Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза 12
ГЛАВА 2. Материалы и методы 26
2.1. Штаммы микроорганизмов 26
2.2. Антигены 29
2.3. Реактивы и буферные растворы 29
2.4. Кулыуральные и питательные среды .. 31
2.5. Условия гибридизации , 31
2.6. Биохимические методы 33
2.7. Приготовление пероксидазных конъюгатов. 34
2.8. Методы иммуноанализа 35
2.9. Оборудование и приборы 39
2.10. Лабораторные животные 40
2.11. Методы статистического анализа 40
ГЛАВА 3. Получение гшридом-продуцентов моноклональных антител 41
3.1. Изучение иммунореактивности белково-полисахаридного комплекса Y. enterocolitica 41
3.2. Подбор оптимальной схемы иммунизации животных. 45
3.3. Эффективность гибридизации, клонирования и реклонирования. 49
3.4. Стабильность продуцирующих моноклональные антитела гибридом in vitro и in vivo 57
ГЛАВА 4. Характеристика кишечноиерсиниозных моноклональных антител 63
4.1. Выделение и очистка 63
4.2. Специфическая активность 65
4.3. Иммунохимические свойства 69
ГЛАВА 5. Разработка экспериментальных иммуноферментных тест - систем для обнаружения, идентификации и серотипироваїмяу. enterocolitica ... 82
5.1. Твердофазный иммуноферментный анализ . .. 82
5.2. Дот-иммуноанализ 87
5.3. Серотипирование свежевыделенных штаммов Y. enterocolitica 03, 09, 04,32, 05,27, 06,30 сероваров в ТИФА и ДИА 90
Заключение 95
Выводы 105
Список литературы 107
- Реактивы и буферные растворы
- Оборудование и приборы
- Изучение иммунореактивности белково-полисахаридного комплекса Y. enterocolitica
- Твердофазный иммуноферментный анализ
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Кишечный иерсиниоз принадлежит к числу трудно диагностируемых острых инфекций и часто регистрируется под видом других заболеваний, таких как аппендицит, инфекционный гепатит, острая респираторная вирусная инфекция, скарлатина, холецистит и др. [28, 123]. Большой научный и практический интерес к кишечному иерсиниозу обусловлен широким распространением возбудителя в природе, резистентностью его к низким температурам, появлением не только спорадических заболеваний, но и крупных вспышек в организованных коллективах [21]. Трудности в постановке клинического диагноза, длительность бактериологического выделения возбудителя, перекрестная иммунореактивность с рядом других микроорганизмов являются основанием для совершенствования методов и приемов диагностики этой инфекционной болезни.
Существующие в настоящее время кишечноиерсиниозные
иммунодиагностические тест-системы преимущественно сконструированы на основе кроличьих антисывороток, содержащих поликлональные антитела, или антигенов Yersinia enterocolitica. Разработаны препараты для реакции агглютинации (РА) [16, 19, 23, 24, 109-111], эритроцитарные [34, 55, 56, 127-130], коагглютинирующие [29, 53, 95] и латексные [5, 34, 121] диагностикумы. Однако указанные препараты не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к их информативности, чувствительности и специфичности. Ввиду тесного антигенного родства возбудителя кишечного иерсиниоза с представителями родов Yersinia, Brucella, семейства Enterobacteriaceae и др. при получении специфических сывороток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, приводящие к снижению титра антител. Источники получения сывороток, как правило, ограничены, и они трудно поддаются стандартизации. Эти недостатки можно устранить с помощью моноклональных антител (МКА) с использованием гибридомной биотехнологии.
МКА имеют ряд существенных преимуществ: они обладают строгой специфичностью; имеют одинаковую структуру, идиотип, аллотип, аффинность и авидность, что позволяет их легко стандартизировать [1, 47-49, 91]; доступны в
7 достаточно больших количествах при культивировании продуцентов МКА -
гибридомных клеток - in vitro и in vivo; титры МКА в биологическом сырье
(асцитической жидкости) обычно выше, чем в поливалентных гипериммунных
сыворотках.
