Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литературы CLASS 9
1.1. Общие сведения 9
1.2. Морфология и пигментообразование синегнойной палочки 14
1.3. Культурно-биохимические свойства синегнойной палочки , 20
1.4. Серологические и патогенные свойства синегнойной палочки 25
1.5. Чувствительность синегнойной палочки к антибиотикам 35
1.6. Бактериофаги синегнойной палочки 39
1.6.1. Современные представления о бактериофагах ... 39
1.6.2. Бактериофаги синегнойной палочки 57
2. Собственные исследования 63
2.1. Материалы и методы 63
2.2. Результаты исследований 77
2.2Д. Морфология и основные биологические свойства синегнойной палочки 77
2.2.1.1. Морфология и культурально-биохимические особенности 77
2.2.1.2. Патогенные свойства синегнойной палочки (в лабораторных условиях) 102
2.2.1.3. Серологическое типирование штаммов синегнойной палочки 107
2.2.2. Чувствительность штаммов синегнойной палочки к антибиотикам III
2.3. Изучение некоторых биологических свойств бактериофагов синегнойной палочки * 117
2.3.1. Выделение фагов синегнойной палочки 117
2.3.2. Морфология бактериофагов синегнойной палочки 120
2.3.3. Морфология негативных колоний фагов синегнойнои палочки 130
2.3.4. Литический спектр и активность бактериофагов синегнойной палочки 142
2.3.5. Термоинактивация синегнойнк* бактериофагов 145
3. Обсуждение результатов 152
4. Выболи 161
5. Практические предложения 163
6. Список литературы 164
- Культурно-биохимические свойства синегнойной палочки
- Современные представления о бактериофагах
- Чувствительность штаммов синегнойной палочки к антибиотикам
- Литический спектр и активность бактериофагов синегнойной палочки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Искусственное осеменение коров и телок в крупных специализированных хозяйствах в настоящее время является основным методом воспроизводства стада. Концентрация высокоценных быков-производителей на племпредприятиях требует строгого выполнения ветеринарно-санитарных правил при взятии, обработке, хранении и использовании их спермы. При нарушении ветеринарно-санитарных требований сперма может быть источником распространения возбудителей инфекционных заболеваний, вызывающих патологию репродуктивных органов. Вопросы профилактики бесплодия маточного состава и производителей крупного рогатого скота занимают важное место в решении задач по дальнейшему увеличению поголовья животных.
Одним из множества факторов, обусловливающих бесплодие -является бактериальная контаминация гениталиев самок и производителей и возникающие, вследствие этого, различные нарушения воспроизводительной функции животных.
Однако, до сих пор мнения различных исследователей относительно роли потенциально (условно) патогенных бактерий в нарушении воспроизводительной способности животных противоречивы. Некоторые исследователи отрицают этиологическое значение их в патологии гениталиев животных {c.c.Lf/id/elon ,.и o/mmo/is, 1969, и др.), но большинство - связывают с ними нарушения воспроизводительных процессов (П.А.Волосков, А.П.Студенцов, Г.В.Зверева, Е.В.Ильинский, И.Ф.Заянчковский, Д.Д.Логвинов, Н.И.Полянский, Н.Н.Михайлов, В.А.Зудилин и др.).
Весьма разнообразны данные о видовом составе контаминант-ной микрофлоры, выделенной из половых органов крупного рогатого
скота, в частности, полости препуция, придаточных половых желез и спермы быков-производителей. Особое этиологическое значение в патологии репродукции животных придается стафилококкам, стрептококкам, эшерихиям, псевдомонас и другим потенциально патогенным бактериям.
В результате широкого применения в лечебной практике антибиотиков увеличилось количество устойчивых к ним бактерий различных видов, в том числе синегнойной палочки ( Hseua/omorpas ae/vo/ioscr), которая стала частым контаминантом спермы быков-производителей (Н.Н.Михайлов, Н.Г.Балашов, В.А.Зудилин, Б.Мур-тазин, В.П.Парусов, Б.Кондрашов и др.).
Прошло более 65 лет с того времени, как работы Д'Эрелля (1917) привлекли внимание исследователей к новому миру широко распространенных живых существ - бактериофагам или бактериальным вирусам, которые поражают бактерии.
