Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Безопасность пищевых продуктов и барьерная технология 8
1.2. Применение микроорганизмов в технологии ферментированых мясопродуктов 14
1.3. Конкурирующая микрофлора ферментированных мясопродуктов как барьер 19
1.4. Средства стимулирующие развитие позитивно-технологической микрофлоры 24
2. Собственные исследования 33
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Культуры и штаммы
2.1.2. Питательные среды
2.1.3. Материалы 34
2.1.4. Методы микробиологических исследований 34
2.1.5. Определение активности воды 35
2.1.6. Статистическая обработка и планирование эксперимента 35
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 36
2.2.1. Определение влияния растительных экстрактов на
антагонистическую активность комбинаций пробиотиков 43
2.2.2. Определение совместного влияния экстракта женьшеня и лактулозы на антагонистическую активность пробиотических культур 50
2.2.3. Выработка цельномышечного продукта из баранины 63
2.2.4. Выработка сыровяленой колбасы 70
Заключение 75
Выводы 80
Список использованных источников 81
- Безопасность пищевых продуктов и барьерная технология
- Применение микроорганизмов в технологии ферментированых мясопродуктов
- Статистическая обработка и планирование эксперимента
- Определение совместного влияния экстракта женьшеня и лактулозы на антагонистическую активность пробиотических культур
Введение к работе
Ферментированные мясопродукты традиционно пользуются спросом населения. Кулинарная готовность данного вида продуктов достигается в результате жизнедеятельности молочнокислых микроорганизмов и обезвоживания. В связи с тем, что в процессе производства ферментированных мясопродуктов отсутствует высокотемпературная обработка, существует возможность развития нежелательных микроорганизмов, т.н. микробиологических рисков. При разработке современной модели «Концепции оценки рисков по критическим контрольным точкам» (Hazard Analysis Critical Control Point) в США на основании результатов масштабных исследований для контроля микробиологических рисков было выбрано 9 наиболее опасных для пищевых продуктов микроорганизмов в том числе и Escherichia coli и Staphylococcus aureus (ХАССП/НАССР, 2003). На наш взгляд наибольшую опасность для производства ферментированных мясопродуктов представляют Е. coli и S, aureus, так как на всем протяжении производства значения барьерных показателей (температура, рН, Aw) не достигают величины необходимой для торможения роста этих микроорганизмов. Согласно данным литературы эту проблему может решить применение пробиотических микроорганизмов. Так же накоплены сведения о положительном влиянии водно-спиртовых настоев и фитопрепаратов некоторых растений на процессы ферментативного созревания и сушки мясопродуктов, на формирование их качественных характеристик, а также торможение развития нежелательной микрофлоры и окисление липидов (Жаринов, 1997; Боресков, 1998; Митасева, 1998; Рогов, 1998).
В связи с вышеизложенным весьма актуальным является изучение влияния пробиотических культур на развитие Е. coli и S. aureus в ферментированных продуктах, а так же установление возможности применения экстрактов растений группы адаптогенов для усиления антагонистической активности этих культур. Это позволит подобрать комбинации пробиотических культур и растительных экстрактов, провести сравнительный анализ их активности.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлись подбор пробиотических культур (молочнокислых и бифидобактерий) для изготовления ферментированных мясопродуктов. Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:
Подбор комбинаций пробиотических культур (используемых для производства медицинских препаратов) на основе их антагонистической активности по отношению к Е. coli и S. aureus.
Выбор стимулирующего фактора (растительного экстракта или пребиотического препарата) на основе его влияния на антагонистическую активность по отношению к Е. coli и S. aureus.
Изучить влияние комплекса пробиотических культур и стимулирующих факторов на изменение физико-химических показателей являющихся барьерными (рН, Aw).
Сравнить эффективность применения комплекса пробиотических культур и стимулирующих факторов с коммерческими стартовыми культурами.
Разработать научно-обоснованные рекомендации по использованию пробиотических культур в производстве ферментированных мясопродуктов.
Научная новизна.