В 80-90 годах прошлого столетия за рубежом [145, 183, 230, 235, 236] получены МКА к отдельным антигенам Y. enterocolitica, в том числе к вид о- и серовароспецифическим, которые, в основном, используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с изучением антигенной структуры возбудителя. Лишь в последние 5 лет отечественным ученым удалось создать гибридомы, синтезирующие МКА к 09 серовару Y. enterocolitica [2, 70]. На основе МКА к 09 серовару разработан и испытан в лабораторных условиях иммунофлуоресцентный диагностический препарат [2]. Вместе с тем в распоряжении российских специалистов отсутствуют диагностические тест-системы на основе МКА к не менее важному с эпидемиологической точки зрения 03 серовару, а также к некоторым другим серовариантам кишечноиерсиниозных бактерий, циркулирующих в природе. В связи с этим получение отечественного набора МКА, имеющих научно-прикладное значение, особенно в перспективе создания на их основе диагностических тест-систем для обнаружения, идентификации и серотипировання кишечноиерсиниозных бактерий, имеет весьма актуальное значение.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам возбудителя кишечного иерсиниоза, изучение их свойств и разработка на основе набора МКА экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления, идентификации и серотипировання Y. enterocolitica.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Подобрать оптимальную схему иммунизации мышей растворимым и корпускулярными кишечноиерсиниозными антигенами для получения максимального количества специфически стимулированных спленоцитов.
2, Модифицировать условия культивирования гибридом с целью повышения эффективности гибридизации.
Получить клеточные линии гибридом, стабильно продуцирующих МКА к Y. enterocolitica in vitro и in vivo.
Изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.
Определить с помощью МКА антигенные детерминанты, отвечающие за специфичность отдельных сероваров Y. enterocolitica, установить их природу.
Сконструировать и апробировать в лабораторных условиях экспериментальные моноклональные иммуноферментные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработаны оптимальные схемы иммунизации мышей BALB/c - источники иммунных спленоцитов для гибридизации с сингенными клетками мышиной миеломы и усовершенствованы отдельные этапы гибридомной технологии, повышающие эффективность получения стабильных антителопродуцирующих гибридом.
Получен оригинальный набор МКА, обладающих избирательной специфичностью в отношении бактерий Y. enterocolitica и его отдельных серовариантов, в том числе, имеющих эпидемиологическое значение.
Впервые установлено, что сероваропринадлежность штаммов Y. enterocolitica может определяться не только углеводами О-специфических боковых цепей бактериального липополисахарида или его коровой части, но и антигенными детерминантами белковой природы, экспрессия которых не зависит от наличия или отсутствия плазмиды pCad.
Новыми являются сведения о том, что общий для патогенных иерсиний термостабильный белок с м.м. (38 (40) ± 2) кДа содержит как видо-, так и серовароспецифические эпитопы возбудителя кишечного иерсиниоза,
Впервые выделена стабильная линия гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, специфически взаимодействующие одновременно с двумя наиболее распространенными в России 03 и 09 серовариантами кишечноиерсиниозных бактерий.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
- Создана клонотека стабильных гибридных клеточных линий, синтезирующих МКА к антигенам Y. enterocolitica 03; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 09 сероваров, которые могут быть использованы для изучения антигенной структуры
9 возбудителя н конструирования иммунодиагностических препаратов с целью лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза. Три линии гибридом, продуцирующих МКА к Y. enterocolitica 03 серовара (IG7.2), к Y. enterocolitica 09 серовара (Шю.і) и одновременно к обоим указанным сероварам (ІСю.і), депонированы в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур (г, С.-Петербург) под номерами РККК(П) 680Д, РККК(П) 678Д, РККК(П) 679Д.
Образцы МКА к видо- и серовароспецифическим эпитопам возбудителя кишечного иерсиниоза успешно прошли лабораторные комиссионные испытания в соответствии с программой, утвержденной директором РосНИПЧИ "Микроб" 8 января 2003 г.
Экспериментальные иммуноферменгные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica в ТИФА и ДИА, сконструированные на основе набора МКА, апробированы на коллекционных и свежевыделенных штаммах Y. enterocolitica от больных людей и из объектов с
/Л
внешней среды. \!/Щ -Л
- Подана заявка на изобретение «Штамм гибридных культивируемых клеток [
животных Mus musculus L. РККК (П) 679Д - продуцент моноклональных антител, і
специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica 03 и 09
сероваров» в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам
и товарным знакам.
По материалам диссертации составлены методические рекомендации «Идентификация возбудителя кишечного иерсиниоза 03 и 09 сероваров в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (Протокол № 7 от 23 сентября 2003 г.) и утвержденные директором института 23,09.2003 г.
Материалы диссертации используются при чтении лекций по иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ "Микроб".