За последние годы в Советском Союзе особенно интенсивно разрабатываются вопросы фагопрофилактики и фаготерапии бактериальных инфекций (В.Г.Дроботько, Б.И.Клейн, С.С.Казарновская, Г.О.Ручко, Ф.Е.Сергиенко, Н.Н.Фишер, З.А.Ермольева, М.И.Луре, Г.А.Крестовникова, И.А.Сутин, Л.Н.Якобсон и др.). В изучении сущности явления бактериофагии, исследовании новых групп фагов и их использовании - большой вклад внесли В.Д.Тимаков, М.Н.Жу-ков-Вережников, А.Б.Крисе, А.П.Пехов, А.С.Тихоненко, В.А.Зуев, И.М.Габрилович и другие исследователи.
Впервые бактериофаги синегнойной палочки упоминались в работах Ccmcik (1923), Comh/esc Or Afoiroheu (1923), ports (1923), 0ci/e/a(IdZ3), позднее -3rac/eu(i4№)%/?sc/ieschov (1926),^^-lh ei'а/.{1Ъ4&),Засобу //^^ (1953), O'caifao/tan ela. {1<Ш) t C/i0W,Jwamo{a (1969), С.И.Жилина (1973), Т.А.Бурбута-швили (1980), Х.И.Исхаковой (1980) и др.
Бактериофаги применяют как для типирования культур бактерий сине-зеленого гноя, идентификации их, особенно в случае бес-пигментных вариантов, или с другими отклонениями от типичных свойств, так при дифференциации синегнойной палочки от сходных бактерий (зеленящий стрептококк и др.).
Изучение биологических свойств бактериофагов синегнойной палочки, выделенной от быков-производителей из разных зон СССР, -является актуальным в ветеринарной науке и практике, так как заболевание псевдомонозом, особенно производителей сельскохозяйственных животных, продолжает иметь место. К тому же возрастает интерес к бактериофагам в теоретическом и практическом аспектах.
Цель и задачи исследований. Освоение методов выделения фагов синегнойной палочки и изучения их основных биологических свойств в целях дальнейшего использования в качестве диагностических препаратов.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить морфологию, культурально-биохимические и другие свойства культур штаммов синегнойной палочки (выделенных из спермы быков-производителей в разных регионах СССР), как бактерии-хозяина фага.
Определить степень чувствительности синегнойной палочки к антибиотикам.
Выделить бактериофаги синегнойной палочки и изучить их
основные морфологические особенности и биологические свойства.
ти Научная новизна работы. Определена ферментнвная и гемолитическая активность культур синегнойной палочки (штаммов), выделенной от быков-производителей в разных регионах СССР; при этом не отмечена корреляция между серотипом возбудителя, региона нахождения объекта выделения и степенью ферментативной активности. Установлена степень чувствительности и особенности
роста изучаемых штаммов бактерий к 15 антибиотикам (методы дисков и серийных разведений).
Апробирована с положительным результатом селективная среда и среда ЦПХ, предложенные НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалея (А.Ф.Мороз, Б.М.Бекбергенов, Г.Е.Афиногенов, 1976) для выделения синегнойной палочки, а также методика и среда Дга/ (1970) для идентификации синегнойной палочки по ее пиодианина-пигментообразованию, причем в этой среде глюконат калия заменен на глюконат натрия.
Выделены три бактериофага синегнойной палочки со специфическим воздействием на возбудителя псевдомоноза. Определены некоторые морфологические особенности и основные биологические свойства этих бактериофагов: морфология частиц бактериофага, негативные колонии, литический аспект и активность, воздействие температурного фактора. Полученные впервые данные по бактериофагам могут быть использованы в дальнейших научно-исследовательских работах для фаготипирования синегнойной палочки.
Практическая ценность. Результаты апробации селективной питательной среды (А.Ф.Мороз и соавторы, 1976) подтверждают рекомендации по использованию ее в ветеринарной лабораторной практике при диагностике псевдомоноза сельскохозяйственных животных, а также среды /їгаі (1970) для дифференциации синегнойной палочки от других бактерий родов {І/іАг/о tneronwnqs %flr#ieus% fr^e&sieiia* /./"Ії'яяассег и cnze?*0№eei) с помощью теста окисления глюконата натрия или калия.
При изучении чувствительности синегнойной палочки к антибиотикам методом серийных разведений целесообразно определять бактериоцидный показатель при инкубировании культур на средах в термостате (37,0 С) не менее 8 суток.
Метод получения бактериофагов синегнойной палочки, выделен-
ной из спермы производителей может быть использован в ветеринарных целях (фаготипирование, фаготерапия).