Изучено влияние комбинаций пробиотических культур на развитие Е. coli и S. aureus при совместном культивировании в модельном мясном фарше. Определено влияние экстрактов растений группы адаптогенов (элеутерококк, лимонник, женьшень) и лактулозы на развитие Е. coli и S. aureus в мясном фарше. Проведено сравнение микробиологических (количество ме-зофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, количество молочнокислых микроорганизмов) а так же барьерных (рН, Aw) показателей цельномышечного продукта из баранины и сыровяленой колбасы, выработанных с применением коммерческих препаратов (ПБ-МП и GN-Start SL-67) и с применением комбинаций пробиотических культур.
Практическая значимость работы. Предложены рекомендации по применению пробиотических культур и растительных экстрактов в технологии цельномышечных продуктов из баранины. Проведена выработка сыровя-леных колбас с применением экстракта женьшеня на предприятии «Аркадак-ские колбасы», что подтверждается актом об опытно-промышленной выработке. Материалы исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторных работ на кафедрах «Микробиология и ветсанэкспертиза» и «Технология мяса и мясопродуктов» ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».
Положения выносимые на защиту.
Экстракт женьшеня оказывает более выраженное тормозящее действие Eia развитие Е. сої і и S. aureus в мясных системах в присутствии комбинаций пробиотических микроорганизмов.
Комбинации пробиотических микроорганизмов L. acidophilus+L.casei и L. bulgaricus+B. bifidum обеспечивают созревание цельномышечного продукта из баранины на уровне коммерческих стартовых культур.
При созревании сыровяленой колбасы, выработанной с комбинациями пробиотических микроорганизмов L. acidophilus+L.casei и L. bulgaricus+B. bifidum, достигается количество молочнокислых микроорганизмов, характерное для продуктов, обогащенных про биотиками.
Апробация работы. Результаты выполненных исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Человек.» (Москва, 2001 г.), Международной научно-технической конференции «Пищевая промышленность на рубеже веков» (Алматы, 2001 и 2003 гг.), Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002 г.), на 2-й Всероссийской научно-технической конференции «Современные дос- тижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002 г.), Международной научно-технической конференции «Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство» (Воронеж, 2003 г.), Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов, и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003 г.), Международной научно-технической конференции «Стратегия развития пищевой и легкой промышленности» (Алматы, 2004 г.), Международной научно практической конференции «Стратегия развития АПК: технологии, экономика, переработка, управление» (Ростов-на-Дону, 2004 г.).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 11 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 196 источников, в том числе 64 работы зарубежных авторов. Работа изложена на 101 странице текста, содержит 5 таблиц, 19 рисунков.
Безопасность пищевых продуктов и барьерная технология
Безопасность пищевых продуктов обусловлена устранением ряда рисков биологического, химического и физического происхождения [Жаринов, 2004]. При этом, для мясных продуктов доля рисков биологического и, прежде всего, микробного характера доминирует, и по разным оценкам составляет 80-90 % от их общего количества.
Обеспечение более высокого качества продукта при сохранении (или повышении) микробиологической стабильности можно обеспечить комбинированием сохраняющих факторов (барьеров). Описано более 60 потенциальных барьеров, влияющих на безопасность и/или качество пищевых продуктов. Однако, важнейшими барьерами пищевых продуктов являются повышенная (пастеризация, стерилизация и т.д.) и пониженная (холодильная обработка) температура, пониженные значения показателей активности воды (Aw), кислотности (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), наличие консервантов и конкурирующей микрофлоры [Ляйстнер, 1998]. Стойкость и безопасность традиционных пищевых продуктов основывается на комбинации нескольких барьеров, которые не могут преодолеть микроорганизмы, присутствующие в продукте.