10 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Белково-полисахаридный комплекс (ВПК) Y. enterocolitica 03 серовара, выделенный методом уксуснокислого гидролиза, содержит родо-, видо- и серовароспецифические антигенные детерминаты.
Оптимизация схем иммунизации линейных мышей BALB/c кишечноиерсиниозными антигенами и условий селективного отбора гибридных клеток повышает эффективность слияния лимфоцитов в 10-100 раз и число гибридом, продуцирующих моноклональные антитела разной специфичности, в среднем в 10-20 раз.
Использование спленоцитов линейных мышей, иммунизированных корпускулярным антигеном Y. enterocolitica 03 серовара, при слиянии с сингенными мышиными миеломными клетками приводит к образованию гибридом, секретирующих моноклональные антитела не только к выше указанному, но и к ряду других серовариантов кишечноиерсиниозных бактерий.
Серовароспецифические кишечноиерсиниозные моноклональные антитела направлены к антигенным детерминантам не только углеводной, но и белковой или гликопептидной природы.
Видоспецифические эпигоны Y. enterocolitica локализованы на термостабильном полипептиде, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий. Его синтез не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов.
Сконструированные на основе МКА экспериментальные г иммуноферментные тест-системы позволяют проводить индикацию, '-идентификацию и серотипирование штаммов К enterocolitica с чувствительностью 3,1 104-2,3 105м.к./млвТИФАи7,8- 103-2,5 105 м.кУмл в ДИА в зависимости
от сероваропринадлежности микробов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на:
Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции МЗ РФ, Астрахань, 2001г.
Международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции, Алматы, 2001 г.
. .11
Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской ПЧС, Махачкала, 2002 г.
69-й итоговой научной конференции сотрудников КГМУ и научной сессии отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, Курск, 2004 г.
итоговых научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб", Саратов, 2000, 2001,2003 гг.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 главы), собственных исследований (4 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 242 источника, в том числе 114 зарубежных. Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста и включают в себя 27 таблиц, 10 рисунков.
Реактивы и буферные растворы
Полимеразная цепная реакция имеет неоспоримое преимущество по сравнению с ДНК-зондированием. Метод ПНР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью (позволяет обнаружить до 102 м.кУмл [174], а при гнездной ПЦР 10-30 м.кУмл [178]), обладает высокой специфичностью и экспрессностью (ответ в течение 7 ч). Диагностическая точность метода составляет 96,2 % [61]. A.M. Королюк с соавт. [57] для генетической идентификации штаммов Y. enterocolitica атипичных в биохимическом и серологическом отношении предложили ПЦР с использованием универсальных праймеров. Ими были установлены ПЦР-паттерны 13 эталонных штаммов. Получены олигонуклеотидные праймеры к локусу hemH-gsk [154], содержащему структурные гены ЛПС, к генам yadA [ 140, 172, 178, 180], IcrV [218], ЫгА [ 189], virF, ail [ 144, 162, 173, 174, 199], inv [162, 174, 216], к генам энтеротоксинов - ystA, ysi&, ystC[\b2\ к гену фимбрий - ту/[162], фосфолипазы А и В -ур1А,ур!& [224]. ПЦР позволяет быстро и точно диагностировать кишечный иерсиниоз. Более информативным является метод геномной ПЦР-дактилоскопии с использование определенных комбинаций праймеров [209]. Однако и при выполнении ПЦР приходится сталкиваться с рядом проблем, связанных с вредным воздействием на организм обслуживающего : 24 персонала физических и химических факторов, адаптации метода в условиях проведения массовых анализов, присутствием ложноположительных результатов. Кроме того, для проведения ПЦР необходимо наличие дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.
Для диагностики кишечного иерсиниоза разработан ряд иммунодиагностических препаратов - диагностические агглютинирующие сыворотки для РА [102], сухие эритроцитарные диагностикумы для выявления антител к Y. enterocolitica и ее антигенов [54, 102], коагтлютинирующие диагностикумы [102], латексные диагностикумы [5], сыворотки для МФА [117]. Они достаточно информативны, чувствительны и специфичны, служат целям экспресс-диагностики. Однако необходимо отметить, что существующие в настоящее время диагностические препараты преимущественно сконструированы на основе адсорбированных моновалентных сывороток, содержащих поликлональные антитела. Антисыворотки имеют несколько недостатков: их титры невысоки, антитела гетерогенны, источники получения ограничены. Существуют определенные трудности стандартизации сывороток. Для получения моноспецифических сывороток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, что приводит к выделению антисывороток с низким титром антител. Эти недостатки можно устранить с помощью гибридомной технологии получения моноклональных антител [181, 182]. МКА имеют ряд преимуществ по сравнению с адсорбированными сыворотками: они обладают строгой специфичностью к отдельным антигенным детерминантам, причем каждый клон непрерывно делящихся гибридом продуцирует иммуноглобулины одного класса, аллотипа, аффинности и авидности. МКА имеют одинаковые вариабельные области, структуру, идиотип. МКА доступны в относительно больших количествах при сравнительно низкой себестоимости. Поэтому они наиболее перспективны для создания специфических и стандартных иммунодиагностических препаратов, предназначенных для идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза и его серотипирования.
