Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1.Систематическое положение .9
1.2.Биология вида 9
1.3.Соврем енная концепция пищеварения 10
1.3.1. Пищеварение у рыб 10
].3.2.Пищеварение у личинок 20
1.3.3. Пищеварение у сиговых на ранних этапах постэмбриогенеза 31
Глава 2. Материал и методы исследований.
2.1. Объект исследований 34
2.2.Постановка экспериментов 34
2.2.1. Личиночный период 35
2.2.2. Мальковый период 36
2.3.Сбор материала 36
2.4.Определение активности ферментов 37
2.4.1 .Техника приготовления ферментативных препаратов 37
2.4.2. 0пределение суммарной карбогидразной активности 38
2.4.3.0пределение активности а-амилазы 40
2.4.4.0пределение активности нейтральной протеазы 41
2.5. Математическая обработка результатов исследования 43
Глава 3. Характеристика основных абиотических факторов водной среды при выращивании белорыбицы в разных условиях.
3.1. Гидрохимическая характеристика выростных прудов 45
3.2. Анализ основных гидрохимических показателей пруда при изучении циркадной ритмики активности гидролаз 48
3.2.1. Личиночный период 49
3.2.2. Мальковый период 50
3.3. Гидрохимическая характеристика воды аквариумов при кормлении белорыбицы разными кормами 53
Глава 4. Исследование динамики активности пищеварительных ферментов у белорыбицы в личиночный период развития при разных условиях выращивания.
4.1. Исследование динамики активности пищеварительных ферментов у белорыбицы в личиночный период развития при выращивании в прудах 55
4.1.1. Динамика общей амилолитической активности 55
4.1.2. Динамика активности а-амилазы 58
4.1.3. Динамика активности нейтральной протеазы 60
4.2. Суточная динамика активности пищеварительных ферментов у белорыбицы на VI этапе личиночного периода развития 64
4.2.1. Динамика общей амилолитической активности 65
4.2.2. Динамика суточной активности а-амилазы 67
4.2.3. Динамика суточной активности нейтральной протеазы 69
4.3. Исследование динамики активности пищеварительных ферментов у белорыбицы при кормлении разными кормами 71
4.3.1. Исследование динамики общей амилолитической активности у белорыбицы при кормлении разными кормами 71
4.3.2. Исследование динамики активности а-амилазы у белорыбицы при кормлении разными кормами 74
Глава. 5. Исследование динамики активности пищеварительных ферментов у белорыбицы в мальковый период развития.
5.1, Исследование динамики активности пищеварительных ферментов у белорыбицы в мальковый период развития при выращивании в прудах 79
ф 5.1.1. Динамика общей амилолитической активности 79
5.1.2, Динамика активности а-амилазы 81
5.1.3. Динамика активности нейтральной протеазы 83
5.2. Циркадная ритмика активности пищеварительных ферментов у белорыбицы на II этапе малькового периода 85
5.2.1. Динамика общей амилолитической активности 85
5.2.2. Динамика суточной активности а-амилазы 87
5.2.3. Динамика суточной активности нейтральной ij^N протеазы 89
Глава. 6. Корреляционный и регрессионный анализы данных активности пищеварительных ферментов у молоди белорыбицы на изучаемых этапах постэмбрионального периода развития.
