Введение к работе
Актуальность теми. В зависимости ст среды обитания И читающих субстратов гриб:-: класса &исіиі J.o-.yc<;te". раздллявт на ряд экологических групп, а именно: микоризные грибы, подстилочные и гумусові if; с-шпотрсум, ксклотрсун, копротро-!ъ:, карбофилы и мико-^и.чы (Горленно ;і др., І9<30). Группа к сил о тройных (деревора:<ру-іадщях) базидисмицетов (КБ) объединяет гриби, сбитаюді:" ні Дро-ВеСКНе. іірЄ,",С;ТЧЬ!'.ТРЛ'/ ЭТО? ГСуППК ГрКСОЗ ОСуЩЄСТЧЛ<-ВТ рТСЦ?ПЛЄ-
ние лигпо'Д^ллглояного кскплекся древескнк - наиболее важк\;:> этап в ее биодеграді:у/,н. Ка основании отого КБ принято рассматривать в качестве глчвнж дкревор'пруїїителеГ» от деятельности которых зависит скорость рэвлекония древесины, и которым поэтому принадлежит ключг,аа рель в круговороте вецесгз и потоке энергии в лесных экосистемах (Степанова, IfyxiiH, 1979; Великанов, Успенская, 1980; Мухин, 1961). Значение этих грибов в природе обусловливает тот интерес, которые прз/влг»т к ним исследователя.
Зоькккног.ение экологических групп rpv.Sos является результатом бесчисленных адаптации к условиям существования во многих поколениях. 3 основе этих эволюционных биохимических ЯДаЛТаЦИ/ лежат механизмы, связанные с изменениям!' последовательности ОСНОВАНИЯ ЛЇЧ структурных к регуляторних генов, в результате чего в процессе транскрипции и трансляции образуются новые ферментные система, чатализируюяче тзасшпялгние соответствующих органических субстратов, а тахте ферментные еистехм, катализирующие синтг> вннх по с г сему составу биополимеров и биологически активных веществ . При этом изменяется активность синтеза уже судествукГ'Их r,ep;.!sHTOE, что меняет скорость протекания отдельных метаболических nporjejcori и соотношение химических компонентов, обычно встре-ЧЧГС'ДПХС- у грибов.
Еі;схк::ичеокк? адаптации грибов к субстратам связаны, в первую оч?Т!«д, с появлением кевкх адаптивных %ертентов, позволявших :ісполь:зовтть пт'.і субстраты (Хочачка, Ссиеро, 1977; Дьяков, ТіР.О; Зели'-'тког), Сидорова, 1ГЭЗ)« Именно поэтому подавляющее большинство работ и области Лизиологии и ^иохимпи KB поевгдено изучеиио их іїерм?йгньгх систем, которке, как считают ( УЛік , Раг-rell , 1937; Головлева, Леонтьевсии!*, 1990), осуществляют деградацию лигноцеллюлоэного комплекса древесины. В отой связи особые интерес представляет разделение КБ на две основное категории спе-
циалинировг-.нкых редуцентов - грибы белой и буро? гнили, различающиеся по дереворазруачющеР способности (Бондарцеэ, 1953; Ри-пачек, I9G7). Это разделение обусловлено, в первую очередь, различиям:» в наборе и активности внеклеточных гидролитических и окислительных ферментов, синтезируемых грибами . обеспечивающих процессы пи тяни я С -Bvant' f 1987; Фрнгел, Еегенер, 1988; Даниляк и Др., 1939 \
Вместе с тем адаптация КБ к условиям жизни на древес. .ІЄ, в той числе физией, /ическач специализация на группы грибов бело?1, и буро? гнили, сопряжет, по-видимому, с появлением целого ряда генетически закрепленных фи:иолого-биохи.чических особенностей в бел-кором, липидноы и углеводном метаболизме. Преимущественное образование тех или иккх биополимеров, разнообразных биологически актирных рс-ществ носит, как правило, прчепоегбитольны? характер (Хочачка, Сомеро, 1977), Выгпленио ^кьиолого-биохимических особенностей КБ, в частности особенностей^ тическоя активности, и разработка представлені'.?, об их адаптационно!» роли имеют больиое теоретическое лначение, поскольку связаны с репением таких проблем, как биохимическая адаптация к поддержание гомеостазе у грибов. Однако исследования в этой направлении до егх пор практически не проводились.
Изучение особенностей биосиктетичеосой активности КБ необходимо также в связи с разработкой научных основ их использования .і биотехнологии.
Цель и задачи исследования. Цель» настоящей работы явилось комплексное изучение биосинтетическоС активности КБ в глубинной культуре, включающее следующие основные аспекты:выявление особенностей биосинтегическс? активности у представителег* оснезных таксономических и физиологических групп КБ; разработку представлений об адаптационной значимости отих особенностей и научных основ их использования в биотехнологии.
