, находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Dorsett 1999). Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию целого ряда генов. Так как в геноме гены часто располагаются достаточно близко друг к другу, существуют механизмы, обеспечивающие взаимодействие энхансера с промотором только своего гена и предотвращающие активацию других промоторов. В предотвращении взаимодействий между нежелательными энхансерами и промоторами важную роль могут играть инсуляторные элементы.
Инсуляторы - это цис-регуляторные элементы, которые способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена только в том случае, если находятся между ними. При этом ни энхансер, ни промотор не теряют своей функциональности. Изучение механизмов действия инсуляторов имеет огромное значение для понимания принципов независимой экспрессии генов, а также механизмов специфического взаимодействия между регуляторными элементами.
В настоящее время наиболее изученным инсулятором является Su(Hw) инсулятор, входящий в состав ретротранспозона МДГ4 у Drosophila melanogaster. В работе инсулятора участвуют два белка Su(Hw) и Mod(mdg4). Хотя оба белка клонированы и определена их структура, единого мнения о механизме действия инсулятора не существует.
Недавно было показано, что если два Su(Hw) инсулятора находятся между энхансером и промотором, то происходит нейтрализация их активности. Более того, взаимодействие между двумя инсуляторами может способствовать более эффективной активации промотора энхансером. Целью настоящего исследования явилось дальнейшее исследование механизмов, которые лежат в основе феномена нейтрализации Su(Hw) инсулятора.
