Введение к работе
Актуальность проблемы. Седьмая пандемия холеры характеризуется
широкой циркуляцией холерных вибрионов в воде поверхностных водоемов на фоне обширного загрязнения окружающей среды, в том числе гидросферы, различными продуктами, связанными с антропогенной деятельностью.
Известны сезонные колебания численности представителей рода Vibrio, в том числе и холерных вибрионов, в эстуариях, где они находятся в ассоциациях с водными растениями и животными и подвержены воздействию органических веществ, температуры, солености и др. факторов (Simidu U. et al, 1971; SochardH.K. etal, 1979; СмоликоваЛ.М., 1977, 1985; Colwell R.R., 1986 и другие). Одной из форм адаптации холерных вибрионов к неблагоприятным условиям существования отдельными авторами (Colwell R.R., 1985; Roszak D.B. et al, 1987; ЧетинаЕ.В. с соавт. 1992; ГинцбургАЛ., Романова Ю.М., 1993 и др.) рассматривается способность перехода в некультивируемое состояние (НС).
Впервые факт существования некультивируемых форм (НФ) Vibrio cholerae 01 описали Colwell RR et al. (1981), высказав мнение о значимости этой формы холерных вибрионов в выживании возбудителя холеры в окружающей среде. Их изучению в настоящее время посвящены работы Roszak D.B. et al. (1987), Романовой Ю.М. и Гинцбурга А.Л. (1993, 1997), Marcher F. et.al.(1999), Соколенко АВ.', (2000), Del Mar Leo М. et al. (2000) и других исследователей. Переход в некультивируемую форму «НФ» рассматривается как стратегия выживания бактерий в неблагоприятных для существования условиях. При наступлении благоприятных условий микроорганизмы из некультиви-руемого состояния возвращаются в культивируемое.
Faruque S.M. с соавт. (1998), анализируя вопросы экологии токсигенных холерных вибрионов, отводят НФ роль «хранителей» генетических элементов патогенности. По мнению Четиной Е.В. и Грижебовского Г.М. с соавт.(1993), эпидемическая значимость некультивируемых форм холерного вибриона подтверждается отсутствием реорганизации фрагментов vct-оперона тотальной ДНК холерных вибрионов, обнаруженной в воде поверхностных водоемов.
В связи с важностью изучения экологических аспектов перехода бактерий в некультивируемое состояние особого внимания заслуживают работы, посвященные роли биотических и абиотических факторов водоёмов в этом процессе. Исследованиями Islam M.S. etal. (1998, 1999) показано влияние водорослей Anabaena variabilis на переход холерных вибрионов в НС. В отдельных сообщениях описаны факты сохранения холерных вибрионов в НФ в симбиозе с копеподами (Sochard M.R et al, 1979). Имеются отдельные сведения о влиянии температуры на образование НФ V. vulnificvjs, которые в НФ переходят при н-5С, независимо от содержания питательных веществ в среде. Соколенко А.В. (2000), Савельев В.Н. с соавт. (2001) получали НФ холерных вибрионов на голодной среде и некоторых других модельных системах (морская вода, речная и др.) при+4 С.
По мнению Домарадского И.В. (1997), одной из причин перехода бакте-
мчиїжгітиг* тшпщртуры- По
рий в НФ является нехватка питательных веществ
мнению автора, под влиянием голодания бактерии стремятся выжить путем перехода в НС и под влиянием температуры перестраивают свой метаболизм так, чтобы это позволило им сохранить жизнеспособность.
Большинство вспышек холеры, связанных с водными путями распространения инфекции, имеют выраженный сезонный характер. Известно, что холерные вибрионы из объектов окружающей среды в культивируемом состоянии выделяли при температуре воды 17,5- 22; 25 С (Мединский Г.М. с соавт. 1977; Артемова Т.В. с соавт., 1978, и др.). В то же время, несмотря на большое количество работ, посвященных обнаружению и сохранению холерных вибрионов в водоёмах в культивируемом состоянии и значению отдельных факторов воздействия на их переход в НФ, закономерности и экологические аспекты процесса «Культивируемое состояние - Некультивируемая форма - Культивируемое состояние» изучены недостаточно. Вместе с тем, только знание закономерностей формирования некультивируемых форм холерных вибрионов и реверсии их в исходное состояние в объектах окружающей среды позволит объективно оценить эпидемическую значимость и роль этой формы в сохранении возбудителя в межэпидемическский период.
Водные экосистемы обитания холерных вибрионов различных серологических групп характеризуются совокупностью многих показателей. Основными абиотическими факторами, определяющими их характеристику, являются температура воды и освещенность, зависящие в свою очередь от географического расположения водоемов, сезонной и суточной периодичности. Температура воды при этом определяется и освещенностью, соединяющей влияние различных лучей, в т.ч. видимого света, прогревающего определенные слои воды.
