Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14-49
1.1. Современные представления о микробиоме и иммунитете человека.14-16
1.1.1. Критические периоды развития иммунной системы ребенка .16-23
1.1.2. Роль кишечной микробиоты в формировании иммунного ответа 23-31
1.2. Особенности толстокишечной микробиоты детей 31-49
1.2.1. Дисбиозы и функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта у детей 31-38
1.2.2. Основные симбионты кишечника - бифидобактерии и современные методы их идентификации 38-49
Глава 2. Материалы и методы исследований .49-62
2.1. Объекты исследований 50-51
2.2. Методы исследований 51-62
Глава 3. Многолетняя динамика структуры кишечных дисбиозов у детей 62-68
Глава 4. Характеристика интестинальных микробиоценозов у детей дошкольного и школьного возраста 68-88
4.1. Характеристика интестинальных микробиоценозов у детей с функциональными нарушениями первого года жизни 69-76
4.2. Особенности интестинальных микробиоценозов у детей с функциональными нарушениями старше одного года 76-82
4.3. Особенности интестинальных микробиоценозов здоровых детей 82-84
4.4. Возрастная динамика изменений микробиоты кишечника у детей с функциональными нарушениями .84-88
Глава 5. Видовая архитектоника бифидобактерий у детей 89-110
5.1. Видовая архитектоника бифидобактерий кишечной микробиоты детей с функциональными нарушениями, обследованных в разные годы 89-93
5.2. Видовой состав бифидобактерийу детей разного возраста с функциональными нарушениями 93-95
5.3. Характеристика видового состава бифидобактерий у детей в зависимости от состояния здоровья и микробиоценоза кишечника .96-98
5.4. Видовая сочетаемость бифидобактерий, вегетирующих в кишечном биотопе детей с функциональными нарушениями 98-101
5.5. Анализ видовой сочетаемости бифидобактерий у здоровых детей.101-103
5.6. Анализ парных видовых сочетаний бифидобактерий .104-109
Глава 6. Обсуждение результатов 110-117
Выводы 118-119
Практические рекомендации 119
Список литературы 121-147
- Критические периоды развития иммунной системы ребенка
- Многолетняя динамика структуры кишечных дисбиозов у детей
- Особенности интестинальных микробиоценозов у детей с функциональными нарушениями старше одного года
- Видовой состав бифидобактерийу детей разного возраста с функциональными нарушениями
Введение к работе
Актуальность исследования
Микробиом желудочно-кишечного тракта является наиболее разнообразным по видовому составу и количеству метаболических путей среди всех симбиотических систем человеческого тела. Согласно данным проекта Human Microbiome Project (HMP), общее число бактерий в микробиоме в 10—100 раз превышает число клеток самого человека, а количество генов микробиоты кишечника в 150 раз превосходит число генов человека (Курильщиков А.М. с соавт., 2012; Li M. et al., 2008; Peterson J. et al., 2009; Tlaskalova-Hogenova H. et al., 2011; Morowitz M. J.et al., 2011; Lita M. Proctor, 2011; Khan A.A. et al., 2012).