Температура, особенно на начальной стадии производства колбас, имеет большое значение для уменьшения количества негативно-технологической микрофлоры. Мясо, подготовленное для производства сырокопченых колбас, должно иметь температуру не выше 2 С. Температура фарша до наполнения им оболочек и при последующей холодной осадке не должна превышать 4-5С. Не смотря на то, что данные температуры гарантированно ингибируют развитие термофильных и мезофильных микроорганизмов, в то же время они являются благоприятными для развития психрофильных. На стадиях копчения, созревания-сушки колбас и при теплой осадке, которые обычно проводятся при 10-25 С, основные функции подавления нежелательной микрофлоры берут на себя другие факторы [Мюнх и др., 1985]. Показатель рН понижается после заполнения оболочек фаршем в результате ферментативной активности определенных групп микроорганизмов. При этом, из углеводов колбасного фарша образуются органические кислоты, главным образом молочная.
Понижение рН оказывает неблагоприятное действие на грамотрица-тельные бактерии, особенно из семейства Entewbacteriaceae. Психрофиль-ные бактерии рода Pseudomonas подавляются или уничтожаются. Бациллы не только устойчивы к действию рН, но и начиная с менее благоприятного значения рН, настолько активно осуществляют обмен веществ, расщепляя углеводы, что не только выживают, но и продолжают размножаться [Мюнх и др., 1985].
Величина Aw влияет на разложение, метаболическую активность, выживаемость и сопротивляемость микроорганизмов не только вызывающих порчу, но и необходимых для ферментации. Большинство микроорганизмов, существующих в пищевой промышленности, хорошо размножаются при высоких значениях Aw и лишь немногие - при низкой. При производстве продуктов с промежуточной влажностью Aw снижают до уровня при котором развитие большинства патогенных микроорганизмов невозможно, а содержащейся влаги достаточно для того ,чтобы он не потерял своего вкуса. Подавление нежелательной микрофлоры достигается не только за счет снижения Aw, но и регулированием рН, Eh, температуры и конкурирующей микрофлорой.
По величине Aw продукты делятся на три группы : - продукты с высокой влажностью: Aw = 1-0,9; - продукты с промежуточной влажностью: Aw = 0,9-0,6; - продукты с низкой влажностью : Aw 0,6. В зависимости от Aw продукта на его порчу влияют различные химические, физические, биологические факторы. В продуктах с низкой влажностью может наблюдаться окисление жиров, неферментативное потемнение, потеря водорастворимых веществ.
В целом из всех микроорганизмов, присутствующих в пищевых продуктах, к понижению Aw плесени устойчивее дрожжей, а последние устойчивее бактерий. Минимальные значения Aw необходимые для роста микроорганизмов находятся в пределах 0,98 (Clostridium, Pseudomonas) - 0,75 (Halophilic bacteria) для бактерий и 0,92 (Rhodotorula, Pichid) - 0,62 (Sac-charomyces) для дрожжей.
Минимальный уровень Aw может несколько меняться в зависимости от растворенного вещества, регулирующего величину Aw, и влажности субстрата. При регулировании Aw субстрата ферментируемыми углеводами, организмы, продуцирующие из них кислоту, могут не выдержать столь низкого значения Aw, как на субстратах с более высоким значением рН.