Именно эти абиотические факторы - температура и освещенность в соединении с представлениями о холерных вибрионах как обитателях солоноватых вод следует рассматривать в сочетанном и раздельном влиянии при изучении экологических закономерностей существования холерных вибрионов в культивируемом и в некультивируемом состоянии.
Цель работы.
Изучение раздельного и комплексного влияния некоторых абиотических и экологических факторов: температуры, освещенности и различной солености среды на переход в некультивируемое состояние токсигенных и нетокси-генных холерных вибрионов и реверсию некультивируемых форм к культивируемому состоянию.
Основные задачи исследования:
Получение некультивируемых форм токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов микрокосмах с различной соленостью среды.
Изучение влияния температуры и освещенности на скорость перехода холерных вибрионов в некультивируемое состояние и реверсию культивируемых свойств в микрокосмах с различной соленостью среды.
Отработка методов оценки жизнеспособности НФ холерных вибрионов.
Научная новиша и теоретическая значимость.
Впервые проведено исследование влияния комплекса факторов: солености среды микрокосм, температурного режима их содержания и освещенности на формирование некультивируемых форм холерных вибрионов различных се-рогрупп и токсигенности.
Показаны наиболее короткие сроки перехода холерных вибрионов в НС при температуре 4-6 С и минимальной минерализацией среды: Выявлено увеличение сроков перехода холерных вибрионов в НФ при повышении температуры содержания микрокосм до 8-Ю С, а также под влиянием освещенности и увеличения солености среды. Установлено пролонгирующее влияние комплексного воздействия факторов: солености среды микрокосм, повышения температуры их содержания с 4-6 С до 8-Ю С и освещенности на скорость перехода холерных вибрионов в НФ.
Выявлена большая продолжительность времени перехода в НС холерных вибрионов 0139 серогруппы по сравнению с V. cholerae 01.
Получена реверсия «молодых» 5-20 суточных некультивируемых форм холерных вибрионов в культивируемое состояние при повышении температурного режима содержания микрокосм от 4-6 до 20 С.
Методом прямого прижизненного подсчета бактериальных клеток (DVC- direct viable count), отработанным для оценки жизнеспособности НФ холерных вибрионов показан различный удельный вес жизнеспособных клеток в популяции НФ различного возраста.
Научно-практическая ценность работы.
Полученные в результате исследований сведения расширяют представления о раздельном и комплексном влиянии некоторых экологических абиотических факторов на переход холерных вибрионов в некультивируемое состояние и их реверсию.
Отработан метод прямого прижизненного подсчета клеток (DVC) для оценки жизнеспособных некультивируемых форм холерных вибрионов различного возраста. Оформлены, одобрены Учёным Советом (Протокол №26 от 17 декабря 2001 г) и утверждены директором института Методические рекомендации по использованию метода прямого прижизненного подсчета клеток (DVC) для оценки жизнеспособности некультивируемых форм холерных вибрионов.
Положения, выносимые на защиту.
Температура 4-6 С индуцирует переход холерных вибрионов в некультивируемое состояние независимо от солености среды. Соленость среды, освещенность и повышение температуры до 8-Ю С и более оказывают пролонгирующее влияние на сроки перехода холерных вибрионов в НС.
Повышение температурного режима экспериментальных экосистем до -К20С способствует реверсии некультивируемых форм холерных вибрионов на ранних стадиях некультивируемого состояния.
3. Метод прямого прижизненного подсчета бактериальных клеток позволяет оценить жизнеспособность некультивируемых форм холерных вибрионов на ранних стадиях некультивируемого состояния и может быть использован для ориентировочного отбора жизнеспособных вибрионов с целью их дальнейшего изучения. Апробация работы.
Результаты экспериментальных исследований доложены на конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно исследовательского противочумного института в 1998,1999,2000,2001 и 2002г, на заседаниях Всероссийской проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» в 2000,2001гг. и Международной научной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, 2000г).
План диссертационной работы утвержден Ученым Советом РПЧИ (протокол №3 от 23.05.2002).
Исследования проведены в рамках плановой темы «Экологические параметры образования некультивируемых форм холерных вибрионов» номер гос. регистрации 002821 от 01.09. 1990.
Структура работы: диссертация состоит из 6 глав, включающих обзор литературы по проблеме, материалы и методы, использованные в работе, результаты экспериментальных исследований; а также заключение и выводы. Работа изложена на 154 страницах, содержит 14 таблиц, 19 рисунка и список использованных отечественных (143) и зарубежных (120) работ.