Пищеварительный тракт человека населен преимущественно бактериями (90–95% генетического материала). Доля вирусных геномов составляет примерно 5%, геномов архей – до 1%, других эукариот без учета генома человека – не более 1% (Arumugam M. et al., 2011). Большинство бактерий относятся к родам Bacteroides (до 30 % всех бактерий в кишечнике), Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus и Bifidobacterium. Кишечная микробиота участвует в метаболических процессах усвоения питательных веществ, является источником некоторых метаболитов, которые человек не может синтезировать сам, влияет на состояние иммунитета и здоровье человека в целом (Sellon R. K. et al., 1998). Одним из наиболее очевидных примеров является усвоение короткоцепочечных жирных кислот, единственным источником получения которых является симбиотическая микробиота кишечника (Lupton J. R., 2004; Qin J. et al, 2010). Основную иммуномодулирующую роль в организме играют бифидобактерии (Шендеров Б.А., 2005; Белоусова Е.А.с соавт., 2008; Orrhage K., 2000; Lyons A. et al., 2010; Feng T., Elson C.O. 2011; Atarashi K. et al., 2011). Характеристика видового разнообразия бифидобактерий, их качественное и количественное соотношение в кишечнике человека являются важным индикатором степени влияния внешних дестабилизаторов (продуктов техногенного загрязнения, некачественных продуктов питания, лекарственных средств). Обнаружена корреляция между видовым составом бифидобактерий и наличием заболеваний кишечника у детей (Ouwehand A.C. et al., 2001; Collado М.С. et al., 2008; Kallus S. J. et al., 2012). Высокая численность видов бифидобактерий у детей оказывает видоспецифичное стимулирующее действие на развитие и созревание иммунной системы (Hedmark H. I., 2011). Одни виды: Bifidobacterium bifidum, B.dentium, B.longum, воздействуя на Th1 и Th2, запускают «цитокиновый каскад» с синтезом провоспалительных цитокинов, другие виды (B.breve) обладают слабо или не обладают (B.adolescentis) этой способностью (Young S.L. et al., 2004).
Несмотря на значительное число исследований, посвященных таксономическим, морфологическим, физиологическим особенностям бифидобактерий, изучению вопросов
качественного и количественного состава бифидобактерий (Шкопоров А.Н. с соавт., 2006; Амерханова А.М., 2009; Gavini F. et al., 2001; He F. et al., 2001), молекулярной физиологии и молекулярных механизмов взаимодействия бифидобактерий с организмом хозяина (Иванова Е.В., 2010; Ventura M. et al., 2005; O'Hara Ann M. et al., 2006; De Dea Lindner J. et al., 2007; Perdigon G. et al., 2002; Medici M. et al., 2005), остается актуальным вопрос, касающийся изучения видового профиля и комбинационного разнообразия бифидобактерий при различных состояниях микробиоценоза кишечника человека. Анализ видового спектра бифидобактерий даст дополнительную информацию для оценки микроэкологического статуса кишечника при функциональных нарушениях желудочно-кишечного тракта (ФН ЖКТ) у детей, сделает возможным конструирование пробиотических консорциумов в соответствии с характеристикой видового профиля бифидобактерий, что, по мнению ряда исследователей, представляет собой новый концептуальный подход к коррекции микрофлоры кишечника (Амерханова А.М., 2009; Famularo G. et al., 1999; Sanders M.E. et al., 1999; Dunne C. et al., 1999; Rolfe R.D. et al., 2000; Sarkar S., 2013; Riscuta G., 2013; Stein R.R. et al., 2013).
Цель исследования:
Определение видовой архитектоники и предпочтительных ассоциаций видов бифидобактерий у детей с ФН ЖКТ как основы для адекватной коррекции микроэкологических нарушений.
Для достижения поставленной цели были поставленны следующие задачи:
-
Проанализировать динамику микроэкологических нарушений у детей с клиническими проявлениями кишечного дисбиоза. Оценить микроэкологический статус биоценоза (эубиоз или дисбиоз) в зависимости от выявленных нарушений в количественном и качественном составе микробиоты кишечника.
-
Изучить при помощи молекулярно-генетических методов видовую архитектонику фекальной бифидофлоры у детей разного возраста и выявить доминирующие виды, возрастные особенности, ассоциации видов.
-
Оценить комбинационное разнообразие ассоциаций видов бифидобактерий у детей разных возрастных групп, с определением характера межвидовой сочетаемости бифидобактерий.
Научная новизна работы и ее теоретическая значимость
Впервые определены предпочтительные ассоциации видов бифидобактерий у здоровых детей и детей с ФН ЖКТ и установлено, что у здоровых детей преобладают многокомпонентные видовые ассоциации бифидобактерий, свидетельствующие о большей стабильности (устойчивости) кишечной экосистемы.
Впервые показано, что независимо от возраста, структура видовой архитектоники бифидобактерий у детей с ФН характеризуется доминированием B.bifidum, B.catenulatum, снижением популяционного уровня B.longum и вегетацией B.adolescentis у части детской популяции.