Субстраты с Aw 0,95 ингибируют размножение большинства грам положительных бактерий Bacillus и Clostridium, подавляют прорастание спор. Представители видов Lactobacillus, Pediococcus или Micrococcus выдерживают величину Aw 0,95. Дрожжи и плесени видов Debaryomyces и РепісіШит, участвующие в ферментации некоторых колбас, размножаются и метаболически активны при более низких значениях Aw [Ляйстнер, Редель, 1980]. Некоторые штаммы S. aureus выделяют энтеротоксины, продуцирование которых связывают с концентрацией хлорида натрия или Aw. Минимальные значения факторов для развития S. aureus следующие: t = 6,5-46 С; Aw = 0,94; рН = 5,2-9. Продуцирование клетками S. aureus энтеротоксина В и С прекращается при Aw = 0,94, а энтеротоксин А может выделяться и при Aw 0,9. Оптимум роста для стафилококков лежит около значения Aw = 0,995. На основе вышеприведенных данных можно сделать вывод: при прочих оптимальных условиях снижение величины Aw приводит к удлинению лаг-фазы, предшествующей экспоненциальному периоду роста, понижает удельную скорость роста и уменьшает максимальное число клеток микроорганизмов. Исследования показали, что рост клеток S, aureus возможен при Aw = 0,86 и выше, а медленный рост некоторых штаммов наблюдается при Aw = 0,83-0,84. Продуцирование токсинов может происходить независимо от роста и может происходить в его отсутствие. Это имеет особое значение для пищевых продуктов с промежуточной влажностью (ГОТВ), в которых стафилококки присутствуют, но не развиваются, т.е. если величина Aw лежит в верхних границах диапазона промежуточной влажности, то в продукте могут присутствовать энтеротоксины, если изначально в продукте содержались стафилококки. Продуцирование энтеротоксинов снижается при снижении Aw среды. Минимальная величина Aw, достаточная для продуцирования токсина, зависит от штамма микроорганизма и среды. Штамм S. aureus 196 Е (продуцент токсина А) продуцировал токсин при Aw 0,95, а штамм С-243 (продуцент токсина В) при Aw 0,93. Продуцирование токсинов подавляется при рН = 5-7 и содержании хлорида натрия свыше 10 %. Снижение рН до 4-4,5 достаточно для ограничения продуцирования токсинов при концентрации хлорида натрия 0-4 % (масса/объем). [Пози и Девис, 1980]. Т.е. значения рН, Aw которые достигаются при ферментации мясопродуктов, а также температуры, при которых ведется технологический процесс не достаточны для ингибиро-вания развития клеток S. aureus.
Применение микроорганизмов в технологии ферментированых мясопродуктов
В процессе созревания-сушки ферментированных мясопродуктов активно участвуют микроорганизмы, как находящиеся на поверхности мяса, так и вносимые в него (стартовые культуры). До конца не решена проблема подбора микроорганизмов и их сочетаний для обеспечения стабильного качества ферментированных мясопродуктов. Обычно при производстве ферментированных продуктов используются молочнокислые бактерии, не патогенные для организма человека [Заиграева, 1996]. Молочнокислые бактерии являются солетолерантными факультативно-анаэробными, мезофильными микроорганизмами, сбраживающими сахара с образованием кислот и ароматических соединений. Считается, что при выборе штамма следует учитывать его антагонистическую активность по отношению к патогенной и условно патогенной микрофлоре, форму образуемой молочной кислоты, взаимодействие с другими бактериями позитивно-технологической микрофлоры [Knauf, 1998; Incze, 2002].
В результате развития молочнокислых бактерий может возрастать содержание некоторых незаменимых аминокислот: лейцина, тирозина, фенила-ланина, валина и треонина, что в свою очередь влияет на биологическую ценность, консистенцию готовых изделий и уровень их перевариваемости [Тимощук и др., 1984; Asgar, Jeates, 1978].
Видовой и качественный состав коммерческих бактериальных препаратов весьма разнообразен и зависит от технологической направленности, при этом перечень различных штаммов в закваске может составлять до 106. Удачно подобранные стартовые культуры, как правило, обладают многофункциональным действием и способны в короткие сроки обеспечить накопление необходимых количеств молочной кислоты, снизить долю остаточного нитрита натрия, интенсифицировать процессы образования летучих жирных кислот и карбонильных соединений [Михайлова, 1968; Джаббарова, 1968; Шанта, 1969; Рей, 1978]. Одними из первых коммерческих препаратов для ферментированных мясопродуктов являлись препараты L. plantarum, L. brevis и L. fermenti, Pediococcus cerevisiae [Рей, 1978; Анисимова и др., 1989; Hammesetal., 1990].