В последние два десятилетия полунены МКА к различным антигенам Y. enterocolitica в частности к ЛПС микробов 03 и 09 сероваров [2, 145, 169, 230, 236]. В ТИФА была показана их серовароспецифичность независимо от плазмидного состава штаммов. Иммуноблоттинг с очищенным препаратом ЛПС продемонстрировал, что МКА специфичные к обоим сероварам взаимодействовали с коровой областью ЛПС, а серовароспецифические МКА были направлены к эпитопу в области О-боковой цепи ЛПС, причем было отмечено, что МКА к ЛПС 09 серовара не выявляли ЛПС других грамотрицательных бактерий, включая Я abortus, имеющих общие антигенные детерминанты с К enterocoUtica 09 [236]. Получены МКА, взаимодействующие в ТИФА с культурами Y. enterocoUtica и Y. pseudotuberculosis, содержащими плазмиду pYV. В иммуноблоттинге данные МКА специфически реагировали с белками внешней мембраны - YopE, YopD, YadA [163, 164, 176, 192, 219, 228, 230, 235], играющими основную роль у энтеропатогенных иерсиний в патогенезе [166]. Кроме того, были получены МКА к иммунодоминантному белку с м.м. 60 кДа [242], МКА к железо-регулируемым белкам Y. enterocoUtica 08 серовара [183], а также видоспецифические МКА и МКА к 03 и 09 сероварам Y. enterocoUtica [30, 145]. Причем отмечено, что видоспецифические МКА идентифицировали олигосахарид кора либо липид А, а серовароспецифические МКА - О-боковые цепи ЛПС [145]. Для метода флуоресцирующих антител предложены МКА к ЛПС Y. enterocoUtica 03; 05,27; 08; 09 сероваров меченые флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ) [2, 170, 221, 227].
Таким образом, полученные к настоящему времени МКА к антигенам возбудителя кишечного иерсиниоза используются при изучении антигенной структуры бактерий, перекрестной реактивности с антигенами других микроорганизмов. Тем не менее, создание новых клонов гибридом, продуцирующих МКА с уникальными характеристиками, применение которых может значительно расширить наши представления об особенностях антигенной структуры Y. enterocoUtica, выделить наиболее перспективные из них для разработки иммунодиагностических тест-систем, в том числе не только для идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза, но и его серотипирования, остается весьма актуальной задачей для фундаментальных и прикладных научных разработок в области микробиологии и инфекционной иммунологии. Штаммы микроорганизмов получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М», РосНИПЧИ «Микроб»). В работе использовано 95 пггаммов микроорганизмов. Из них 55 штаммов К enterocolitica, принадлежащих 31 типовым серотипам (таблица 1), 20 штаммов Y. pseudotuberculosis (6 референтных штаммов 6-ти серотипов - I, II, III, IV, V, VI и 14 свежевыделенных штаммов - 410, 416, 418, 548, 592, 596, 597, 600, 602, 616, 617, 627, 644, 649), 5 штаммов Y. pestis (EV НИИЭГ, 231, КМ218, КМ217, КМ225); 15 штаммов гетерогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae: 5 штаммов Escherichia coli (В, 3133 (серотип 0-111-ВН), 4295 (серотип 0-26), 12226 (серотип 0-55), 60888 (серотип 0-151)), 5 штаммов Shigella sp. (Shigella sonnei 714, Shigella flexneri 17, 2696, Shigella newcastla (подвид S. flexneri) 59752, Shigella Schmitz-Stutzera (подвид Shigella dysenteriae) 36), 5 штаммов Salmonella sp. (Salmonella typhi 503, S. paratyphi A 27, S. paratyphi В 493, Salmonella enteritidis ВОЗ, Salmonella typhimurium 4,5,12).