Выявлены различия в видовой структуре бифидофлоры у здоровых детей и детей с ФН ЖКТ. У детей с ФН отмечено увеличение состава бифидофлоры до восьми видов по сравнению с шестью видами у здоровых детей. У детей с ФН отсутствовал доминирующий вид, тогда как у здоровых детей превалировал вид B.catenulatum.
Полученные в работе данные расширяют представления о роли видового спектра, композиционного состава микроорганизмов кишечника, характера их коммуникаций в норме и при патологии.
Практическая значимость и внедрение результатов исследований
Результаты анализа видового состава бифидобактерий у детей с ФН могут быть использованы в качестве критериев подбора эффективных пробиотических консорциумов для адекватной коррекции дисбиоза кишечника.
Результаты натурных и экспериментальных исследований легли в основу Базы данных: Микроэкологический пейзаж вагинального и кишечного биотопов у женщин и девочек-подростков города Иркутска: Рег. номер св. 2011620075 (24.01.2011); правообладатель Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН.
Разработано пособие для врачей, научных работников, преподавателей, которое внедрено в практическое здравоохранение: «Региональные особенности микробной экологии у детей Иркутской области» // Пособие для врачей. Иркутск: РИО ИГИУВа, 2009.-36 с./Рец. д.м.н., проф. Киборт Р.В., к.м.н. Ленок Г.В.
Полученные новые данные используются в учебном процессе кафедры эпидемиологии и микробиологии ГБОУ ДПО ИГМАПО, кафедры физико-химической биологии ГОУ ВПО ИГУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Многолетняя динамика структуры кишечных дисбиозов у детей показывает значительное снижение глубоких изменений (IV и III степень) и рост, независимо от возраста, I и II степеней микроэкологических сдвигов, а также отсутствие эубиотических состояний. Микроэкологические нарушения обусловлены низким уровнем популяционной плотности индигенной флоры, появлением кишечных палочек с измененными свойствами, высоким уровнем индикации условно-патогенной микрофлоры (УПМ) в диагностически значимых количествах, а также изменениями межвидовых взаимодействий в составе кишечного микробиоценоза.
-
Независимо от возраста структура видовой архитектоники бифидобактерий у детей с ФН ЖКТ характеризуется доминированием B.bifidum, B.catenulatum, снижением уровня циркуляции B.longum и выявлением B.adolescentis, B. dentium.
-
Уменьшение видового спектра бифидобактерий в составе персистирующих ассоциаций у детей с ФН ЖКТ с характерным наличием антагонистических отношений в парах, образованных доминирующими видами, способствует нестабильности интестинальной микроэкосистемы.
Апробация материалов диссертации.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции посвященной 90-летию со дня рождения профессора А.Г.Гриневич (Иркутск, 2004 г.), 6-й Объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2009 г), 8-й научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2010 г.), IX научно-практической конференции молодых ученых, посвященная 35-летию УРАМН НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2011), Научно-практической конференции для врачей «Научные и практические аспекты дисбиозов» (Иркутск, 2011), Международной заочной научно-практической конференции «Вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2011 г.), XVI Международной научной конференции «Здоровье семьи–XXI век» (Венгрия, 2012), Научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института микробиологии и эпидемиологии ФБГУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН (Иркутск, 2012 г.), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 90-летию организации кафедры инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава РФ «Актуальные проблемы современной инфектологии» (Иркутск, 2013), IV Межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за инфекционными заболеваниями (Иркутск, 2013), Международном конгрессе «Питание и здоровье» (Москва. 2013 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научных работы, из них 11 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикаций материалов диссертационных работ, пособие для врачей, зарегистрирована в Роспатенте РФ база данных.