В задачи исследования входило:
изучение видового состава КБ Минского района и их специализации г -іесообраауощкм древесным породам в связи со способностью усваивать разные компоненты древесины и создание на этой основе коллекции культур грибов;
установление закономерностей роста КБ в глубинноЯ культуре и образования основних классоз органических соединений, входящих
- 5 -в состав их мицелия;
сравнительное изучение биосинтетическоР активности KB в связи с их систематическим положением и физиологическое ' мнчд-леяностью;
разработка предстазлени:1 об адаптационной значимости осо-бенноотеі; биосинтетическо;' активности КБ;
исследование механизмов регуляции перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) и его возможное роли в жизнедеятельности мицелия грибов;
разработка метода определения антиокислительноП активности (АОА' в экстрактах мицелис грибов и изучение антиоксидантних свойств КБ;
изучения способности ферментных систем КБ катализировать трансформацию полин-насьтценных С^-жирных кислот в простагландини;
выявление штампов - активных продуцентов белка, липидов, полисахаридов, антиокскдантов и других биологически активных веществ и разработка биотехнологических основ получения соответствующих препаратов.
Научная новизна. Епервые проведено комплексное исследование видового состава КБ в лесах Минского раРона. Выявлено 75 видов наиболее распространеннее КБ порядков '-,-lriyllc югаїаа ц Ддагіса-
les . Показано, что преобла," гащими по числу видов среди афилло-форовых грибов являются семейства' Polypoxoceee (49,1), :!y.r.ono
chaotaceae (22 и Corticiaceae (12,7). а среди ягариковых грибов - PLeuro'acese (30). Sixophaziaccae (30) И Vricholo-natpceae (25). Установлена связь между слециализацизй грибов к лесообрчзуюгзим дречеси^м породам и их способностью вызывать опре-Гм»!' тип разрушения древесины.
Получены новка сравнительные данные о культуралино-іуорйологи-ческих особенностях 59 пидоз КВ. Методом электронное микроскопии показано наличие в гифах гицелик грибов буроГ' гнили активного хондриомя, включающего изогнутые митохондрии с длинными кристами, а в гифах мицелия грибов белой гнили - сложных мембранных структур - плазыалешпеом. Впервые охарактеризованы по культурально--морйологичесяим "Ч1ЭНЗК&Ч ВІІДО Віріолігорогиз flavoscena t ke-letocutia stellae , Pluts'je аггісаріїїііз . Впервае получена СтаДИЯ теЛвОМОрфЫ В ИСКУССТВЭННЫХ УСЛОВИЯХ У Ваиааігорзіз ООПІ.'-
rEgosa и Ler.zi.tes botulir.a .
_ 6 -
Установлено, что адаптация КБ к обитании на древесине связана с наличием у них ряда особенносте!' биоеинтетииеско;? активности, которые ыогсно выявить п условиях глубинного культивирозания на яидких питательных средах. К числу таких особенностей относятся высокая эффективность синтеза белка, прей: ._щественное накопление углеводов при лимитировании источниками азотного питания и неспособность к образованию з тигельного количества липидов. Для. фосфслипидоп (ЙГ мицелия характерно преобладание легкоок.-сляемых фтр.кци* фсіч'дтиди.чзтчноламина, кардиолипина и фосфаткдилглицерина. Впервые выявлена способность КБ к синтезу высокоактивных липокеи-гопя.
Обосновано представление о том, что влияние различшіх факторов на уровень содержания белка в мицолиалъно!* биокассе опосредовано изменениями степени гетерогенности мицелия, которая определяется соотношением числя живых и явтолилироппннцх клеток, а также флук-туяциями содержание белка в живмх клетках. Впервые показано, что монэкарионк, полученные из одного плодовиго тела, могут иметь разное содержание беляа в мицелии.
Впервые дчна характеристика антиоксидантних свогств КБ и установлен' возможность протекания в их мицелии реакциГ перекисного окисления липидов. Активация процессов ПОЯ колет приводить к снижению содержания белка в мицелии. Сформулировано представление о повышенном янтиокеидяктном статусе грибов бело" гнили как биохимическое адаптации, обеспечивяюце? их вккивание в условиях окислительного стресса, связанного со свободнорадккалънкми реакциями, протекающими в процессе деструкции лигнина.
В результате изучения параметров систему регуляции ПОЛ установлено существование взаимосвязи между составом липидов мицелия KB, АОА липидов и спиртовых экстрактов, .активностью липоксигеназ и антиоксидантних ферментов, содержанием продуктов ПОЛ. Предложена гипотеза епободнорадикяльного окисления лигнина, в основе котороГ- лежит идея о его расщеплении кяк результате совместного действия лиг-нинслктических ферментов и перекисннх радикалов липидов.
Покапано, что ферментные системы KB катализируют трансформацию полиненаск-, >нн1,!Х Cgg-mprajx кислот в простагландини. При этом они отличаются субстратно" специфичностью по отношению к дигомо-у-ли-коленовоп кислоте и наиболее зіТяіжктибно образует простагландини серии I. Установлено, что среди продуктов трансформации основную часть составляют тромбсксянк.