Апробация работы. Материалы доложены на конференции молодых ученых Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко (г.Москва, II мая 1984), заседании Ученого совета ВИЭВ (апрель 1984), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (май 1985). Публикации:
Морфология бактериофагов синегнойной палочки, выделенной от быков. Бюл. ВИЭВ, 1984 г., вып.56, с.48-51.
Индикация бактериофагов синегнойной палочки, выделенной от быков-производителей. Бюл. ВИЭВ, 1984 г., вып.56, с.76-77.
Объем работы. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована I графиком, 12 таблицами и 48 фотографиями. Список использованной литературы включает 271 источник, в том числе 174 советских и 97 зарубежных.
Культурно-биохимические свойства синегнойной палочки
Miofcov/c (1958), при изучении биохимической активности синегнойной палочки, отмечал ее индифферентность ко многим углеводам: лактозе, раффинозе, маниту, дульциту, сорбиту и инозиту; при этом было обнаружено, что активность ее по отношению к глюкозе, арабинозе, галактозе, маннозе - непостоянна.
По данным Н.Г.Балашова и В.Н.Родиной (1971) синегнойная палочка неприхотлива к питательным средам, растет медленно до 5-7 суток при температуре 20-37С, Saiisbiru и ya/tt/emwAiJSKL) сообщают, что синегнойная палочка может расти при 5-ЮС, а при минусовой температуре длительно сохраняться.
И.Д.Колчинская, Е.И.Квасников, Л.А.Мельниченко (1974) в своей работе сообщают об угнетении активности препаратов про-теиназ после воздействия на них додецилсульфатом, ЭДТА и мочевиной и высказывают предположение о наличии ионов металлов в активном центре протеиназ.
Scnuberl и sa/?u J3Tl) предложили для ...идентификации синегнойной палочке реакцию, основанную на восстановлении метиленового синего и позволяющую выявлять штаммы, способные утилизировать различные органические штт&т&.аіогґі-ІіегІ/ог7Іа-(1976) выделили 244 штамма синегнойной палочки от голубых лисиц на зоофермах Дании и описали их культуральные, биохимические и некоторые другие свойства: из них 10 штаммов не образовали пигмента и были отнесены к группе атипичных, 128 штаммов (52,5$) давали на кровяном агаре рост колоний в S - форме и 26 (10,7$) - имели R - форму. Все культуры обладали оксидазной, каталазной и гемолитической активностью, росли на нитратных средах, разжижали желатин, нитрат редуктазная активность установлена у 167 штаммов (68,7$ культур), оксидазная в отношении глюкозы у 23 (95,9$), в отношении маннозы - у 153 (62,7$); расщепление мочевины отмечалось у 45 штаммов (18,4$), а четкое отсутствие этого свойства у 86 (35,3$).
Н.Е.Смирнова и Н.С.Акатова (1971) при идентификации синегнойной палочки использовали следующие тесты: ферментацию желатины, мочевины и других субстратов. При исследовании 69 штаммов синегнойной палочки, из которых 12 относились к различным серологическим типам, авторы обнаружили, что все они синтезировали следующие ферменты: уреазу, желатиназу, аргиназу, аргининдегид-разу и липазу. По данным Э.Я.Кязимовой (1973) изученные 20 штаммов синегнойной палочки слабо ферментировали углеводы, не образовывали индол и сероводород, не разжижали желатину и не пептонизировали молоко. Выделенные из разных источников штаммы синегнойной палочки по ряду культуральных и биохимических свойств отличались друг от друга.
Koss , Sa/nuois (1971), используя высокую протеолитическую активность синегнойной палочки,провели определение короткоцепоч-ных кислот при выращивании культур синегнойной палочки на трип-тическом соевом агаре и обнаружили в средах пропионовуго, изобу-тиловую, изовалериановую кислоты и считают возможным рекомендовать использование этого свойства в качестве дифференцирующего признака. thu/re-Waetir ее ас. (1971), исследовав морфологические, тинкториальные, культуриальные и биохимические свойства 25 штаммов синегнойной палочки, выделенных от людей, животных и воды, установили, что все они обладали сходными и типичными для этого вида свойствами. При этом авторы большое внимание уделяли оксидазному тесту, использовав его для дифференциальной диагностики.
