Содержание к диссертации
Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 8
Термины, используемые в работе 8
Роль эктомикоризы в биоценозах 10
Методы, применяемые для изучения микоризообразующих грибов 16 Глава 2. Природные условия района исследований 33
Общая характеристика природных условий района исследований 33
Характеристика пробной площади 36 Глава 3. Материалы и методы исследования 42
3.1. Основные этапы подготовки эктомикоризных окончаний для анализа 42
3.3. Анализ изолятов молекулярными методами 44
Глава 4. Идентификация микобионтов эктомикоризных окончаний Picea abies 49
Типы эктомикоризных окончаний на пробной площади 49
Анализ ДНК микобионтов методом ITS риботипирования 53
Видоидентификация микобионтов методом секвенирования ДНК 68 Глава 5. Анализ пространственного распределения эктомикоризных грибов на 77
пробной площади
Горизонтальное и вертикальное распределение идентифицированных 77 микобионтов в почве исследованной пробной площади
Сравнительный анализ данных молекулярной идентификации 83 микобионтов с результатами картирования спорокарпов
Реакция эктомикоризных грибов на изменения в растительном 87 сообществе
Выводы 91
Литература 93
Приложения 109
Характеристика пробной площади 110
Характеристика исследованных почвенных проб 114
Исследованные образцы эктомикоризных окончаний Picea abies (L.) Karst. 115
Идентификация изолятов по последовательности 120
Определение филогенетической позиции для изолята 154 123
Определение филогенетической позиции для изолятов 1, 90, 169 и 113 126
Определение филогенетической позиции для изолятов 6, 96, 140 131
Определение филогенетической позиции для изолятов 14, 121 132
Определение филогенетической позиции для изолятов 24,109 135
Определение филогенетической позиции для изолятов 86,136 138
Определение филогенетической позиции для изолята 149 139
12. Наличие в базе сведений (ITS1-ITS2 область) о видах, отмеченных по 140
плодовым телам на пробных площадях
Введение к работе
Актуальность темы
История изучения эктотрофной микоризы насчитывает уже более ста лет. За это время накоплен огромный материал о данном явлении.
Исследованы физиологические процессы, сопровождающие эктомикоризный симбиоз (Келли, 1952; Лобанов, 1953; Шемаханова, 1962; Селиванов, 1981). Достигнуты большие успехи в изучении роли грибов в минеральном питании растений (Harley, 1989; Cairney, Smith, 1993; Dighton et al., 1993; McElhinney, Mitchell, 1993; Chalot et al., 1995; Prabhu et al., 1995).
Большое внимание уделялось применению искусственной микоризации для восстановления лесов (Келли, 1952; Чмыр, 1977; Сентяброва, 1988; Tosh et al., 1993; Работнов, 1994). Проводилось изучение биоценотических взаимодействий микоризообразующих грибов с другими компонентами биоценоза (Каламээс, 1977; Столярская, 1992,1998; Erland, 1995; Dahlberg et al., 1997).
До последнего времени представления о распространении мицелия эктомикоризных грибов в почве складывались на основе анализа частоты встречаемости и расположения плодовых тел. Попытки выявить виды микобионтов на основе анатомо-морфологических признаков эктомикоризных окончаний и сравнить с видовым разнообразием, установленным по плодовым телам, наталкиваются на определенные трудности.
В то время как многие виды почвенных микромицетов и бактерии можно определить после посева в культуру, идентифицировать эктомикоризообразующие грибы, выделенные из микоризных окончаний, чрезвычайно сложно, а часто и невозможно, так как они, за редким исключением (например виды родов Suillus, Xerocomus), не растут в культуре (Clint et al., 1991; Shaw et al, 1992; Leyval et al., 1997; Vodnik et al., 1998).
Исследователи неоднократно пытались классифицировать эктомикоризные окончания, используя различную степень детализации описаний. Это должно было привести к созданию определителей микоризообразующих грибов по анатомо-морфологическим признакам эктомикоризных окончаний. Но эта задача к настоящему времени не решена.
5 Современные методы молекулярного анализа позволяют выделить ДНК эктомикоризообразующего гриба из эктомикоризного окончания, нарастить целевой участок ДНК, используя метод полимеразнои цепной реакции, проанализировать полученный фрагмент методом риботипирования (ITS/RFLP), провести секвенирование и идентифицировать полученную последовательность, сравнивая ее с международным банком данных (INSD) (Gardes et al., 1996; Dahlberg et al, 1997; Jonsson et al., 1999; Agerer et al., 2002; Haug, 2002).