Штаммы Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis и других представителей семейства Enterobacteriaceae выращивали при температуре 37 С в течение 48 ч, штаммы Y. pestis - при 28 С 48 ч. Бактериальную массу смывали ЗФР. Штаммы I группы патогенности (Y. pestis) обеззараживали 4 % формалином в течение 1 ч при комнатной температуре, штаммы III-IV групп патогенности, включая бруцеллезную и туляремийную вакцины - мертиолятом натрия (1:1000) при 37 С в течение 24 ч, с последующим проведением контроля специфической стерильности. Все работы, связанные с культивированием микроорганизмов, выполняли в соответствии с требованиями Санитарных правил СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» [8], СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» [9],
Оборудование и приборы
Для этого на расчерченную нитроцеллюлозную мембрану (Membranfilter 100 с диаметром пор 0,22 мкм, Schleicher und Schuell, Германия) наносили по 2 мкл раствора антигена (в концентрации 10 мкг/мл), бактериальной взвеси (в концентрации 1 109 м.кУмл). Нанесенные пробы фиксировали при 110 С в течение 10 мин. Для блокировки свободных сайтов связывания мембрану погружали в блокирующий буфер (0,5 % раствор БСА в PBS). Блокировку проводили при 37 С в течение 30 мин. Затем мембрану отмывали PBS 3 раза по 3 мин на шейкере. Вносили раствор МКА, меченных пероксидазой хрена, в рабочем разведении в буфере для конъюгата. Мембрану инкубировали при 37 С 1 ч, в дальнейшем отмывали 6 раз PBS и вносили свежеприготовленный субстрат (0,0468 % ДАБ в PBS, 0,01 % Н202). Инкубирование проводили в течение 15 мин на шейкере, реакцию останавливали промыванием мембраны дистиллированной водой. Учет результатов проводили визуально по интенсивности окрашивания специфических пятен от светло- до темно-бурой окраски.
В непрямом варианте ДИА использовали немеченые антитела, разведенные в PBS. Мембрану инкубировали с ними 30 мин при 37 С. После троекратной отмывки мембран вносили раствор антивидовых Ig, меченных пероксидазой хрена, в рабочем разведении и инкубировали 1 ч при 37 С. От несвязавшихся молекул конъюгата мембрану отмывали 6 раз и вносили субстратную смесь. Нитроцеллюлозные мембраны высушивали и хранили защищенными от света.
Изучение иммунохимических свойств МКА проводили с помощью метода иммуноблоттинга по Н. Towbin et at [229].
Иммуноблоттинг. После электрофоретического разделения белков в ПААГ проводили электрофоретический перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану (Membranfilter 100 с диаметром пор 0,45 мкм, Schleicher und Schuell, Германия). Нитроцеллюлозную мембрану, смоченную буфером для электропереноса, помещали на листы фильтровальной бумаги (Whatman, США), смоченные тем же буфером, на мембрану накладывали гель и вторую фильтровальную бумагу. Электроперенос белков осуществляли с геля на мембрану от катода к аноду при 70 мА в течение 1,5 ч. Белки на мембране фиксировали при ПО С в течение 10 мин. Затем нитроцеллюлозную мембрану с белковыми репликами помещали в блокирующий буфер на 30 мин при 37 С для насыщения свободных сайтов связывания индифферентным белком. Фильтры отмывали в PBS троекратно по 10 мин на шейкере. Затем вносили раствор МКА в PBS в рабочем разведении и инкубировали 1 ч при 37 С (или при 4 С 18 ч) с последующей отмывкой мембраны от несвязавшихся антител 3 раза по 10 мин на шейкере. Проявление специфических белков на нитроцеллюлозной мембране проводили с помощью антимышиных диагностических Ig, меченных пероксидазой, в разведении 1:1000 в буфере для конъюгата. После шестикратной отмывки блоты помещали в субстратную смесь (0,0468 % ДАБ в PBS, 0,01 % Н2О2). Специфические полосы проявлялись в течение 15 минут на шейкере. Для предотвращения дальнейшего окрашивания блотов мембрану отмывали несколько раз дистиллированной водой. Блоты высушивали и хранили защищенными от света. Учет результатов проводили визуально.