Большое значение этому тесту придает и Н.А.Пустовалова (1971) при дифференциации биохимически неактивных грамотрица-тельных бактерий. Применяя среду Селлерса для дифференциации биохимически неактивных грамотрицательных бактерий (PsemJamonixs aema/rtosa , 3асі. a/f/ miumtM ma раїшногр/щ /!c0ca/ ce/7S fecalis), автор установила, что при росте синегнойной палочки на этой среде она не ферментирует глюкозу (не образует желтого кольца), вызывая флюоресценцию и освобождение азота из нитратов и нитритов, столбик агаровой среды синеет и в нем просматриваются разрывы и пузырьки газа.
По данным А.БЛерномордика (1939) из 19, проверенных им, штаммов синегнойной палочки - 15 образовывали кислоту без газа на глюкозе и 9 на сахарозе, мальтозе, галактозе, манните и ара-биноза. Все штаммы не разлагали дульцита, и глицерина, свежевы-деленные штаммы выделяли сероводород, свертывали молоко. Автор отметил, что синегнойная палочка обладает широким диапазоном биохимической активности, объяснив это тем, что культуры на питательных средах одновременно ферментируют углеводы с образованием щелочей, давая проявление указанных свойств в зависимости от состава среды. Р.В.Анохина (1973), изучая основные биохимические свойства бактерий рода Pseudo/imas привела их схему классификации по способности ферментировать углеводы и разделила на 5 групп.
По данным Е.П.Данилова (1973) 158 штаммов синегнойной палочки, выделенных от норок, ферментировали глюкозу, ксилозу и галактозу с образованием кислоты без газа, 139 штаммов - образовывали кислоту без газа на арабинозе, 26 штаммов - на мальто - 23 зе; 152 штамма - свертывали молоко и пептонизировали 150 свеже-выделенных штаммов - разжижали желатину не полностью. Гемолитическими свойствами обладали только свежевыделенные штаммы.
Л.Месробяну (1963) отмечает наличие у штаммов синегнойной палочки амилолитической активности, благодаря которой она способна расщеплять крахмал.
/JovsiQWsti е #/.(1980) при выделении 100 штаммов сине-гнойной палочки из замороженной спермы быков определяли ряд их биохимических и токсических свойств. Исследованные штаммы ферментировали глюкозу и галактозу и были индефферентны к другим сахарам. Ими также было отмечено, что выделенные штаммы имели сильную активность по отношению к аминокислотам и белкам, почти все разлагали аргинин, желатин! казеин и фибрин. Культуры сине-гнойной палочки, выделенные от телят, не сбраживали Сахаров, не образовывали индола, давали отрицательную реакцию Фогес-Яроска-уэра, не усваивали цитратных солей, разжижали желатину (Б.А.Корж и Я.Д.Злонкевич, 1979).
По данным М.Маркарян (1975), культуры синегнойной палочки, выделенные от кур, растут на МПБ с желтовато-зеленым оттенком, на кровяном агаре образуют колонии величиной около 1-2 мм/ - В или только L - типа; мальтозу, маннит и сахарозу не разлагают; глюкозу разлагали около 1Ъ% штаммов; у всех выделенных культур отмечалась цитохромоксидазная активность.
Sac/a si vert?, Srinii/asa г/ а. (1979) у 277 штаммов синегнойной палочки, выделенных от кур различных птицеферм, - отмечали гидролиз аргинина, разжижение желатины, продукцию оксидазы; все штаммы были уреазоположительными, в отношении галактозы и ман-нозы реакции - сомнительные.
О продукции уреазы, как положительной реакции для синегнойной палочки, сообщают Welmpre и Cocie/wur (1956): 60-70$ исследованных штаммов синегнойной палочки были уреазоположи-тельными. Ими также было отмечено, что все выделенные штаммы давали положительную реакцию на галактозу. Sian/er el all. (1966), при изучении выделенных штаммов синегнойной палочки отмечали у них положительную реакцию на фруктозу.
В.Г.Курдюков с соавт. (1969), изучая культурально-морфоло-гические и биохимические свойства большинства штаммов синегнойной палочки, выделенных от павших норок, описали их как полиморфные, подвижные грамотрицателыше палочки, факультативные аэробы, хорошо растущие на обычных питательных средах при температуре 36-38С. По биохимической активности они ферментировали глюкозу, арабинозу, галактозу, ксилозу - без газообразования, разжижали желатину и в течение суток свертывали молоко, индол не продуцировали, на кровяном агаре образовывали значительную зону гемолиза.