Идентификация микобионтов непосредственно из эктомикоризных окончаний современными методами позволит составить более ясное представление о сложной пространственной структуре сообщества грибов в устойчивой экосистеме со сложившимися отношениями (Коваленко, 1998). Цель и задачи исследования
Цель работы - провести пилотное исследование по молекулярной идентификации и анализу распределения в почве микобионтов эктомикориз Picea abies (L.) Karst в ельнике черничном на пробной площади (Карельский Перешеек, Ленинградская область) и сравнить полученные данные с анатомо-морфологическими характеристиками микоризных окончаний и результатами ранее проведенного исследования по картированию спорокарпов на той же пробной площади.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
Выявить основные анатомо-морфологические типы эктомикоризных окончаний на пробной площади в ельнике черничном и изучить их распределение по профилю почвы.
Экстрагировать геномную ДНК и амплифицировать в ПЦР ядерную рДНК микобионтов.
Провести риботипирование микобионтов (разбивку на группы путем рестрикционного анализа рДНК спейсеров).
Идентифицировать микобионты путем секвенирования (определения нуклеотидной последовательности) амплифицированных в ПЦР рДНК микобионтов и сравнения последовательностей, с использованием международной базы данных.
Установить соответствие выявленных видов эктомикоризообразующих грибов с морфологическими типами эктомикоризных окончаний и проанализировать их распределение по профилю почвы.
Провести сравнительный анализ полученных данных по молекулярной идентификации микобионтов и типам микоризных окончаний с ранее полученными результатами по картированию спорокарпов микоризных грибов на той же пробной площади.
На основе полученных данных рассмотреть особенности колонизации субстрата эктомикоризными грибами и спрогнозировать их реакцию на локальные нарушения почвенного покрова.
Научная новизна
Впервые в России проведена молекулярная идентификация микобионтов из эктомикоризных окончаний путем секвенирования рДНК и сравнения с международной базой данных. Причем, для старовозрастного елового леса такое исследование проведено впервые в мире. В результате идентифицировано 3 вида микобионтов и определено родство с 6-ю видами или группами видов.
На основе полученной информации в работе впервые построены схемы вертикального и горизонтального распределения видов эктомикоризообразующих грибов по профилю почвы в сложной естественной системе.
Полученные данные о видовом составе микобионтов, обитающих на корнях, и типах эктомикоризных окончаний, ими образуемых, дали возможность впервые провести сравнение видового разнообразия макромицетов в почве с данными многолетнего картирования плодовых тел. Практическое значение
Результаты исследования являются вкладом в изучение такого сложного и многогранного явления как микосимбиотрофизм.
Состав выявленных микобионтов эктомикоризных окончаний в старовозрастном ельнике можно принять в качестве эталонного при исследовании других растительных сообществ, в том числе и нарушенных.
Разработан алгоритм идентификации микобионтов эктомикоризных окончаний из почвенных проб, который рекомендуется использовать при аналогичных исследованиях.
Полученные сведения, могут быть использованы при разработке мероприятий по восстановлению леса. Апробация работы
Результаты исследования были представлены на VI Молодежной конференции
7 ботаников (Санкт-Петербург, 12-16 мая 1997 г.), на конференции "Жизнь популяций в гетерогенной среде" (Йошкар-Ола, 16-20 февраля 1998 г.), на Международной конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" (Москва, апрель 1998 г.), на конференции "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков", проводившейся в рамках II(X) съезда Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 26-29 мая 1998 г.), на Международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова восточной Фенноскандии" (Петрозаводск. 6-10 сентября 1999 г.), на Международной конференции "Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность" (Санкт-Петербург, 24-28 апреля 2000 г.), на VII Молодежной конференций ботаников (Санкт-Петербург, 15-19 мая 2000 г.), на 1 Съезде микологов России (Москва, 11-13 апреля 2002 г.). Публикация результатов исследования
По теме диссертации опубликовано десять работ. Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, пяти глав и выводов. Текст, включая приложения, изложен на 143 страницах и иллюстрирован б таблицами, 27 рисунками и 12 приложениями. Список используемой литературы включает 215 работ, из которых 112 на иностранных языках. Благодарности
Приношу глубокую благодарность Александру Елисеевичу Коваленко за предложенную тему исследования и поддержку, Сергею Алексеевичу Булату за всестороннюю помощь во время выполнения работы. Благодарю Dr. Karen Hughes (The University of Tennessee, Knoxville, TN, USA) за помощь в секвенировании: Благодарю И.А. Алехину за ценные советы при проведении молекулярных исследований, Е.А. Фомину за предоставленные неопубликованные данные картирования спорокарпов и О.В. Морозову за обсуждение работы.
Выражаю признательность всем сотрудникам Лаборатории систематики и географии грибов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН и Лаборатории генетики эукариот отдела молекулярной и радиационной биофизики С.-Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН за доброе отношение, ценные советы и разностороннюю помощь в обсуждении результатов работы.
