Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1,1 Мобильные генетические элементы Vibrio cholerae биовара
эльтор, связанные с вирулентностью 20
Бактериофаги 20-26
Острова патогенносте и пандемичности 26-33
Суперинтегроны и интегроны V.cholerae 33-36
1.2. Изменения генома V.cholerae биовара эльтор в процессе эво-
люции ',
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
Бактериальные штаммы 42-45
Питательные среды и реактивы 45-46
2.3. Методы 46
Культивирование штаммов 46
Определение продукции растворимой гемагглюти-нин/протеазы 46
2.3.3 Определение подвижности 46
2.3.4. Определение продукции 01 антигена 46
Определение чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам 47
Определение продукции маннозо-чувствительных гемагг-лютинирующих пилей адгезии 47
Определение способности формировать биопленку 47-48
Определение продукции холерного токсина 48-49
Определение конкурентных способностей 49
Электрофорез в полиакриламидном геле 50
Выделение экзополисахарида и количественное определение его содержания 51
Полимеразная цепная реакция 51-55
Выделение хромосомной ДНК 56
Секвенирование ДНК 56
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 56-57
Внутрикишечное заражение модельных животных 57
2.3.17 Гибридизация хромосомной ДНК по Саузерну и риботипи-
рование штаммов V.cholerae биовара эльтор 57
ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ШТАММОВ V.CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫДЕ
ЛЕННЫХ ДО НАЧАЛА И В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ СЕДЬ
МОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ 58-59
Изучение серологических свойств, чувствительности к диагностическим фагам и гемолитической активности 59-65
Изучение основных биохимических свойств, связанных с вирулентностью 65-69
3.3. Сопоставление устойчивости к лекарственным препаратам
у предпандемических и пандемических штаммов 69-71
ГЛАВА 4. СТРУКТУРНЫЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕ
НОМА ПРЕДПАНДЕМИЧЕСКІ4Х ШТАММОВ ХОЛЕР
НЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР 72
Распространение профагов и островов патогенности среди природных штаммов, выделенных до начала седьмой пандемии холеры 72-77
Выяснение присутствия в геноме предпандемических штаммов регуляторных генов, контролирующих экспрессию основных генов вирулентности 77-81
Сравнение нуклеотидных последовательностей основных структурных и регуляторных генов вирулентности пред-пандемических штаммов 82-84
Определение токсигенности и вирулентности предпандеми-ческих штаммов 85-88
Определение присутствия острова персиситенции у пред-пандемических штаммов и изучение их способности к образованию биопленки 88-94
ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ШТАММОВ V.CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫ-
95
ЗВАВШИХ 7-Ю ПАНДЕМИЮ ХОЛЕРЫ
Выявление в геноме пандемических штаммов новых мобильных элементов - островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 95-98
Сравнительный анализ жизнеспособности предпандемиче-
ских и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор 99-100
5.3. Молекулярное типирование штаммов холерных вибрионов
эльтор, выделенных до и во время седьмой пандемии 100-107
ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПРИРОДНЫХ
ШТАММОВ V.CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР ВЫДЕ
ЛЕННЫХ ВО ВРЕМЯ 7-ОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ 108
6.1. Выявление природных штаммов с дефектными геномными
островами, связанными с вирулентностью или пандемично-
стью 108-111
6.2. Вариабельность геномов профагов СТХср nRSlcp 111-124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125-128
ВЫВОДЫ 129-130
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 131-153
кДа МГЭ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
килодальтон
мобильные генетические элементы
остров патогенности
полимеразная цепная реакция
п. н. - пар нуклеотидов
РГА/П - растворимая гемагглютинин/протеаза
тл.н.