Современные представления о бактериофагах
Общеизвестно, что при изучении бактериофагов должны учитываться основные свойства соответствующих бактерий-хозяев, ибо только при таком положении возможно раскрытие биологических особенностей самих фагов (Л.А.Зильбер, 1956, и др.).
С открытием вирусов - паразитов растений и животных, отдельные исследователи (Н.Ф.Гамалеяtt898),/W/7/ //7f 1896, и др.) обнаружили наличие фильтрующихся агентов, способных вызывать поражение и самих бактерий (сибиреязвенной бациллы, холерного вибриона и др.). наблюдая стекловидное перерождение или лизис колоний белого стафилококка, поддающегося последовательному пассированию, предполагал, что причиной его может быть или литический аутофермент самих кокков, или же особый вирус, заражающий бактериальные клетки, развивающийся за их счет и приводящий, таким образом, к разрушению их.
Однако все эти наблюдения не нашли в то время должного отклика среди микробиологов и только последующие работы Д Эрелля (1917, 1918) о литическом антагонисте возбудителя дизентерии, названном "кишечным бактериофагом" привлекли внимание многочисленных исследователей к изучению фагов различных видов бактерий, особенно патогенных для человека и животных, поскольку в этих "лизирующих паразитах" рассчитывали обрести специфическое средство для борьбы с бактериальными инфекциями. Как свидетельствует /4 // (1958, 1967), за период с 1917 по 1956 гг. было опубликовано 5655 работ по вопросам бактериофагии, а в 1957-1965 гг. - 5000 работ.
Большой вклад в учение о бактериофагах внесли и советские исследователи: Д.М.Гольдфарб (1959, 1961), В.Г.Дроботько (1927, 1929), З.В.Ермольева (1939, 1964), Н.Н.Жуков-Вережников (1936, 1947), С.С.Казарновская (1932), Б.И.Клейн (1943, 1944, 1954), В.А.Крестовникова (1952), А.С.Кривиский (1957, 1962, 1963), А.Е.Крисе (1944, 1953), А.П.Пехов (1958, 1962), Я.И.Раутенштийн (1955, 1967), Г.О.Ручко (1936), В.Л.Рыжков (1957), В.Д.Тимаков (1961), А.С.Тихоненко (1966, 1968), М.Н.Фишер (1939) и многие другие.
Вначале различные исследователи по разному объясняли феномен Туорта - Д Эрелля, но со временем понятие о бактериофагах или просто фагах, как ультрамикроскопических живых существах, стало общепризнанным, так как по своим свойствам фаги не отличаются от вирусов животных или растений; их также называют бактериальными вирусами {Ъ el а РLick 1942, 1946),/ / (1952), /V#w(I952), J-/ers/?ev7 Зго/?/елІГ/7Лег (1955), Si є пі (I960, 1965), HauQs (1964), А.С.Тихоненко (1968), В.А.Зуев (1969) и др.
По данным // /7 /W(I967), Я.И.Раутенштейна (1971), А.С.Тихоненко (1968) и других авторов в настоящее время выделены фаги к самым различным видам бактерий, актино-и проактиноми-цетов, миксобактериям, спирохетам, каулобактериям, некоторым зеленым и сине-зеленым водорослям, а также микоплазмам и гифо-мицетам.
L/uco (1921) впервые показали, что фаги нередко обнаруживают в самих культурах бактерий. В настоящее время это положение является общепризнанным.
Выделение фага основывается на обнаружении его литического действия по отношению к определенной культуре бактерий - носящей название тест-культуры, детекторной или индикаторной {До/oms) (1950, 1961), Д.М.Гольдфарб, 1961, АЛ.Пехов (1962), iz/ senszotrfidSb!) и др. При этом подбираются условия, наиболее благоприятные для развития бактерий, которые, как правило, являются оптимальными и для размножения фагов.
И в настоящее время при выделении их руководствуются положениями Д»3релля (1921, 1926, 1935), а именно: а) действие фага является специфическим - лизируются только бактерии соответствующего вида; б) фаги действуют только на молодые, активно веге-тирувдие клетки; в) лити.веское действие фага приводит к просветлению мутной бульонной культуры или к недопущению появления мути, а на агаровых газонах бактериального роста обусловливает образование "стерильных" зон лизиса различных размеров. При фа-голизисе культуры иногда могут встречаться отдельные фагоустой-чивые особи, которые при дальнейшем размножении (особенно в жидкой среде) будут маскировать присутствие фага и поэтому фо-голизаты следует своевременно освобождать от нелизированных бактерий (путем фильтрации, прогревания и т.п.).