Работы по гибридизации, стерилизации сред и растворов, культивированию клеток миелом и гибридом осуществляли в биоламинаре с горизонтальным потоком воздуха ЛБ-Г (Россия). Клетки просматривали при помощи инвертированного микроскопа "Diavert" (Leitz, Германия). Клеточные культуры выращивали в С02-инкубаторе "Labomed" (Knott Electronic, Германия). Клетки миеломных и гибридомных линий хранили в криогенных сосудах Дьюара СК-40 в жидком азоте. Клеточные линии культивировали в 24-, 48-, 96-луночных планшетах для культуры клеток (Costar, США, Flow Laboratories, Великобритания) и в 50 мл культуральных пластиковых сосудах (Costar, США). Клетки хранили в 1,8 мл пробирках для криоконсервации (Costar, США). Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Осаждение клеток осуществляли на центрифуге К70Д (MLV, Германия) в 50 мл центрифужных пробирках (Costar, США). Среды и растворы стерилизовали через свечи Шамберлена и нитроцеллюлозные мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Владипор», Россия). Иммуноферментный анализ проводили в пластиковых 96-луночных планшетах для постановки ТИФА (ВНИИМедПолимер, Россия). Результаты анализа учитывали с помощью многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan (Flow Laboratories, Великобритания). Концентрацию белков определяли на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия). Осаждение Ig проводили на центрифуге K24D (MLV, Германия). Для проведения электрофореза в ПААГ использовали приборы для вертикального электрофореза LKB 2050 Midget (LKB, Швеция), MiniVagoan (Vagos, Эстония), источник постоянного тока ПЭФА-1 (Россия). Иммуноблоттинг проводили в аппарате для полусухого электропереноса с графитовыми электродами. Фиксацию антигенов на нитроцеллюлозной мембране осуществляли при ПО С в сухожаровом шкафу SPT-200 (Zeamil Horyzont, Польша). Встряхивание с реагирующими агентами проводили на шейкере Titertek (Flow Laboratories, Великобритания). Для приготовления буферных растворов, реактивов для проведения биохимических и иммунохимических работ применяли рН-метр Digital ionaliser/501 (Orion), весы Sartorius (Германия), весы торсионные ВТ-500 (Россия), магнитную мешалку ММ-5 (Россия). При постановке биохимических анализов применяли 1,5 мл пробирки "Eppendorf (Германия), одно- и многоканальные пипетманы, центрифужные пробирки. Препараты и среды хранили при 4 С в бытовых холодильниках "Саратов" (СЭПО, Россия), при минус 20 С в морозильниках "Саратов" (СЭПО, Россия). 2.10. Лабораторные животные Донорами иммунных лимфоцитов и иммуноасцитической жидкости служили мыши инбредной линии BALB/c. Для приготовления фидерных клеток использовали спленоциты аутбредных мышей. Животные в возрасте 8-12 недель были получены из Сектора по разведеншо экспериментальных животных лаборатории биомоделей РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов).
Изучение иммунореактивности белково-полисахаридного комплекса Y. enterocolitica
Для клонирования было отобрано 17 клонов гибридом, синтезирующих антитела к 03 серовару и 5 клонов, синтезирующих антитела к 09 серовару. Клонирование проводили методом предельного (лимитирующего) разведения в 96-луночных планшетах. Для этого 1-2 мкл суспензии гибридомных клеток из лунки 96-луночного планшета разводили в 10 мл гибридомной среды и вносили в лунки культурального планшета, содержащего питающие (фидерные) клетки. Такое количество клеточной суспензии соответствовало 100-150 клеток на один планшет (подсчет жизнеспособных клеток вели в камере Горяева с окраской 0,1 % раствором трипанового синего). При этом эффективность клонирования (отношение количества лунок с клонами к общему числу засеянных лунок) составила 43,3 % - 98,3 % (в среднем (76Д ± 8,5) %), среди которых 2 % - 37,3 % (в среднем (16,2 ± 6,1) %) содержали кластеры клеток, синтезирующих антитела различной специфичности. На 14-й день после клонирования клетки занимали 100 % поверхности лунок. Тестирование культуральной жидкости лунок с выросшими клонами гибридом проводили на 7-ми типовых штаммах Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров, 6-ти типовых штаммах Y. pseudotuberculosis, Y. pestis EV НИИЭГ, S. typhi 503, E. со/г 3133. Результаты тестирования после клонирования гибридом представлены в таблице 10.
