Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Биология и таксономическая характеристика
Crypto coccus neoform ans 10
-
Криптококки и криптококкоз 10
-
История открытия С. neoformans 10
-
Криптококкоз во второй половине XX и в начале XXI века 12
-
Классификация и таксономия криптококков 15
-
Род Cryptococcus 16
-
Экология и половой цикл С. neoformans 21
-
Эпидемиология криптококкоза 25
Глава 2. Патогенность С. neoformans 27
2.1 Факторы вирулентности 27
2.2 Полисахариды капсулы 28
2.3 Фенолоксидаза и синтез меланина 36
-
Продукция маннитола 37
-
Тип спаривания и разновидности криптококков 38
2.6 Экспериментальный криптококкоз и модели на животных 39
Глава 3. Чувствительность патогенного криптококка к различным
химическим веществам 41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Объекты и методы исследования
Штаммы криптококков, использованные в работе. Методы их
идентификации хранения 45
Питательные среды 46
Определение уреазной активности 52
Определение образования крахмалоподобного вещества 53
Изучение ассимиляции источников углерода и азота 53
Исследование ферментативной активности криптококков 54
Определение фенолоксидазы 54
Определение лецитиназы 55
Определение липазы 55
Определение протеазы 55
Определение активности химических веществ 55
Выявление микоциногенной активности сапротрофных
криптококков 58
Окрашивание микропрепаратов 58
Электронно-микроскопическое исследование криптококков 59
Определение сублетальных доз и разработка экспериментальной
модели криптококкоза 59
Исследование активности препаратов, ингибирующих меланогенез
на модели экспериментального криптококкоза 60
Методы статистической обработки 61
Глава 5. Микробиологическая характеристика штаммов криптококков 62
5.1 Морфология штаммов криптококков 62
5.2 Ассимиляция различных источников углерода и азота 65
5.3 Уреазная активность криптококков 65
Спектр экзоферментов патогенных криптококков 67
-
Определение лецитиназы 67
-
Определение липазы 70
5.6 Определение протеазы 70
5.70пределение фенолоксидазы и подбор оптимального субстрата для
дифференцировки С. neoformans 76
Глава 6. Действие различных химических веществ
напатогенный криптококк 79
6.1 Влияние алифатических карбоновых кислот 79
-
Влияние фенольных соединений 82
-
Влияние ионов металлов 87
6.4В лияние микоцинов 87
Глава 7. Экспериментальный криптококкоз
-
Определение сублетальной дозы 91
-
Разработка модели экспериментального криптококкоза 93
7.3 Влияние пассирования через организм мышей на свойства
С. neoformans 97
7.4 Исследование действия делагила на выживаемость животных на
модели экспериментального криптококкоза 98
Глава 8. Телеоморфы криптококков
8.1 Распределение типов спаривания среди исследованных штаммов
С. neoformans 100
8.2 Морфология Filobasidiella neoformans 102
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 105
ВЫВОДЫ 121
Практические рекомендации 123
Список литературы 124
Список условных сокращений 143
Введение к работе
Среди глубоких микозов особое место занимает криптококкоз. Возбудитель криптококкоза - базидиомицет Cryptococcus neoformans, выделен почти во всех регионах земного шара и считается грибом-космополитом. В последние десятилетия во всем мире регистрируется увеличение заболеваемости криптококкозом [44, 85, 171]. С. neoformans является одним из основных возбудителей менингита у больных СПИДом [141]. Все чаще выявляют случаи криптококковых инфекций у лиц подвергавшихся длительному лечению кортикостероидами или цитостатиками [171] Без лечения криптококковый менингит в 100% случаев имеет летальный исход.
По данным литературы от 6 до 10 % ВИЧ-инфицированных пациентов, не получающих высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ) в Европе, и около 30% пациентов в Африке, заболевают криптококкозом. У ВИЧ-инфицированных, получавших ВААРТ, заболеваемость криптококкозом несколько снижается [29]. Полагают, что частота криптококковых инфекций в ближайшие годы будет расти в связи увеличением количества лиц, входящих в группы риска.
Во всем мире проводятся интенсивные исследования иммунной и эндокринной систем больных для выяснения механизмов патогенеза криптококкоза. В то же время биологические и биохимические особенности возбудителя криптококкоза, определяющие вирулентность патогена, в полной мере не изучены, и механизмы патогенеза до конца не ясны.
К основным факторам агрессии С. neoformans относят капсульные полисахариды и способность синтезировать меланин. Имеются экспериментальные данные о вкладе в вирулентность целого ряда свойств С. neoformans: биотипа, типа спаривания, гидролитических ферментов и секретируемых грибом среду продуктов [44, 85, 57, 58, 141]. Однако данные, полученные разными авторами, не всегда тождественны. Зарубежными исследователями активно изучаются морфобиологические особенности штаммов С. neoformans выделенных от больных. В нашей стране таких работ не проводили. Изучение морфобиологических свойств С. neoformans и их связи с патогенностью гриба представляется актуальным в плане более углубленного понимания механизмов патогенеза криптококкоза, а так же для оценки вирулентных свойств штаммов гриба, выделяемых из клинического материала.