Следует также подчеркнуть, что для более глубокого и систематического изучения различных вопросов, касающихся бактерио - 42 фагии, большую роль сыграло опубликование ряда работ методического порядка: /lafams (1950, 1959, 1961), В.Д.Тимаков и Д.М.Гольдфарб (1958), и др.
При работе с фагами исключительное значение, как это показали еще Д»Эрелль (1926), //77 / (1934) и др., имеет формирование ими на поверхности агаровых газонов тест-культур или в двухслойном агаре {liralia, ТЯ&Ъ\Негмеи / /, 1943), так называемых, негативных колоний (НК), именуемых также стерильными пятнами или просто пятнами, бляшками, лесенками, дырками и т.п. (Л.Г.Рапопорт, 1947, Д.М.Гольдфарб, 1961). Кроме того, учет количества НК, образуищихся на поверхностных газонах тест-культур или в двухслойном агаре, используется для определения титра фага и значительно превосходит по точности метод серийных разведений в бульоне предложенный Дрр el mans (1922).
Характер НК - размеры, прозрачность, отчетливость края, наличие периферической зоны полулизиса или ореала - является существенным биологическим признаком фага, размножающегося на определенной культуре-хозяине. В то же время окончательный вид НК зависит от многих других переменных факторов, в частности, общего и локального содержания воды, солей и прочих веществ в агаре, от физиологического состояния и плотности расположения индикаторных бактерий и т.п. Эти данные представлены в работах ШогсІ, /7/? /w№Sa932), %/6гісПіУ&% І946)..Л.С.Коля-дицкой(І947), Адамса (1961), Д.М.Гольдфарб а (1961), St є пі (1965), В.А.Хан-Фиминой и Л.Б.Борисова (1972), А.Г.Близниченко и В.Н.Милютина (1972), С.И.Жилина (1973), Т.А.Бурбужашвили и Х.И.Исхаковой (1980) и др.
Чувствительность штаммов синегнойной палочки к антибиотикам
Одним из основных элементов рационального применения антибиотиков в ветеринарии при инфекционных болезнях, в частности к возбудителю псевдомоноза, является определение чувствительности возбудителя болезни к этим препаратам. Это необходимо для того, чтобы выбрать наиболее эффективный антибактериальный препарат при данном заболевании.
Чувствительность штаммов синегнойной палочки мы вначале определяли методом диффузии в агаре с применением дисков, содержащих антибиотики, согласно "Методическим указаниям по определению чувствительности к антибиотикам возбудителя инфекционных болезней сельскохозяйственных животных" (ГУВ МСХ СССР, 1972). Чувствительность бактерий к антибиотикам подразделяли на четыре группы:
- высокочувствительные, имеющие зону задержки роста более 25 мм в диаметре;
- чувствительные, имеющие зону задержки роста от 15-ти до 25 мм;
- малочувствительные, имеющие зоны задержки роста от II до 15 мм;
- резистентные, где совершенно отсутствуют зоны задержки роста.
В опытах по изучению чувствительности использовали 90 штаммов синегнойной палочки к следующим 15 антибиотикам: новобиоцин, левомицин, стрептомицин, эритромицин, тетрациклин, мономицин, канамицин, пенициллин, окситетрациклин, олеандомицин, рифампи-цин, гентамицин, полимиксинМ,карбенициллин и неомицин.
В результате исследований подтверждено, что при сравнительной оценке активности вышеперечисленных антибиотиков против имеющихся музейных и полевых штаммов синегнойной палочки -практически все штаммы этих бактерий обладали высокой лекарственной устойчивостью к 2 и более препаратам.
Как показали обобщенные данные (таблица 9) значительную антибактериальную активность в отношении синегнойной палочки (рис.16) проявили - гентамицин (98,8$), рифампицин - 20 ед/Д (94,4$) и полимиксин-М (81,1$),
Полученные данные имеют практическое значение для выбора эффективных лекарственных препаратов, предназначенных для лечения заболевания, обусловленных синегнойной палочкой.
Рис.16. Чувствительность синегнойной палочки к рифампицину (20 ед/Д ); 2 - гентомицину; 3 - полимиксину-М; 4 - неомицину и 5 - карбенциллину.