У нас в стране одними из первых были разработаны стартовые культуры АЦИД-СК-1, АЦИД-СК-2, АЦИД-СК, ПБ-СК и ББП [Липатов, 1989]. В практике мясного производства хорошо зарекомендовали себя сухие бактериальные препараты «Лактоплант» и «Микрококк». При этом первый приготовлен на основе молочнокислых бактерий L. piantanim штаммы 31 и 32, второй на основе денитрифицирующего микрококка Micrococcus caseolyticus штамм 38 [Хорольский, 1982; Хорольский и др, 1993, Черкасова, 1994] и ПБ-МП в состав которого входят L. plantarum, L. casei, Micrococcus variants [Кузнецова и др., 1996; Костенко и др., 1997]. Велись также работы по использованию в качестве защитных культур грибов рода Penicilium [Габараев, 1986].
Некоторые микроорганизмы, применяемые в коммерческих бактериальных заквасках в настоящее время, приводятся ниже [Knauf, 1998]: - бактерии: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus curvatis, Lactobacillus sake, Lactobacillus casei, Lactobacillus alimentarius, Staphylococcus camosus, Staphylococcus xylococcus, Micrococcus variants, Pedi-coccus acidilactici, Iyedicoccus pentosaceus; -дрожжи: Debaryamyces hansenii, Candida famata; -стрептомицет: Streptomyces griseus; -плесневые грибы: Penicilium nalgiovence, Penicillium camemberii/candidum.
Микрококки, стрептококки, педиококки и диплококки выполняют денитрифицирующую и ароматообразующую функцию, незначительно влияют на величину рН, поэтому их необходимо применять в сочетании с кислотообразующими микроорганизмами [Buego, 1984; Папина, 1996], поскольку совместное применение микрококков с лактобациллами так же положительно влияет на цветообразование продукта, даже при снижении дозы нитрита [Хорольский и др., 1993; 1994].
Молочнокислые бактерии положительно влияют на образование вкуса ферментированных мясопродуктов в результате образования органических летучих жирных кислот (молочной, уксусной, валериановой и др.) [Красникова, 1980; Большаков и др., 1984], свободные аминокислоты образующиеся в результате метаболизма микроорганизмов, играют роль веществ-предшественников, из которых в последствии образуются летучие соединения, участвующие в формировании вкуса и аромата продукта [Михайлова, 1968; Cantoni, Bianchi, Beretta, 1976, Хорольский, 1988]. Источником же аминокислот являются полипептиды, образующиеся в большей степени в результате воздействия эндогенных ферментов мышечной ткани на белок. Пеп-тидазная активность наиболее развита у микрококков, особенно у штаммов М. varians и М. kristinae, однако по имеющимся в литературе [Montel, Masson, Talon, 1998; Hammes, Hertel, 1998] данным выраженным продуцентом предшественников аромата, в частности З-methylbutanal, являются штаммы S. carnosus и S. xylosus. Из представителей молочнокислых микроорганизмов наиболее активным видом (по степени образования 3-methylbutanal) является L. casei. С точки зрения ароматообразования интересной является разработка Датского мясного института - стартовая культура Moraxella phenylpynivica. Эта психрофильная культура - факультативный анаэроб, что позволяет ей активно развиваться в толще продукта, и, как показали исследования, продуцировать предшественники аромата. Единственным недостатком является тот факт, что эта культура относится к грамотрицательным палочкам и, соответственно, вызывает ряд предубеждений [Jens et al., 1997].
Помимо того, что молочнокислые бактерии обеспечивают микробиологическую безопасность и стойкость сырокопченых колбас, имеются сведения о их положительном влиянии на реологические характеристики продукта, что связывают с лучшим удалением влаги из продукта, вследствие чего резко возрастает динамическое предельное напряжение сдвига [Протопопов и др., 2000].
Молочнокислые бактерии при введении в плазму крови способствуют созданию гелеобразной структуры, причем активность лактобацилл выше прокоагуляционной активности лактококков и стрептококков [Козеева, 2002].