6.1, Корреляционный анализ 92
6.2. Изменение активности пищеварительных ферментов в период формирования у выращенной в прудовых условиях молоди белорыбицы синдрома покатной миграции 93
6.2,1, Активность а-амилазы 95
№L 6.2.2. Нейтральная протеаза 97
6.2.3. Общая амилолитическая активность 100
Заключение , 104
Выводы 109
Список используемой литературы 110
Приложение 131
- Пищеварение у сиговых на ранних этапах постэмбриогенеза
- 0пределение суммарной карбогидразной активности
- Гидрохимическая характеристика воды аквариумов при кормлении белорыбицы разными кормами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Приспособление биологической системы к изменившимся условиям внутренней или внешней среды имеет в своей основе "метаболическую адаптацию". Среди её механизмов- очень большое значение имеет индукция биосинтеза белков, в том числе ферментов. Вопросы, касающиеся влияния особенностей экологии рыб на интенсивность процессов пищеварения, и в частности на активность пищеварительных гидролаз, исследованы достаточно подробно (Уголев, Кузьмина, 1993; Абдурахманов и др., 2003). При этом основное внимание уделялось изучению ферментного спектра и соотношению активности разноименных энзимов у рыб, различающихся по характеру питания, изменению активности различных гидролаз на разных, этапах онтогенеза рыб; а так же влиянию сезонных ритмов на уровень ферментной активности. В последнее время в связи с проблемой искусственного* рыборазведения интенсивно исследуется влияние состава кормов на активность пищеварительных гидролаз (Михайлова, 1995; Егорова, .1996; Михайло-ваидр., 2001; Кузьмина, 2001).
Поданным исследований ряда авторов, экологические факторы, такие как температура воды, содержание кислорода и рН среды, в значительной степени способны влиять на гидролитические процессы, протекающие в кишечнике, у рыб (Кузьмина, Неваленный, 1986; Неваленный и др., 1990; Nevalyonny et. al.,1991; Егоров, 1995; Кузьмина, Голованова, 1997; Волкова.1999; Кузьмина, 1999; Абдурахманов и др., 2003). Крометого, мероприятия, проводимые в прудах при индустриальном выращивании рыбы, также накладывают определенный отпечаток на реализацию пищеварительной функции, воздействуя на организм рыбы в течение всей жизни, причем, как на интенсивность потребления пищи, так и на эффективность утилизации питательных веществ, входящих в их состав (Киселев, 1985; Остроумова, 1986,1988; Зайцев, 1992; Уголев, Кузьмина, 1993). В связи с этим в данной работе предпринята попытка охарактеризовать эколого-физиологические особенности реализации пищеварительной функции у белорыбицы на ранних этапах онтогенеза при выращивании в разных условиях, на примере адсорбированных на слизистой оболочке кишечных ферментов, осуществляющих гидролиз углеводных и белковых компонентов пищи.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование эколого-физиологических особенностей реализации пищеварительной функции на примере кишечных ферментов у белорыбицы (Stenodus Jeucichthys
Guldenstadt, 1772) в раннем онтогенезеус-
ррр рплрр|цияяниіа.я разных
ГОС. НАЦИОНАЛЫ!*» * БИБЛИОТЕКА I
JJTSfffty і
ловиях.
В связи с этим в процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1.Дать характеристику некоторых экологических факторов водной среды (температура, содержание кислорода, рН) при подращивании молоди белорыбицы в разных условиях.
2.Изучить динамику активности пищеварительных ферментов у белорыбицы на протяжении личиночного и малькового периодов развития, при подращивании в прудах.
3.Исследовать особенности циркадных ритмов активности пищеварительных ферментов у молоди белорыбицы на ранних этапах развития.
4. Изучить динамику активности пищеварительных ферментов у белорыбицы при выращивании на разных кормах.
б.Установить зависимость между возрастом и активностью пищеварительных гидролаз у белорыбицы при выращивании в прудах.
Научная новизна. Впервые получены материалы по влиянию некоторых экологических факторов на активность пищеварительных ферментов различных цепей гидролиза у белорыбицы в период раннего постэмбрионального развития. Получены материалы по исследованию активности пищеварительных ферментов, осуществляющих расщепление углеводной части пищи (общая амилолитическая, а - амилаза) и белковой (нейтральная протеаза) в личиночный и мальковый период развития у белорыбицы при выращивании прудах и замкнутых системах с использованием разных видов кормов. Впервые у молоди, белорыбицы, обнаружен феномен зависимости уровня активности пищеварительных ферментов от становления синдрома покатной миграции, обусловленного возрастом.