Показано, что физиологическая специализация КБ на группы грибов беле? и буро? гнили связана как с появлением у них специализированных іуертдантнмх систем, тач и с особенностям'/ образования я количественного содержания основных классов органических соединение и отдельных химических веществ, входпцих в состав у.и-целия. В условиях г луб инн о г.а культивирования, грибы бело" гнчли отличаются более- оЛ'ектнвнкм синтезом белка, активні!?.! образованием углеводов, високим содержанием свободи»: аминокислот, а в их составе - глупуиноно? кислоты. Ососекностью липидсв их мицелии является пеглгаенное содержание $Л и ненасыщенных :;:ирнкх кислот, среди KOTopsix преобладает линслевая кислота. КБ бело? гнили отличайте я тчкгй более высоко" активностью липокеигеназ и антиоксидантних *ер!.:октов. Адалтапионнак значимость особенностей биосин-тетичееко'; активности г<якличается в тем, что они обеспечивают эггоктивное усвоение источников питания и равновесие з системо регуляции ЛОЛ, что свидетельствует об их важно15 роли в поддержании гомеостаза у грибов. Ряд выявленных "собеннссчее биосинтети-ческо? активности КБ (.гирноккслотны? и ф..акционны? состав дипи-дов, состав свободных и общих аминокислот, уровень активности ли-поксиген«э, уровень АОА лкпидов и др/ мотет быть использован ; качестве дополнительных критериев при у-эчнении принадлежности грибов к аязкологяческо? группе и их видовой идентификации.
"'"^ичесуа» ценность работы. Создана первая в Республике L„-ларусь коллекция культур, которая включает 122 штамма 59 видов грибов, являющихся представителями основных порядков и семейств КБ. Выявлены штаммы грибов - активные продуценты белка, на основе которых разработаны способы получения биомассы кормового и пи-
,вого назначения (Авт.св. Г В33177, 937517, 1050474, II92I90, 136748Э, 1369017 і . Ообрак стамм Floraulina velutipesKB_l -продуцент лиггдцор с повышенным содержанием ненасыщенных ниркїя кислот (Авт.св. !*> 33420Т4"1. Установлено, что среди лигнинразрутаю-гглх КБ есть виды, которые могут представлять интерес в качеств? потенциал'чьи продуцентов, липоксигеназ рогез .fober.tcrius , Panuu tir;rinu3 ). Показана возможность испольг ванил ферментных систем КБ для получения "«козаноидов И, з частности, тромбоксанов.
Предложен HOBHf метод определения АОА в экстрактах мицелия грибов, содержали высоконенасьтденньте липиды. Установлено, что некоторые лигнинрасруяащие ксилотройкыэ базидиомпцетн ( *опез fo-
- 8 -ліег-tarius і Ganoderma lucidum . Panus .tigrinus И Др.) могут быть использованы для получения комплексных препаратов, обладающих высокой АОА.
Разработан способ получения препарата, обладающего радиоза-щитнш действием, на основе экстракта мицелия Schizophyllur. commune (Положительное решение о выдаче Патента России по заявке № 4890224/13(118322)). Впервые продемонстрирована высокая АОА экстракта чаги, что позволило рекомендовать его в качестве средства, модифицирующего радиорезистентность животных (Положительное решение о выдаче Патента России по заявке № 4880314/14(1086121).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на совместном заседании кафедр микробиологии и микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета км.М.В.Ломоносова; на заседании Ученого совета Института микробиологии АК Беларуси; на Всесоюзной конференции "Мицелиальные грибы" (Пущино, 1983); на Всесоюзном совещании "Проблемы продовольственного и кормового использования ьедревес-ных и второстепенных лесных ресурсов" (Красноярск, 1983); на Рес-П1 бликанском рабочем координациожом совещании "Микроорганизмы в сеяьск^ - хозяйстве" (Минск, 1983); на Всесоюзных конференциях "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ"(Рига, 1984, 1987); на П Всесоюзном совещании "Производство высших съедобных грибов" (Киев, 1985); на УП сгезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985); на X конгрессе европейских микологов (Таллинн, 1989); на ТУ Всесоюзной конференции "Химия, фармакология и механизм действия противолучевых средств"(Москва, 1990); на Всесоюзной конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской ASC" (Ыинск, 1991); на ІУ ~ Конференции "Биоантиоксидант" (Москва,' 1992).
Публикация результатов исследование. По материалам диссертации опубликовано 33 печатные работы# получено 9 авторских свидетельств.
Струч'ура и об-ъем работы .диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на
Автор считает своим долгом выразить благодарность зп содеГ'ст-
- 9 -виє в (выполнения работы сотрудникам кафедр микробиологии и микологии и альгологии Московского 'государственного университета им. М.В.Ломоносова, лаборатории биохимии грибов Ботанического института им.В.Л.Комарова РАН, лаборатории физико-химических о«...ов клеточное регуляции Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН, клинико-биохимической лаборатории Российского научно-исследова -тельскогс института обіде? и ';уДебно? психиатрии им.3.П.Сербского, Отдела микологии института ботаники км.Н.Г.Холодного АН Украчі , лабораторий низших растение и физиологии больного растения Института експериментально-? ботаники км.В.Ф.Купревича АН Беларуси, лаборатории биохимии Института радиобиологии ^Н Беларуси, лаборатория техническое микологии и физиологии микроорганизмов Института микробиологии АН Беларуси.