Стартовые культуры, пищевые добавки и многокомпонентные смеси являются надежным и эффективным средством для целенаправленного воздействия на процессы формирования вкусоароматических характеристик, цвета, текстуры, на скорость сушки и т.п. Одновременно молочнокислые бактерии, вносимые в изделия, выполняют консервирующую функцию, ин-гибируя развитие нежелательной микрофлоры путем образования веществ, обладающих антибактериальным действием [Костенко и др., 1997; Delenyi, Incze, 1985; Pataejae, 1980]. Имеются работы, направленные на получение экологически безопас ной сырокопченой продукции с улучшенными органолептическими, функ циональными и структурно-механическими свойствами за счет использова ния природных метаболитов и, в частности, путем посола мясного сырья в молочной сыворотке, ферментированной пропионовокислыми или бифидо бактериями. Под действием ферментированной молочной сыворотки с био массой бифидо- или пропионовокислых бактерий наряду с понижением ве личины рН до 4,5-5,3 происходит увеличение нежности мясного продукта благодаря протеолитическим изменениям в мышечных волокнах [Нефедова и др., 1995] Сейчас большой интерес вызывает использование микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору кишечника здоровых людей (про биотиков) в производстве мясопродуктов.
Статистическая обработка и планирование эксперимента
Статистическая обработка экспериментальных данных, планирование эксперимента и оценка статистической значимости производилась при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0. В литературном обзоре нами было указано, что применение молочнокислых микроорганизмов и водно-спиртовых растительных экстрактов неблагоприятно воздействует на гнилостную и условно-патогенную микрофлору. Данных по воздействию на микрофлору ферментированных мясопродуктов при их созревании практически не встречается. Поскольку основные микробиологические процессы при созревании ферментированных мясопродуктов протекают в первую неделю, нами по аналогии с исследованиями Rodel и Scheuer [2001, 2002] длительность эксперимента ограничена шестью сутками. Исследования проводились в соответствии со схемой проведения эксперимента (рис. 1).
На первом этапе были протестированы парные комбинации пробиоти-ческих микроорганизмов используемых в медицинских препаратах: Lactobacilus acidophilus, L. plantarum, Bifidobacterium bifidum, а также в молочных продуктах с про биотическим действием: L. bulgaricus, L. casei. Ниже приведен список комбинаций данных микроорганизмов: /. L. acidophilus+L. casei; 2. L. acidophilus +L. plantarum; 3. L. acidophilus + B. bifidum; 4. L. acidophilus + L. bulgaricus; J. L. casei + L. plantarum; 6. L. casei + B. bifidum; 7. L. casei + L. bulgaricus; 8. L. plantarum + B. bifidum; 9. L. plantarum + L. bulgaicus; 10. L. bulgaricus + B. bifidum В качестве тест-культур в соответствии с задачами исследования использовались Е. coli и S. aureus.
Антагонистическую активность комбинаций пробиотических культур определяли методом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест-культур в монокультуре [Ганина и др., 1999]. В качестве модельной среды использовался фарш сыровяленой колбасы «Московская» (ТУ 10 РСФСР 861) с добавлением 1 % лактозы. Культуры пробиотиков вносились в количестве 10 КОЕ/г в суспензии (на физиологическом растворе), В качестве тест-культур использовались культуры Е. coli и S. aureus, вносимые в образцы в количестве 103 КОЕ/г. Образцы фарша помещались в непроницаемую оболочку «Амитан» диаметром 10 мм. Длительность эксперимента - 6 суток, температура — 24 С, контроль показателей (количество клеток тест-культуры, рН) - на 0, 2, 4 и 6 сутки.
Результаты эксперимента с тест-культурой Е. coli представлены на ри сунке 2. На рисунке 2 а показана динамика увеличения числа клеток тест культуры при совместном культивировании с комбинациями культур пробиотиков. Наименьшее конечное количество Е. coli наблюдалось в образ цах с комбинациями L. acidophilus+L. casei, L. bulgaricus + В. bifidum, где значение lg КОЕ Е. coli составил соответственно 6,71 и 6,57, в то время как в контроле этот показатель составил 7,15. У образцов с L. acidophilus + Bifidobacterium bifidum и L. acidophilus + L. bulgaricus так же наблюдалось низкое конечное значение. На рисунке 2 б показана динамика показателя рН при эксперименте с Е. coli. Наиболее быстрое снижение рН в первые сутки наблюдалось у образца L. bulgaricus+B. bifidum. Максимально низкая величина рН у образца с L. acidophilus+B. bifidum, причем наибольшая скорость снижения показателя рН наблюдалась в период с 2 до 4 суток, затем к 6-м суткам происходит частичное повышение рН.