Объем и структура диссертации
Критические периоды развития иммунной системы ребенка
Микробная экологическая система человека — это сложный динамический комплекс, сформировавшийся в процессе онто-и филогенеза. Он включает в себя макроорганизм и разнообразные по количественному составу и таксономической принадлежности ассоциации бактерий, вирусов, грибов, простейших (микробиоту), а также их метаболиты, сконцентрированные в относительно открытых биологических системах организма человека (биотопах). Гетерогенные микробиоценозы, локализованные в различных биотопах (ротовой полости, пищеводе, желудке, тонкой и толстой кишке, влагалище, носовых ходах, коже, верхних и нижних дыхательных путях, конъюнктиве глаз), связаны между собой и с макроорганизмом симбионтом прочными генетическими, регуляторными, метаболическими, клеточными и энергетическими связями. Таким образом, организм человека и его эндогенная микробиота — это единая экологическая система, которая характеризуется способностью к саморегуляции и связана сложными механизмами непрерывного взаимодействия отдельных компонентов внутри системы, а также целостной системы с окружающей средой. Как известно, иммунная система человека в большой степени зависима от активности микробной экосистемы. Созревание полноценной иммунной системы невозможно без физиологического формирования микробной экологической системы. Кроме того, микробная экосистема является важным фактором, поддерживающим активность иммунобиологической реактивности организма. Нормальная индигенная микрофлора осуществляет регуляцию иммунного ответа на локальном и системном уровнях. Метаболическая активность микрофлоры кишечника способствует высвобождению энергии в ходе утилизации нутриентов, участвует в трофике эпителия слизистой, выполняет защитную функцию, препятствуя колонизации и инвазии патогенов, обеспечивает адекватное функционирование иммунных структур кишечного барьера и выполняет ряд других полезных функций (Белобородова Н. В. с соавт., 2000; Bоckhed F. et al., 2004; Shimizu K.et al., 2006; Tlaskalova - Hogenova H. et al., 2011; Morowitz M. J. et al., 2011). Поэтому очевидно, что неизбежным следствием поражения микробной экологической системы являются иммунные нарушения, которые влекут за собой дальнейшее развитие каскада патологических изменений в организме.
Формирование и становление иммунной системы — это процесс, который определяется взаимодействием генной регуляции развития с факторами (антигенами) внешней среды. На определенных этапах роста происходят депрессия генов и переключение генной регуляции фенотипа и особенно функций иммунокомпетентных клеток. Периоды проявления таких изменений генетического контроля предлагается называть критическими.
Согласно концепции J. В. Solomon (l971), в онтогенезе человека и животных существуют так называемые верстовые столбы или вехи (milestones), маркирующие переходные периоды общего развития и эквивалентные состояния иммунной системы. Во внутриутробном периоде критическим следует считать возраст 8—12 недель, когда происходит дифференцировка органов и клеток иммунной системы (что соответствует критерию критических периодов П. Г. Светлова в антенатальном развитии) (Стефани Д.В., Вельтищев Ю.П., 1996).
Первым критическим периодом после рождения является период новорожденности, когда организм внезапно встречается с огромным количеством антигенов. Иммунная система подвержена сильным супрессорным влияниям, пассивный гуморальный иммунитет обеспечивается материнскими антителами.
Отмечаются функциональный дисбаланс Т-лимфоцитов, несоответствие эпитопов CD или ОКТ супрессорной или хелперной функции клеток. Определяется расхождение фенотипа и функций Т-лимфоцитов, при этом все Т лимфоциты новорожденных несут маркер незрелости CD la (ОКТ6), исчезающий в зрелых клетках. На В-лимфоцитах экспрессированы типичные антигены CD 19, CD20, CD23, CD25, но лишь ограниченное их число способно к синтезу и секреции иммуноглобулинов и только класса IgM. Нейтрофилез в крови сменяется абсолютным лимфоцитозом. Процессинг антигенов снижен и в силу функциональной слабости фагоцитов. Низкая активность естественных киллеров сочетается с ограниченным синтезом гамма - интерферона. Для этого периода характерны низкая резистентность по отношению к условно-патогенной, гноеродной, грамотрицательной флоре, некоторым вирусам (герпес, цитомегаловирус, Коксаки В). Отмечается склонность к генерализации микробно-воспалительных процессов (септические состояния). Сниженная резистентность к условно-патогенной микрофлоре проявляется у детей первого месяца жизни в грубых дисбиотических нарушениях в составе нормальной микрофлоры кишечника. По данным Левановой ЛА. (2003) у новорожденных детей на фоне сниженного уровня бифидо-лактофлоры в кишечном микробиоценозе преобладают представители семейства Enterobacteriaceae. Доминирующее положение среди них занимают клебсиеллы, кишечные палочки с измененными свойствами и микроорганизмы рода Proteus (Леванова Л.А., 2003).