Практическая значимость работы. Полученные данные могут использоваться для повышения эффективности индустриального воспроизводства белорыбицы, составления научно- обоснованных рационов сбалансированных кормов. Работа вносит вклад в решение целого ряда проблем экологии и трофологии; связанных с особенностями физиологического состояния пищеварительной системы белорыбицы на ранних этапах постэмбрионального периодов развития. Знание особенностей циркадной ритмики активности пищеварительных гидролаз, позволяет совершенствовать метод транспортировки молоди белорыбицы. Данные регрессионного, корреляционного и дифференциального анализов могут использоваться в практике аквакультуры с целью научного обоснования стандартов при подращивании молоди белорыбицы в рыбоводных прудах.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на IV Всероссийской конференции (Ярославль,2000), AQUA 2000, Responsible Aquaculture in the new Millennium, (France.2000), включены в результаты работ «Рыбохозяйственные исследования на Каспии», (Касп-НИРХ.2001), Международной конференции, посвященной 105-летию Касп-НИРХа «Молодые ученые о будущем Каспийского моря», (Астрахань 2002)
Публикации По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура раооты. Диссертация изложена на 130 страницах
машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком. Работа состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, указателя цитируемой литературы, включающего 184 источника, в том числе отечественных 131 и 53 иностранных, 1 приложения.
Пищеварение у сиговых на ранних этапах постэмбриогенеза
Ранние этапы онтогенеза сиговых, особенно развитие и питание личинок, изучались рядом авторов в связи с вопросами воспроизводства этих рыб (Подлесный, 1947; Смольянов, 1957;Коржуев, Шаркова, 1967; Богданова, 1979; Кузьмина,Голованова, 1984; Летичевский, 1978, 1981, 1983; Бузинова, 1971; Михайлова, 1995; Михайлова и др., 2001 и др.; Васильченко, 2002). По мнению этих авторов питание личинок на разных этапах развития находится в большей зависимости от температуры воды, чем от режима кормления. Пониженная температура может является более сильным отрицательным фактором, влияющим на развитие пищеварительной системы, чем временное голодание. Исследования показали, что способность нельмы к временному и длительному голоданию в период раннего онтогенеза можно рассматривать как адаптацию к условиям бедной кормовой базы выростных водоемов ранней весной. Это может быть связано с жировой каплей, которая даже при нормальном питании расходуется крайне медленно (26 суток при температуре 11,4С и 40 суток - при 3,8С) (Богданова, 1977; Васильченко, 2002). Многочисленные исследования питания и развития молоди белорыбицы различными методами показали, что среднесуточный прирост так же прежде всего зависит от температурного режима выростного водоема, но при постоянной температуре воды выше 18С может зависеть и от состава корма (Михайлова, 1995; Михайлова и др., 2001 и др.; Васильченко, 2002). Выращивание молоди белорыбицы проводится ранней весной, характеризующейся в низовьях Волги крайне неустойчивым гидрологическим режимом. Так, в 1998г. колебания температуры воды в выростных прудах были наиболее резкими: в период зарыбления она составляла около 4С (2 апреля), к середине повышалась до 16С, а затем понижалась до 9-11 С. Таким образом, развитие личинок белорыбицы сопряжено с периодом резкого перепада температур и слабым развитием кормовой базы в выростных прудах, что сказывается на длительности этапов постэмбрионального периода развития (Васильченко, 2002).
Работ касающихся исследованию у сиговых реализации пищеварительной функции немного. Гистохимические исследования проводимые ранее по пятибалльной шкале разработанной и принятой в КаспНИРХе. показали, что активность щелочной фосфотазы в желудке у молоди белорыбицы проявлялась равномерным распределением мелких гранул азокрасителя по цитоплазме всех эпителиальных клеток (1-1,5+). В кишечнике активность фермента существенно варьировала по отделам (от 1,5 до 5+). В печени она составляла 1,5-2+. Активность продукта в мышечных волокнах (0,5-1+). Активность кислой фосфатазы кишечнике проявляла определенную мозаичность и была низкой в (0,5+), выявлялись отдельные клетки, активность фермента в которых составляет 1-1,5+. Активность неспецифической эстеразы в печени составляет 2-3+, В мышцах при высокой активности фермента в септах (3-5+), активность его в цитоплазме не превышала 1-2+. Активность неспецифической эстеразы во всех отделах кишечника находилась на одном уровне (2-5+). Наибольшая активность наблюдалась в цитоплазме апикальных отделов эпителиальных клеток. В желудке регистрировалась невысокая активность неспецифической эстеразы кислой и щелочной фосфатаз (Михайлова и др., 1991). По мнению других авторов,
V активность таких ферментов как кислая и щелочная фосфатаза, липаза, неспецифическая эстераза у белорыбицы снижается к 25 суткам развития при возрастании эстеразы к 16 суткам в отличии от других исследуемых ферментов, что как считаю авторы может быть связано и с влиянием антропогенных факторов среды (Кузнецов, 1972).