В результате клонирования гибридом были отобраны: 1 клон (1С]( ), синтезирующий MICA к 03+09 сероварам Y. enterocolitica, 10 клонов (IG4, IG7, 4DS, 6Е7, 6Eg, 6Е10, 6F5, 6F6, 6F7, 6Fg) - к 03 серовару, 18 клонов (1Вю, IC3, 1Сд, 1С„, 1D3, 1D7, 1Е2, 1F2, 1G5, 2В„, 2D2, 2Е1Ь 2F2, 2G3, 2G4, 2G5, 2G6, 5G ) - к 09 серовару, 7 клонов (2Сю, 2D9, 2F4, 2Fio,2Gio, 5E9, 6D5) - к 04,32 серовару, 2 клона (1С2, 2С9) - к 05,27 серовару, 2 клона (ЗСП, 1С6) - к 06,30 серовару, МКА 1Сб взаимодействовали, кроме того, с Y. pseudotuberculosis VI. 12 клонов синтезировали МКА, перекрестно-реагирующие с Y enterocolitica 09 серовара и с гетерогенными микроорганизмами (таблица 10): 1 клон (1В4) -cY. pseudotuberculosis VI и К pestis, 1 клон (1Вц) - с Y. pseudotuberculosis I, VI и Y. pestis, 1 клон (IFJQ) - с Y. pseudotuberculosis IV, 1 клон (lBg) - с Y. pseudotuberculosis VI и S. typhi, 6 клонов (1В3, ІВ7ї Ш9, 1F3, 2Е2, 2G7)- с Y pseudotuberculosis VI, 1 клон (7С7) синтезировал антитела ко всем сероварам Y. enterocolitica, 1 клон (8G7) - ко всем представителям рода Yersinia.
Анализ результатов тестирования указывает на наличие в культуральной жидкости гибридом, полученных при иммунизации мышей БГЖ, МКА, направленных к эпитопам, общим для бактерий 03 и 09 сероваров, к видо- и родоспецифическим антигенным детерминантам.
Установлено, что гибридомы, полученные при гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных клетками Y. enterocolitica 03 серовара, продуцировали МКА к 04,32; 05,27 и 06,30 сероварам, что говорит о присутствии у штаммов Y. enterocolitica 03 серовара антигенных эпитопов 04,32; 05,27 и 06,30 сероваров.
Наличие перекрестных реакций с другими микроорганизмами у МКА гибридом, полученных при слиянии лимфоцитов мышей, иммунизированных Y. enterocolitica 09 серовара, вероятно, объясняется присутствием у бактерий 09 серовара более коротких О-боковых цепей в составе ЛПС [51], а, как известно, при уменьшении размера О-специфических цепей или их количества обнажаются общие энтеробактериальные антигены [83, 131].
Отобранные антителопродуцирующие клоны были реклонированы методом лимитирующего разведения по схеме, описанной выше. Необходимость реклонирования связана с тем, что при длительном культивировании гибридомы могут утратить способность продуцировать иммуноглобулины. При реклонировании клонов 1Су и 8G7 получен клон 7С7,ь синтезирующий МКА только к штаммам Y. enterocolitica, и клон 8G7.b МКА которого взаимодействовали, кроме того, с бактериями Y. pseudotuberculosis и Y. pestis. В результате реклонирования специфических гибридом ряд клонов сохранил свою специфическую активность. Для дальнейшей работы было отобрано 13 реклонированных клонов гибридом, характеризующихся высокой специфичностью и активностью синтезируемых ими антител: 3 клона IG4.1, IG7.2, 6Е7.з, синтезирующие МКА к 03 серовару, 1 клон ІСцп - к 03+09 сероварам, 2 клона ІВю.ь 5Gg.2 к 09, 2 клона 2F4.b 6D52 - к 04,32, клон 1С2.і - к OS, клон 2С9.2 - к 05,27, 2 клона ЗСп.ь ЗС„.2 - к 06,30 сероварам, 1 клон 7С7л -ко всем сероварам Y. enter ocolitica.
Одними из важнейших показателей гибридомной биотехнологии являются стабильная продукция МКА гибридомами, сохранение их специфической активности, опухолеродности при длительном пассировании клеток.
Антителопродуцирующие клоны гибридных клеток можно культивировать как in vitro, так и in vivo. В зависимости от этого МКА получают либо из надосадочной фракции культуральной среды, либо из асцитической жидкости сингенных мышей.
При культивировании гибридом in vitro культуральную жидкость тестировали в ТИФА на активность содержащихся в ней антител в течение 6-ти месяцев (срок наблюдения) со штаммами Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis и Y. pestis EV НИИЭГ при заборе надосадочной жидкости во время смены среды. Результаты тестирования представлены в таблице 11.