attRS
ctxAB
тысяча пар нуклеотидов
ген, кодирующий биосинтез дополнительного холерного токсина
участок хромосомы, в который внедряется фаг СТХ(р
гены, кодирующие биосинтез холерного токсина
СТХф - умеренный нитевидный бактериофаг, несущий гены ctxAB
холерный токсин
экзополисахарид (от англ. exopolysaccharide)
hapA - ген, кодирующий синтез растворимой гемагглютинин/протеазы
LuxO - регуляторный белок системы quorum sensing
luxX, luxS,
hns, pepA - регуляторные гены
MSHA - маннозо-чувствительные гемагглютинирующие пили адгезии
англ. mannososensitive hemagglutinin)
OmpU, OmpT
RSl(p
белки - порины внешней мембраны V. cholerae
кластер генов, ответственных за биосинтез рРНК
умеренный нитевидный бактериофаг
rtxA - ген, кодирующий синтез токсина RTX холерного вибриона
SI - суперинтегрон (от англ. superintegron)
TCP - токсин корегулируемые пили адгезии (от англ. toxin-coregulated pilus)
tcpA - ген, кодирующий биосинтез основной субъединицы токсин-коре-
гулируемых пилей адгезии
toxR - глобальный регуляторный ген
VPI - МГЭ, "остров патогенности" (от англ. Vibrio pathogenicity island)
VSP - МГЭ, "остров пандемичности" (от англ. Vibrio seventh pandemic
island)
zot - ген, кодирующий синтез токсина зонального поглощения
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Механизм эволюции патогенных бактерий - одна из центральных проблем медицинской микробиологии. Решение этой проблемы позволяет выяснить причины генетического разнообразия возбудителей инфекционных болезней и провести прогнозирование появления новых эпидемически опасных вариантов. Vibrio cholerae, имеющий повышенную эпидемическую значимость, является возбудителем' холеры, острого диарейного заболевания с массивной дегидратацией, унесшего миллионы человеческих жизней за семь известных пандемий: Распространение холеры во многих странах мира определяет реальную возможность ее завоза на территорию России.' Непосредственным напоминанием об этой угрозе являются недавние эпидемические вспышки холеры'в Дагестане (1994 г., 1998 г.), Дальнем-Востоке и Приморье (1999 г.), Татарстане (2001 г.), Ростовской области (2005 г.), а также спорадические случаи заболевания^ (Челябинск, 2000 г.; Калмыкия, 2002 г.; Башкортостан, 2004 г., 2008 г; Тверская область 2005 г.; Мурманск, 2006 г.). Согласно современным представлениям, в пределах вида V. cholerae образовалось три эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы 01-серогруппы классического биовара, вызвавшие; видимо, первые 6 пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.), холерные вибрионы 01-серогруппы биовара эльтор - возбудитель текущей, 7-ой, пандемии (с 1961 г. по настоящее время) и внезапно появившийся в 1992 г. высоковирулентный штамм V. cholerae 0139-серогруппы, с которым связывали начало 8-ой пандемии холеры.
Поскольку в современный период продолжается 7-ая пандемия холеры, ее возбудитель остается в центре внимания многих исследователей. Секвенирование
8 генома V. cholerae биовара эльтор< (Heidelberg J.F et al., 2000) позволило выявить
следующие его основные особенности: а) в отличие от многих других патогенов в
клетках V. cholerae имеется 2 кольцевые хромосомы, различающиеся по размеру и
функции; б) основные гены вирулентности возбудителя входят в состав различных
мобильных генетических элементов (двух профагов и пяти геномных островов),
локализованных в основном на большой хромосоме.