Отсутствие специфических симптомов и, часто, незнание криптококкоза делает затруднительным постановку правильного диагноза. При этом бактериологические лаборатории в большинстве медицинских клинических учреждений не исследуют патологический материал на грибы рода Cryptococcus - мониторинг криптококкоза в России пока отсутствует, и все это является причиной того, что криптококкоз может быть только случайной находкой в большинстве районов нашей страны.
Цель и задачи работы:
Целью работы было провести скрининг экзоклеточных ферментов криптококков, выращиваемых на разных питательных средах и оценить их вклад в определение вирулентности патогенов
Охарактеризовать по морфобиологическим признакам штаммы C.neoformans, провести их биотипирование и определить типы спаривания.
Оценить спектр экзоклеточных ферментов криптококков, выращиваемых в различных условиях.
3. Исследовать микоциногенную активность сапротрофных штаммов в отношении С. neoformans при различных условиях.
Изучить влияние низкомолекулярных моно- ди- и трикарбоновых кислот алифатического ряда и солей металлов в отношении С. neoformans.
Изучить влияние фенольных соединений на морфологию и ультраструктуру С. neoformans и создать дифференциально-диагностическую среду для выделения из патологического материала и одновременного определения возбудителя криптококкоза.
Сравнить на лабораторных животных вирулентность штаммов С. neoformans, различающихся по биохимическим признакам.
Основные положения, выносимые на защиту
Большинство штаммов С.neoformans, как выделенных от пациентов, так и полученных из других коллекций, обладают двумя основными факторами вирулентности (капсула и фенолоксидаза), 20% исследованных штаммов обладают фосфолипазной и протеазной активностью, у трети из них выявлен хотя бы один из этих ферментов.
Микоцины сапротрофных криптококков обуславливают их киллерную активность в отношении патогенного криптококка. Некоторые сапротрофные криптококки (C.humicolus-l 147) продуцируют микоцины с более широким спектром активности, тогда как другие обладают более узким спектром действия {C.laurentii -1133). В этой связи они могут быть рекомендованы для биотипирования С.neoformans.
Существование двух типов спаривания в жизненном цикле C.neoformans явилось исходным моментом для получения телеоморфной фазы, подтверждающей принадлежность криптококка к грибам базидиомицетового ряда. Среди культур, выделенных от пациентов, преобладают штаммы с типом спаривания альфа.
Среда с экстрактом зверобоя продырявленного {Hypericum perforatum) пригодна для применения в лабораторной практике для первичного выделения и идентификации C.neoformans из патологического материала.
Научная новизна исследования:
Впервые проведены скрининговые исследования экзоклеточных ферментов штаммов С. neoformans, выделенных от больных в России, а так же получена телеоморфная фаза жизненного цикла этого гриба. Установлено, что среди штаммов С. neoformans, выделенных от больных, встречаются штаммы обоих типов спаривания — альфа-типа (МАТа ) и a-типа (МАТа), причем первый тип является преобладающим. Исследовано влияние фенольных соединений на С. neoformans и разработана дифференциально-диагностическая среда для выделения
8 C.neoformans из патологического материала и его одновременного определения. Впервые оценено воздействие низкомолекулярных алифатических карбоновых кислот на С. neoformans и установлено, что изомасляная и изовалериановая кислоты в низких концентрациях оказывают на криптококки значительный ингибирующий эффект. Проведено сравнительное изучение вирулентности штаммов C.neoformans, выделенных от пациентов и различающихся морфобиологическим признакам; установлено, что более вирулентными штаммами являются те из них, которые обладают более широким спектром факторов агрессии.
Практическая значимость работы:
Предложенная дифференциально-диагностическая среда может быть использована в практике микробиологических и микологических лабораторий для выделения С. neoformans из патологического материала и его одновременного определения. Полученные данные о связи морфобиологических свойств и вирулентности С. neoformans могут быть использованы для характеристики штаммов гриба, выделяемых из клинического материала, для окончательной постановки диагноза и выбора средств лечения больных. Результаты скрещивания различных штаммов С. neoformans и микоциногенной активности сапротрофных криптококков в отношении патогенного С. neoformans могут быть использованы при составлении определителей и ключей для характеристики таксонов.
Результаты работы в целом могут служить основой для написания методических пособий по морфобиологической характеристике и биотипированию криптококков, выделенных от больных, с последующим использованием микробиологами и микологами в лабораториях лечебно-профилактических учреждений, а также в учебном процессе медицинских вузов; они могут быть включены в спецкурсы по медицинской микологии.
Апробация работы:
Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (г. Санкт-
9 Петербург, Россия, 2000, 2001 и 2002), на 6-м конгрессе Европейской конфедерации по медицинской микологии в 2000 (г. Барселона, Испания) а так же на международной конференции "Cryptococcus and Cryprococcosis" в 1999г (г.Лондон, Великобритания), в 2001г (Родос, Греция) и 2002г (г. Аделаида, Австралия).
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи, 3 доклада и 5 тезисов.