При этом следует учитывать бактериостатические и бактерицидные дозы антибиотиков. Например, антибиотик рифамицин, которого в диске содержалось всего 5 мкг - оказался мало или неактивным по отношению к синегнойной палочке, а при содержании -20 единиц действия (рис.17) - высоко активным, т.е. чувствительность бактерий определяется и дозой антибиотика.
Одновременно чувствительность синегнойной палочки к антибиотикам мы определяли и методом серийных разведений на бульоне Мартена (рН 7,2 - 7,4). К среде, содержащей антибиотик, добавляли 0,1 мл суточной бульонной культуры синегнойной палочки в разведении I х 10 микробных клеток в I мл.
Всего в опыт было взято 93 штамма синегнойной палочки, из них 26 музейных и 67 полевых, которые были выделены из спермы быков-производителей.
Учитывая высокую степень устойчивости бактерий сине-зеленого гноя к антибиотикам, мы и через 24 часа - до 8 суток инкубации их в среде с антибиотиками при температуре 37 С из каждой пробирки высевали пробы на бульон Мартена,не содержащий антибиотик. Через каждые сутки по наличию или отсутствию роста бактерий на бульоне определяли и бактери цидяую дозу антибиотика, т.к. многие из них в ветеринарной практике применяются для местной апликации (внутриматочно, в полость препуция, на поверхность пениса производителя).
Всего было использовано 6 антибиотиков: сизомицин в разведении от 200 до 0,4 мкг/мл; гентамицин 200-0,4 мкг/мл, неомшщн 200-1,6 мкг/мл, полимиксин-В 200-1,6 мкг/мл, полимиксин-М 200-1,6 мкг/мл и рифампицин от 200 до 6,2 мкг/мл. Антибиотики (стандартные) получали из ГННИМШ им.Л.А.Тарасовича и ВГНКЙ ГУВ МСХ СССР.
В этих опытах мы предварительно испытывали малые концентрации антибиотика и если препарат не обладал бактерисцидным действием на бактерии, то готовили новые среды с повышенной его концентрацией.
Исследования показали, что бактерицидная доза, подавляющая минимальная концентрация (ПМК) испытуемых антибиотиков - находится в широких диапазонах и значительно варьирует для отдель -116 ных штаммов, выделяемых бактерий сине-зеленого гноя. Так, по данным Ж?г А/(1957) синегнойная палочка чувствительна к поли-миксину-В в концентрации 6,25 мкг/мл, а СМ.Новашин и И.П.Фомина (1968) сообщают, что для этой бактерии ШІК составляет 50 мкг/мл.
В наших опытах мы отметили рост бактерий многих штаммов синегнойной палочки на питательных средах с добавлением антибиотиков повышенной концентрации (например неомицина, полимикси-на-В и М равной 50 мкг/мл) и через 72 часа, а в некоторых случаях до 8 суток, т.е. обладающих значительной устойчивостью.
На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что при изучении чувствительности синегнойной палочки к различным антибиотикам и определении МПК - необходимо наблюдать за ростом бактерий ин витро в течение 7-8 суток. Это имеет важное значение для рекомендаций дозировок антибиотиков при местной апликации в целях терапии эндометритов, баланопоститов и других болезней репродуктивных органов животных, обусловленных патогенными бактериями.
Литический спектр и активность бактериофагов синегнойной палочки
При изучении литических свойств выделенных фагов синегнойной палочки, мы исходили из известного в специальной литературе положения, что спектр литического действия - является характерной особенностью и этим тестом пользуются для их идентификации.
Однако спектр литического действия не всегда является неизменной характеристикой штамма фага, он может изменяться в результате мутации или фенотипической модификации фага. Чувствительность к фагу у индикаторных бактериальных штаммов также может изменяться под влиянием различных факторов.
В настоящее время, как нами упоминалось, установлено наличие различных бактериофагов, которые дифференцируются друг от друга по морфологии, спектру действия и характеру взаимодействия с тем или иным видом бактерий.
Поэтому, например, при конструировании поливалентных терапевтических препаратов из фагов, рекомендуется вводить в них фаги, которые имели бы возможно более широкий спектр действия и высоколизирующую активность в отношении гомологичных бактерий.
Определенное значение имеет и применение чистых линий бактериофага с целью видовой индикации бактерий. В этой связи индикаторные фаги должны иметь высокую специфичность и стабильность специфического спектра.