Мобильность этих элементов и' нестабильность их- геномов, а также
изменение в настоящее время экологии if иммунного статуса человека во многих
регионах мира, включая- Россию, - все это создает предпосылки для образования
штаммов с ранее неизвестными свойствами. Такая ситуация, диктует
необходимость выяснения основных направлений эволюции возбудителя холеры
эльтор в современный период. Однако для получения такой информации
необходимы полные сведения об-эволюции генома этого возбудителя в недалеком
прошлом. В этой' связи очевидна актуальность исследований, направленных на
решение этой проблемы. Несмотря на большой интерес исследователей к этому
вопросу, пока нет единой точки зрения на происхождение возбудителя холеры
эльтор. При анализе 2-х предпандемических и 3-х пандемических- штаммов
выявлены лишь особенности генетической организации этих изолятов (Dziejman
М. et al., 2002). Полученные ранее сведения о структуре и функции генома
предпандемических штаммов явно недостаточны. Практически отсутствуют
данные о функции островов пандемичности VSP-1 и VSP-2, имеющихся в геноме
клинических штаммов, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Информация
о геномных вариациях природных штаммов V. cholerae биовара эльтор,
циркулирующих на разных территориях в период эпидемического неблагополучия
9 по холере, является таюке неполной. Получение новых фундаментальных сведений
о фенотипических и генетических особенностях штаммов, выделенных до и во
время 7-ой пандемии холеры эльтор, позволит получить более полную картину об
эволюции этого возбудителя и выяснить механизмы, лежащие в основе адаптации
этого патогена к меняющимся условиям внешней среды. Эти сведения будут
служить основой для решения такой важной прикладной задачи, как паспортизация
штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб", а также для
разработки новых средств диагностики и дифференциации штаммов с разным
эпидемическим потенциалом.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выявление фенотипических и генетических особенностей предпандемических и пандемических штаммов V. cholerae биовара эльтор.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Провести сравнительный анализ различных фенотипических свойств
предпандемических и пандемических штаммов холерных вибрионов биовара
эльтор.
2. Изучить распространенность профагов и геномных островов, связанных с
вирулентностью и персистентностью, среди предпандемических штаммов V.
cholerae биовара эльтор.
Исследовать экспрессию генов вирулентности и персистенции, локализованных в геноме предпандемических штаммов.
Изучить распространенность островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди различных пандемических изолятов; определить роль последних в жизнеспособности этих штаммов.
5. Провести молекулярное типирование штаммов V. cholerae биовара эльтор,
выделенных до и в период 7-ой пандемии холеры, для определения их филогенетических связей.
6. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов V. cholerae биовара
эльтор, выделенных на разных территориях во время эпидосложнений по холере.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
Показано, что предпандемические штаммы V. cholerae биовара эльтор, независимо от времени их выделения (1910 г. и 1937 г.) и вирулентности, не отличались от штаммов, изолированных во время 7-ой пандемии, по серологическим, биохимическим свойствам и резистентности к диагностическим холерным бактериофагам. Вместе с тем впервые выявлено, что предпандемические штаммы, в отличие от пандемических, не имели устойчивости к изученным антибиотикам.
При сравнительном анализе геномов предпандемических и пандемических штаммов обнаружено, что регуляторные гены toxR, luxX, IwcS, hns ирерА, входящие в состав различных систем регуляции, являются наиболее древними. Впервые определено присутствие в геноме всех изученных предпандемических штаммов острова персистенции в окружающей среде ЕРІ, что указывает на его древнее происхождение. Установлено наличие в геноме вирулентных предпандемических штаммов двух копий профага СТХф и дефектного острова патогенности VPI-2, лишенного одного (гер1803) или двух (папН, гер1803) тестируемых генов. Показано широкое распространение двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры, что подтверждает их важную роль в формировании пандемического потенциала у
11 этого возбудителя. Новыми являются данные о генетическом разнообразии
природных клинических штаммов, связанном с нестабильностью геномов VPI-2, а
также VSP-1 и VSP-2. Впервые обнаружено, что риботипирование и RAPD-ПЦР-
типирование позволяют дифференцировать предпандемические и пандемические
штаммы V. cholerae биовара эльтор.