При совместном рассмотрении рисунков 2 а и 2 б, отмечается, что в образцах с комбинациями культур: L. acidophilus+B. bifidum, L. casei+ L. bulgaricus, L. plantarum+L. bulgaricus; L. acidophilus+L. bulgaricus, L. casei+B. bifidum с четвертых суток эксперимента происходит переход от спада к повышению рН, при этом у трех образцах в этот период наблюдалось уменьшение количества клеток тест-культуры, это: L. acidophilus+ L. bulgaricus, L. acidophilus+B. bifidum, L. casei+B. bifidum.Y контрольного образца на фоне равномерного снижения рН отмечался значительный рост числа клеток Е. coli к 2-м суткам, снижение числа клеток к 4-м суткам, и незначительный рост к 6-м. Исходя из этого, можно предположить, что низкое значение рН не является достаточным барьером для Е. coli, т.к. для снижения числа клеток Е. coli или их задержки их развития требуется достижение значения рН в диапазоне от 5,1 до 4,5, это характерно для образцов с комбинациями культур L. acidophilus+L. bulgaricus, L. acidophilus+B. bifidum, L. casei+B. bifidum, L. bulgaricus+B. bifidum. Однако в образце с комбинацией культур L. acidophilus+L. casei отмечается сильное торможение развития тест-культуры при невысоких темпах снижения показателя рН, что возможно связано с продуцированием пробиотическими микроорганизмами веществ антагонистически воздействующих на Е. coli без изменения рН,
В качестве второй тест-культуры использовали культуру S. aureus. Экспериментальные данные по развитию S. aureus в модельном фарше представлены на рисунке 3. При рассмотрении экспериментальных данных отмечается, что в ряде образцов в течение 2-4-х суток эксперимента наблюдается торможение роста числа клеток S. aureus, это образцы с комбинациями культур: L. acidophilus+L. casei, L. acidophilus+L. plant arum, L. acidopilus+ L. bulgaricus, L. casei+L. plantantm. При этом отмечалось, что в контроле на 6 сутки логарифм числа клеток достигал уровня 7,8, в то время как в системах с участием микроорганизмов-пробиотиков этот показатель был в пределах от 6,49 до 6,8.
Определение совместного влияния экстракта женьшеня и лактулозы на антагонистическую активность пробиотических культур
В качестве стартовых культур использовали подобранные на основании предыдущих экспериментов комбинации: L. acidophihis+L. casei и L. bulgari-cus+B. bifidiim (по 10 КОЕ/г). Первоначально проводили эксперимент по изучению развития Е. coli (103 КОЕ/г) в модельном фарше (см. выше) с внесением добавок, согласно матрице плана. Затем в качестве тест-культуры вносили S. aureus (103 КОЕ/г). В качестве отклика выбирали конечное количество клеток тест-культуры в образце. На рисунке 8 представлены результаты эксперимента при совместном культивировании Е. coli и комбинации L. acidophilus+L. casei. Отмечалось, что к 3-м суткам рост тест-культуры в образцах с лактулозой и экстрактом женьшеня достигал lg 6,04 , а в образце с комбинацией добавок рост был на 2 порядка ниже. К 6-м суткам в образце с лактулозой количество клеток тест-культуры не возрастало, в образце с женьшенем и комбинацией добавок происходило незначительное увеличение (рис. 8 а). При сравнении данных по развитию Е. coli с измерением значения рН обнаруживается корреляция между снижением значения рН и концентрацией кишечной палочки. Так, в образце с лактулозой в течение первых 3-х суток рН снижается с 6,0 до 4,7 и достигает конечного значения 4,39. В образце с экстрактом женьшеня начальное значение рН 5,63, на третьи сутки 5,3, конечное значение 5,17. В образце с комбинацией добавок рН снижается с начального значения 5,71 до 4,81 (на третьи сутки), конечное значение 4,73. Т.е. в образце с наибольшей скоростью снижения показателя рН (образец с лактулозой) достигается наибольшее угнетение развития Е. coli по сравнению с другими образцами, имеющими более низкое начальное значение рН. Экспериментальные данные обработаны в виде уравнения регрессии: Е=6,71 -0,66 Л-0,08 3+0,37 RG (MS=0,000225) где Л - доля внесения лактулозы, %.
