Введение к работе
Актуальность проблемы. Процессы образования и окисления метана - это количественно значимые компоненты глобального цикла углерода на Земле и, по- видимому, они являлись таковыми на протяжении всего времени существования биосферы нашей планеты. Тем не менее, далеко не все филогенетические группы микроорганизмов, образующих и окисляющих метан, изучены в достаточной степени.
Процессы метаногенеза и сульфатзависимого окисления метана осуществляются археями, объединенными в родственные группы микроорганизмов, относящихся к типу Euryarchaeota (Strous & Jetten, 2004). Эти микроорганизмы широко распространены в природе, где метаногенные археи осуществляют терминальный этап в процессе анаэробного разложения органического вещества в условиях отсутствия высокопотенциальных акцепторов электронов, тогда как метанотрофные археи в составе синтрофных ассоциаций и при условии наличия сульфата осуществляют анаэробное окисление метана (Whitman et al., 2006; Knittel & Boetius, 2009).
Использование гена 16S рРНК для детекции и идентификации метаногенных и метанотрофных архей в сложных микробных сообществах затруднено, поскольку обе эти физиологические группы не являются монофилетичными (Bapteste et al., 2005; Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим внимание ряда исследрвателей было обращено на ген метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) (Springer et al., 2005; Hales et al., 2006). Результаты, полученные во многих работах подтвердили эффективность использования данного функционального и филогенетического маркера для оценки разнообразия и распространения метаногенных и метанотрофных архей (Luton et al., 2002; Hallam et al, 2003).
В экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью, где водород и метан образуются в результате высокотемпературных абиотических реакций, метаногенные и метанотрофные археи способны выполнять роль первичных продуцентов. Для некоторых термальных экотопов, таких как нефтяные месторождения, гидротермальные осадки, «черные курильщики», уже проведен ряд исследований по разнообразию и распространению метаногенных, а в некоторых случаях и метанотрофных архей (Teske et al., 2002; Dhillon et al, 2005; Jeanthon et al., 2005; Miroshnichenko & Bonch-Osmolovskaya, 2006; Ollivier & Cayol. 2010). Настоящее исследование посвящено слабо изученным в этом отношении экотопам: диффузным глубоководным гидротермальным выходам и наземным горячим источникам.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования была молекулярная детекция, идентификация и количественная оценка метаногенных и метанотрофных архей в гидротермальных экосистемах и реконструкция филогении этих групп микроорганизмов на основании общего функционального и филогенетического маркера - гена а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы (mcrA).
Основные задачи исследования состояли в следующем:
-
Оценка распространения, численности и филогенетического разнообразия метаногенных архей в образцах диффузных флюидов глубоководных гидротермальных систем и в образцах наземных горячих источников с использованием молекулярных и культуральных подходов.
-
Создание масштабной реконструкции филогении метаногенных и метанотрофных архей на основе гена а субъединицы метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) c использованием обширной и современной базы данных.
-
Выявление из всего многообразия метанотрофных архей конкретных филогенетических групп, для представителей которых мы сможем прогнозировать адаптацию к высоким температурам.
-
Разработка систем праймеров для детекции термофильных групп метанотрофных архей.
-
Оценка распространения термофильных групп метанотрофных архей в образцах диффузных флюидов глубоководных гидротерм и в образцах наземных горячих источников.
Научная новизна и значимость работы. Впервые на большой выборке образцов проведена оценка количества и распространения метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Значительно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах. Выявлена взаимосвязь между содержанием водорода в диффузных гидротермальных флюидах и характером метаногенной популяции этих флюидов.
Получены веские доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей, а также получены данные об их распространении.
Впервые на большой выборке образцов проведена оценка распространения метаногенных микроорганизмов в наземных горячих источниках. Осуществлена количественная оценка структуры микробного сообщества трех горячих источников. Выявлены новые филогенетически обособленные кластеры некультивируемых метаногенных архей, и впервые показана их широкая распространенность в наземных горячих источниках. С помощью сочетания молекулярных и культуральных методов значительно расширены представления о разнообразии метаногенов, обитающих в наземных горячих источниках.
Проведена масштабная реконструкция филогении метаногенных и метанотрофных архей. Подтверждено отсутствие случаев горизонтального переноса гена mcrA.
Практическая значимость. Определен диапазон Г+Ц состава 16S рРНК, позволяющий прогнозировать адаптацию к высоким температурам архей некультивируемых групп.
Разработаны, а также in-silico и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16S рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера ANME-1, включая термофильные микроорганизмы этого кластера.
Получена стабильная синтрофная метанол-использующая метаногенная накопительная культура, растущая при 65С, представляющая интерес для очистки сточных вод целлюлозных производств.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях «AGU Fall Meeting 2009», «Biodiversity, molecular ecology and biogeochemistry of thermophiles - 2010», «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний 2011», на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2011» и на на международной конференции «9th international congress on extremophiles - 2012».
Публикации. Материалы диссертации содержатся в 10 печатных работах: 4 экспериментальных статьях и 6 тезисах.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
страницах машинописного текста и включает 20 рисунков и 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, который содержит наименований.
Место проведения работы и благодарности. Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН) и в лаборатории Джулии Хубер (The Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory). Секвенирование последовательностей генов 16S рРНК и mcrA выполнялось в Центре Биоинженерии РАН и в Центре сравнительной молекулярной биологии и эволюции MBL, США. Подбор олигонуклеотидных праймеров, а также анализ зависимости Г+Ц состава 16S рРНК архей и их температурного оптимума был проведен совместно с к.б.н. Лебединским А.В. (ИНМИ РАН). Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А., к.б.н. Лебединскому А.В., к.б.н. Черных Н.А., д.б.н. Соколовой Т.Г., а также доктору Хубер Д.А. за практическую помощь и ценные советы. Автор приносит искреннюю благодарность всем сотрудникам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ.