Приоритетное значение имеют результаты, полученные при анализе функций геномов мобильных элементов. Выявлен высокий уровень экспрессии генов msh, локализованных в составе ЕРІ, что свидетельствует об участии этого геномного острова в образовании биопленки предпандемическими штаммами. Впервые экспериментально доказана более высокая жизнеспособность пандемических штаммов в водной среде по сравнению с предпандемическими изолятами, что с высокой вероятностью связано с присутствием в геноме первых островов пандемичности VSP-1 и VSP-2.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:
Создан комплекс мультиплексных ПЦР, предназначенных для выявления в геноме штаммов V, cholerae основных генов вирулентности и персистенции. На основе разработанных тест-систем оформлены методические рекомендации "Мультиплексный ПЦР-анализ для изучения генетического разнообразия и выявления атипичных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор", которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 10 от 18 декабря 2007 г.) и утверждены директором института 18 декабря 2007 г.
Создана коллекция, состоящая из 18 авторских штаммов V. cholerae биовара эльтор, которая включает штаммы с различным набором генов вирулентности и пандемичности. Эти штаммы могут быть использованы для выяснения и уточнения
роли мобильных элементов в проявлении вирулентных свойств штаммов и их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. Штаммы коллекции депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".
Полученная информация о наличии или отсутствии в геноме 124 природных штаммов 20-25 различных генов будет использована для геномной паспортизации штаммов из Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Штаммы V. cholerae биовара эльтор, выделенные до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры, не различаются по продукции 01-антигена, термолабильного гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы, белков внешней мембраны OmpU и OmpT, а также чувствительности к холерным диагностическим эльтор и классическим бактериофагам. Вместе с тем предпандемическпе штаммы имеют выраженные отличия от пандемических относительно их резистентности к изученным антибиотикам.
В геноме авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов присутствуют общие структурные {hapA, rtxA, attRS) и регуляторные (toxR, hvcO, luxS, hns, рерА) гены, а также» остров персистенции в окружающей среде ЕРІ. Предпандемические штаммы способны образовывать биопленку, что связано с эффективной экспрессией генов, контролирующих подвижность (mot), биосинтез экзополисахарида (eps) и маннозочувствительных пилей адгезии (msh), последние из которых входят в состав ЕРІ.
3. Геном вирулентных предпандемических штаммов содержит две копии профага
СТХф, а также два острова патогенности VPI-1 и YPI-2, из которых последний
14 молодых учёных и специалистов "Окружающая среда и здоровье" (Суздаль, 2005 г.)
и Всероссийской конференции "Фундаментальная наука и клиническая медицина"
(Санкт-Петербург, 2007 г.).
ПУБЛИКАЦИИ:
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 цитируемых работ, из них 54 отечественных и 165 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 153 страницу. Текст иллюстрирован 14 таблицами и 15 рисунками.
13 является дефектным. Ключевые гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, входящие в
состав СТХф и VPI-1, эффективно экспрессируются у предпандемических
штаммов, что обеспечивает развитие экспериментальной холерной инфекции у
модельных инфицированных животных.
Вирулентные штаммы, выделенные во время 7-ой пандемии холеры, имеют характерные генетические особенности, связанные с присутствием в их геноме дополнительных мобильных элементов - профага RSl(p и двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2. Уровень выживаемости в водной среде вирулентных пандемических штаммов, содержащих в геноме VSP-1 и VSP-2, значительно выше по сравнению с таковым у вирулентных штаммов, изолированных до начала текущей пандемии и не имеющих этих геномных островов.
Пандемические штаммы V. cholerae биовара-эльтор, выделенные из разных источников (больные, носители, внешняя среда) на различных территориях в эпидемически опасные периоды, являются генетически неоднородными вследствие утраты геномов мобильных элементов (СТХф, ЯБІф, VSP-1 и VSP-2) или их отдельных генов (СТХф и VPI-2), а также в результате полиморфизма гена tcpA, входящего в состав VPI-1. Вариабельность генома профага СТХф лежит в основе изменения вирулентных свойств различных штаммов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:
Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2004, 2005, 2007 гг.), а также на Всероссийской научно-практической конференции