Изучение литического спектра и специфичности выделенных нами фагов синегнойной палочки мы проводили на твердой питательной среде, методом нанесения капли (0,1 мл) фага (фаголизата) на подсушенную полоску 4-часовой бульонной бактериальной культуры штаммов в чашки Петри. Результаты учитывались через 18-20 часов инкубирования при Т 37С.
В сравнительном опыте на специфичность диапазон литического спектра 3-х синегнойных бактериофагов (фаголизаты) изучался на известном ранее наборе музейных (ВИЭВ) штаммов бактерий: Эшерихи коли (0,8; ОД; 0,33; 04; 020; 015; 026; 09; 02 и 018), Протеус (-Я, 102 и X-I9), а также Стафилококкус (В2, Якунин, Орехов, № 209, Жаев и Б-9).
При культивировании в течение 18-20 час. при Т 37С роста указанных культур бактерий ни один из фагов не лизировал гете-рологичные штаммы, хотя наблюдалось в некоторых случаях изменение литического спектра при пассаже на гетерологичных штаммах бактерий.
Учитывая вышеизложенное, мы затем пассировали бактериофаги на гетерологичных устойчивых штаммах бактерий 10-кратно (по В.В.Авреху, 1955) с определением диапазона литического действия после каждого пассажа, при этом возможность заражения пассируемого фага умеренным бактериофагом была исключена. Но даже 10-кратное пассирование бактериофагов на гетерологичных штаммах не изменило их действия, т.е. не действовали.
Дальнейшие исследования литического спектра селекционированных нами бактериофагов синегнойной палочки на гомологичных бактериях, т.е. синегнойной палочке, проводили на ранее использованных штаммах.
Наблюдения, проведенные по ходу опытов, показали, что диапазон литического спектра 3-х фаголизатов (бактериофагов) в отношении гомологичных бактерий (штаммы синегнойной палочки) был различен. Например, фаг № I - вначале опытов обладал более широким диапазоном действия в отношении гомологичных видов бактерий, охватывая до 70,6$ испытуемых штаммов синегнойной палочки, чем два других.
Известно, что свойство фагов лизировать максимальное количество штаммов бактерий гомологичного вида - является одним из основных качественных признаков для диагностических препаратов. В связи с тем, что фаги синегнойной палочки являются строго специфичными, это их свойство позволит в дальнейшем применять их и с целью диагностики атипичных, беспигментных штаммов.
Как указывалось выше, в опытах мы использовали три фага (фаголизата), выделенные из культур синегнойной палочки. Известно, что одним из основных положений при конструировании лечебно-профилактических бактериофагов, определяющим его качество, является изготовление фага (фаголизата) с высокой литиче-ской активностью.
Поэтому, чтобы повысить литическую активность полученных фагов, мы пассировали их на гомологичных свежевыде ленных штаммах синегнойной палочки. Для этого в пробирку с бульоном (4,5 мл) добавляли 0,5 мл фаголизата и I каплю (0,1 мл) смыва культуры (10 разведения) инкубировали в термостате при температуре 37С 3-4 часа, а затем при комнатной температуре в течение 18-20 часов этим методом, а также методом Грациа мы проводили многократное пассирование бактериофагов на фагорези-стентных штаммах синегнойной палочки. С увеличением количества пассажей расширялся и диапазон действия фагов на бактерии, а также их литическая активность.
Как указывалось выше, при изучении литической активности бактериофага № I в отношении 34-х штаммов синегнойной палочки было выяснено, что пассирование значительно изменило его в сторону расширения спектра действия (см.таблицу 10).
Аналогичную работу мы провели и с фагами № I и № 2. В результате смогли получить фаголизаты, также активно действующие на бактериальные штаммы.
В опытах на 95 штаммах синегнойной палочки по испытанию литической активности всех 3-х фагов - установлен показатель выше 10 (по Аппельману). Так, фаг Л I имел активность в пределах Ю"5 - Ю"9; фаг № 2 от Ю 5 до Ю"8 и фаг № 3 от Ю 5 до Ю" 9.
Таким образом, все три фага, полученные нами, обладали высоким литическим титром.
При многократном пассировании бактериофагов было отмечено, что уже после первого пассажа бактериофаг адаптировался к используемым штаммам синегнойной палочки. При дальнейших пассажах (в некоторых случаях до 20) количество фагоустойчивых бактериальных штаммов снижалось.