Поверхность отклика, т.е. поверхность, каждая точка которой представляет возможный уровень количества клеток тест-микроорганизма в диапазоне изменения концентраций добавок, представлена на рисунке 9. При увеличении количества лактулозы (при одинаковых значениях количества экстракта женьшеня) поверхность отклика имеет тенденцию к снижению, а при увеличении доли экстракта женьшеня (при постоянном уровне лактулозы) наблюдается подъем поверхности отклика. При совместном увеличении обоих факторов происходит смещение поверхности отклика в сторону уменьшения числа клеток Е. coli, и наоборот. На рисунке 10 представлены результаты эксперимента по совместному развитию Е. coli и комбинации культур L. bulgaricus+B. bifidum, добавки вносились в соответствии с планом эксперимента. При обработке конечных результатов получено следующее уравнение регрессии: Е=6,56-0,25Л-0,3 Ю+0,83ЛО (MS-0,000875)
Поверхность отклика представлена на рисунке 11. Из рисунка следует, что при увеличении одного из факторов (при неизменном другом факторе) происходит практически одинаковое уменьшение отклика (снижение количества клеток тест культуры). При этом одновременное увеличение факторов приводит к подъему поверхности отклика, то же, хотя и с меньшей скоростью, наблюдается при одновременном уменьшении факторов. Анализ поверхности отклика и коэффициентов регрессии позволяет заключить , что достаточно сильное влияние в эксперименте оказывает взаимодействие факторов, причем эффект от взаимодействия факторов в несколько раз сильнее, чем эффект каждого фактора по отдельности, а так как знак при коэффициенте регрессии положительный, т.о. в данном случае лактулоза и экстракт женьшеня синергетически стимулируют развитие Е. coli.
В данном эксперименте наиболее действенно влияние экстракта женьшеня, на втором месте по эффективности стоит лактулоза, наименее действенным оказывается совместное применение экстракта женьшеня и лактулозы. На рисунке 12 представлены результаты эксперимента при совместном культивировании S. aureus и комбинации L. acidophilus+L. casei, уравнение регрессии принимает следующий вид: 5=6,495-0,235Л-0,265О+0,405ЛО(М5=0,00016) Поверхность отклика представлена на рисунке 13. Увеличение концентрации лактулозы свыше 0,6 % при минимальной концентрации экстракта женьшеня приводит понижению уровня поверхности отклика (т.е. уменьшению числа S. aureus), и, наоборот, при снижении уровня внесения лактулозы Таким образом, в данном эксперименте наблюдается антагонистическое взаимодействие факторов (лактулозы и экстракта женьшеня), т.е. имеет место межфакторное взаимодействие. Женьшень в данном эксперименте об-ладает большим угнетающим действием, по сравнению с лактулозой. На рисунке 14 представлены результаты эксперимента по совместному развитию S. aureus и комбинации культур L. bulgaricus+B. bifidum, добавки вносились в соответствии с планом эксперимента. При обработке конечных результатов эксперимента по совместному развитию S. aureus и комбинации культур L. bulgaricus+B. bifidum, получено следующее уравнение регрессии: S=6,57+0 n-0,39G-0,(mG (MS=0,00015)
Из графика (рис. 15) можно заключить, что при прочих равных условиях увеличение доли внесения экстракта женьшеня приводит к снижению уровня поверхности отклика (т.е. уменьшению количества S. aureus). Межфакторное взаимодействие выражено слабо, так как зависимость между факторами практически линейная.