Таким образом, все авторы изучавшие рост, питание и реализацию пищеварительной функции у сиговых, указывают на видовую особенность влияния биотических и абиотических факторов среды на ранних этапах постэмбрионального периода развития у рыб на активность пищеварительных ферментов различных цепей гидролиза.
В доступной литературе мы не нашли данных касающихся изучения пищеварительных ферментов у белорыбицы на ранних стадиях развития.
0пределение суммарной карбогидразной активности
Суммарную карбогидразную активности определяли методом Нельсона в модификации А. М Уголева и Н. Н. Иезуитовой (1969). Принцип метода основан на окислении редуцирующих Сахаров медным реактивом с последующим восстановлением мышьяково-молибденового реактива в присутствии образовавшейся закиси меди.
Реактивы
Субстрат: 2% раствор растворимого крахмала или 2% раствор сахарозы.
Изотонический раствор: 9.6 г Ыаг804 ЮН2О и 2.1 г C11SO4 5ШО доводятся водой до 350 мл.
Медный реактив для окисления гексоз, состоящий из двух растворов - А и Б.
Раствор А: 13 г C11SO4 ЗНгО доводятся водой до 1 литра.
Раствор Б: 50 г NaHCCb растворяются при перемешивании в 700 мл НгО; затем прибавляется 40 г Na2CCb и (36.8 г щавелевокислого калия, предварительно растворенных в 100 мл подогретой воды) и 24 г сегнетовой соли, так же растворенной в 100 мл подогретой воды. Объем смеси доводят до 1 литра.
Рабочий раствор готовится перед употреблением смешением равных частей растворов А и Б.
Мышьяково-молибденовый реактив: 25 г молибденово-кислого аммония растворяются в 450 мл fhO, затем добавляется 21 мл концентрированной H2SO4 и 3 г двухзамещенного мышьяково-кислого натрия, предварительно растворенного в 25 мл НгО; раствор выдерживается двое суток в темноте при 37С. Перед употреблением разводится водой в три раза.
10 % раствор вольфрамата натрия для осаждения белков. Хранится в холодильнике.
0,05 % стандартный раствор глюкозы.
Ход определения
К 0.5 мл субстрата приливают 0.5 мл гомогената и инкубируют 10-60 мин. при температуре 25С и постоянном перемешивании. Температура 25С выбрана в соответствии с рекомендациями Международной комиссии по ферментам (Диксон, Уэбб, 1982).
К 3.7 мл изотонического раствора вольфрамата натрия добавляется 0.5 мл инкубата. Через 10 мин смесь фильтруют через двойной фильтр.
1 мл фильтрата приливают к 1 мл меднощелочного реактива (смесь А и Б) для окисления восстановленных веществ.
После 10 мин. пребывания в кипящей бане и охлаждения в пробирки приливают по 3 мл мышьяково-молибденового реактива, предварительно разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:2, которым окисляют восстановленные вещества (глюкозу), и дающего с ними сине-зеленую окраску, колориметрируют через 10-15 мин на ФЭКе (SPEKOL-11) при Х-610 нм против перечисленных выше реактивов, к которым вместо инкубационной смеси добавляется такое же количество дистиллированной воды.
Прирост редуцирующих Сахаров определяется сравнением показаний прибора при колориметрировании опытного и стандартного растворов. В последнем случае к изотоническому раствору добавляется такое же количество стандартного раствора глюкозы (0.05%), как и инкубационной смеси. Контроль: осадитель + 0.5 мл субстрата + 0.5 мл гомогената.