Установлено, что клоны гибридом стабильно продуцировали антитела на протяжении 6-ти месяцев. При этом активность антител оставалась на прежнем уровне либо снижалась незначительно. Максимальный титр антител в культуральной жидкости составил 1/160-1/320. Низкие титры антител в культуральной жидкости указывали на невысокую концентрацию МКА в супернатантах. Для получения антител в более высоких концентрациях гибридомы культивировали в виде трансплантируемой опухоли у сингенных мышей.
Твердофазный иммуноферментный анализ
Серотипирование Y. enterocolitica обычно проводится в РА с помощью типовых агглютинирующих сывороток [16, 23, 27, 28, 58, 233, 234]. Получены также эритроцитарные, латексные, коагглютинирующие диагностикумы к отдельным сероварам кишечноиерсиниозных бактерий [12, 13, 21, 29, 34, 50, 53-56, 68, 76-79, 90, 95, 97, 121, 127, 128, 130]. Однако по чувствительности они уступают ТИФА и его различным вариантам [5, 14, 33, 73, 96, 118, 119, 147, 153, 186, 202, 206,225,240].
При конструировании иммуноферментных тест-систем для серотипирования и обнаружения возбудителя кишечного иерсиниоза использовали МКА к наиболее распространенным на территории России сероварам: ІСю.і (к 03+09 сероварам), 6Е7.з (к 03 серовару), 2F4.i (к 04,32 серовару), 2C9j (к 05,27 серовару) и видоспецифические МКА 7С7.і- Все из указанных МКА обладали избирательной специфичностью и наибольшей активностью в ТИФА. При разработке иммуноферментной тест-системы, предназначенной для серотипирования штаммов Y enterocolitica 03; 09; 04,32; 05,27 сероваров применяли МКА, меченные пероксидазой хрена. Конъюгирование моноклональных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена осуществляли методом периодатного окисления [200]. Рабочее разведение конъюгатов и активность МКА для конструирования указанной тест-системы определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Специфическая активность меченных МКА колебалась в пределах титров 1/6400 - 1/25600 (таблица 20).
Исходя из полученных результатов, в качестве рабочего разведения конъюгатов МКА при разработке экспериментальной тест-системы для серотипирования штаммов Y,enterocolitica был принят титр 1/1000.
Экспериментальная иммуноферментная тест-система, предназначенная для серотипирования штаммов Y. enterocolitica, была апробирована на расширенном наборе из 61 штамма бактерий Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб", бруцеллезной и туляремийной вакцин. При этом установлена положительная реакция соответствующих МКА со штаммами Y. enterocolitica конкретных сероваров (03; 09; 04,32; 05,27) и ее отсутствие со штаммами других сероваров кишечноиерсиниозных бактерий, гетерогенных микроорганизмов и вакцин (таблица 21). Трудность постановки бактериологического диагноза кишечного иерсиниоза связана с низкой высеваемостью возбудителя и длительностью выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой [26, 58, 123]. Поэтому важное практическое значение придается разработке иммунодиапеюстических препаратов, позволяющих выявлять возбудитель кишечного иерсиниоза в исследуемых образцах без непосредственного его выделения из объектов окружающей среды. При этом одним из важных критериев является чувствительность диагностической тест-системы при исследовании образцов, контаминированных посторонней микрофлорой. Чувствительность экспериментальной тест-системы для серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий с чистыми и искусственно загрязненными культурами Y. enterocolitica определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. При этом наряду с внесением в лунки различных количеств клеток чистой культуры Y. enterocolitica добавляли взвесь бактерий Е. coli наиболее часто встречающихся серотипов (0-151, О-Ш-ВН, 0-55, 0-26) в концентрации 1 - 10 м.кУмл. Чувствительность экспериментальной иммуноферментной моноклональной тест-системы при серотипировании чистых культур Y. enterocolitica в ТИФА составила 3,1 104-б,2- 104 м.к./мл и 3,1 10 -1,2 105 м.к./мл при индикации штаммов в искусственно контаминированных образцах (таблица 22). Вторая экспериментальная иммуноферментная тест-система была разработана на основе видоспецифических МКА 7С7.і для обнаружения и идентификации Y. enterocolitica. Активность МКА 7С7.1 и рабочее разведение для конструирования иммуноферментной тест-системы определяли в непрямом варианте ТИФА.
![Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]](/i/i/4283/202634.png "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович")