V — активность фермента, мкМоль/(г мин), Еоп — экстинкция опытного раствора, Ест — экстинкция стандартного раствора, Тинк — время инкубации, мин, разв — рабочее разведение, количество раз.
Гидрохимическая характеристика воды аквариумов при кормлении белорыбицы разными кормами
При проведении исследований по кормлению молоди белорыбицы на первых пяти этапах развития различными кормами нами проводился контроль за основными факторами среды.
На рисунке 4. показано изменение температуры, содержания кислорода и активность ионов водорода при кормлении белорыбицы различными кормами на первых пяти этапах постэмбрионального развития.
За весь период выращивания нами отмечено увеличение температуры воды от 16,1 С (I этап развития) до 21,5С (V этап развития).
На протяжения всего периода выращивания содержание кислорода в воде изменялось в пределах 9,8 - 10,4 мг/л, активная реакция среды находилась в пределах от 7,1 до 7,8.
Полученные нами данные, показывают наличие условий выращивания отличающихся от аналогичных полученных при выращивании белорыбицы в пруду. Температура воды на первом этапе развития (3
сутки после выклева) в 3 раза превышала температуру зарегистрированную в пруду. Поэтому более высокий температурный режим, при выращивании белорыбицы в аквариумах, оказал влияние на скорость развития пищеварительной системы и прохождения последующих этапов постэмбрионального развития. Ранее полученные данные подтверждают наши исследования (Летичевский, 1963). Изменение значений содержания кислорода и Нр среды изменялись в узком диапазоне. Это свидетельствует о том, что условия выращивания i\ белорыбицы даже на неживых кормах были максимально приближены к таковым же при выращивании на живом корме и в прудах. Установлено, что становление гидролитических функций в / значительной мере зависит от типа ферментативной цепи и видовой принадлежности рыб. Кроме того, известно, что на протяжении жизни рыб активность ферментов претерпевает значительные изменения. При этом, наиболее существенное увеличение уровня ферментной активности приходится на личиночный период, где определяющее влияние на характер развития пищеварительной функции оказывает спектр и интенсивность питания рыб в первые месяцы постэмбрионального периода (Ильина, 1985; Плотников, Проскуряков, 1983, 1984; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Волкова, 1999). В последние годы, в -, связи с изменениями представления о реализации пищеварительной " функции у рыб, большой интерес стали представлять работы по выявлению физиолого-биохимических механизмов приспособления рыб (Зайцев, Неваленный, 1995).
В связи с этим, нами была проведена работа по изучению динамики активности пищеварительных ферментов у белорыбицы на личиночном и мальковом этапах развития.
Рассматривая данные, полученные при исследовании общей амилолитической активности у белорыбицы (рис.5) следует отметить, что на протяжении всех шести этапов личиночного развития характер скорости гидролиза углеводных компонентов корма существенно изменяется.
Так, на I этапе личиночного развития (3 сутки после выклева) суммарная карбогидразная активность составляла 0,13510,03 мкМоль/(гхмин). На 11 сутки после выклева (II этап) наблюдалось резкое увеличение активности исследуемого фермента в 26.5 раза по сравнению с I этапом изучаемого периода развития (3,58±0,1О мкМоль/(гхмин)). На протяжении III и IV этапов постэмбрионального развития (20 и 27 сутки после выклева) наблюдалось снижение скорости гидролиза углеводных компонентов корма до уровня 2,85+0,19 мкМоль/(г х мин) и 2,011±0,24 мкМоль/(г х мин) соответственно. На 38 сутки после выклева (V этап) суммарная карбогидразная активность у белорыбицы снизилась в 2,7 раза по сравнению с IV этапом личиночного периода развития и составила 0,753±0,01 мкМоль/(г х мин). VI этап постэмбрионального развития (45 суток после выклева) характеризовался увеличением скорости гидролиза углеводных компонентов корма в 3,8 раза по сравнению с V этапом изучаемого периода развития (2,8410,16 мкМоль/(г х мин)).