Второй критический период (3—6 мeсяца) характеризуется ослаблением пассивного гуморального иммунитета в связи с катаболизмом материнских антител. В этот период сохраняется супрессорная направленность иммунных реакций при выраженном лимфоцитозе. На большинство антигенов (инфекции) развивается первичный иммунный ответ с преимущественным синтезом IgM-антител, не оставляющим иммунологической памяти. Такой тип иммунного ответа наступает также при вакцинации против столбняка, дифтерии, коклюша, полиомиелита, кори и только после 2—3-й ревакцинации развивается вторичный иммунный ответ с образованием IgG-антител и стойкой иммунологической памяти. Вакцинация может не повлечь иммунного ответа, если в крови детей еще циркулируют материнские антитела или если дети получали по показаниям препараты крови, гамма - глобулина, плазмы. Дети сохраняют очень высокую чувствительность к PC-вирусу, вирусам парагриппа, аденовирусам (пневмонии, бронхиолиты). Вирус гепатита В редко вызывает желтушные формы болезни, чаще — акродерматит (синдром Джанотти — Крости). Атипично протекают коклюш, корь, не оставляя иммунитета. Проявляются недостаточность системы местного иммунитета (повторные ОРВИ), многие наследственные иммунодефициты, нарастает частота пищевой аллергии. В этом периоде усугубляются дисбиотические процессы. У детей 3-6 месяцев снижается уровень бифидо-лактофлоры, возрастает удельный вес кишечных палочек с измененными свойствами, микроорганизмов рода Протея, коагулазоположительных стафилококков. Пик частоты колонизации детей УПМ приходится на второе полугодие жизни. В этот возрастной период (на фоне введения прикорма) достоверно возрастала частота выделения грамотрицательных энтеробактерии в основном за счет клебсиелл и гемолизирующих эшерихий. Возможно, этим изменением кишечного микробиоценоза можно объяснить повышенный риск развития кишечных инфекций в период введения прикормов грудному ребенку (ЛевановаЛ.А., 2003; Николаева И.В., 2011).
Третий критический период — 2-й год жизни. В это время значительно расширяются контакты ребенка, получившего навыки свободного передвижения, с внешним миром. Сохраняется первичный характер иммунного ответа на многие антигены, однако синтез IgM антител уже переключается на образование антител класса G. В этот период дифференцируются клоны В-лимфоцитов, синтезирующие субклассы IgGi и IgG3. Однако синтез субклассов IgG2 и IgG4 запаздывает. Содержание лимфоцитов в крови достигает максимальных значений. Супрессорная направленность иммунной системы сменяется преобладанием хелперной функции по отношению к клонам В - лимфоцитов, синтезирующих IgM, IgGi, IgG3. Система местного иммунитета остается неразвитой, дети чувствительны к респираторным вирусным инфекциям. Полисахаридные антигены отдельных серотипов пневмококка вообще не индуцируют гуморального иммунитета, он отсутствует по отношению к палочке инфлюэнцы у 30% детей данного возраста. В этот период начинают проявляться многие минорные аномалии иммунитета, иммунокомплексные, аутоиммунные болезни. Проявления иммунопатологического диатеза (атопия, аутоиммунный диатез) четко не дифференцируются. Дети особенно склонны к повторным вирусным и микробно-воспалительным заболеваниям органов дыхания. С возрастом дисбиотические состояния улучшаются - повышается частота высеваемости типичных кишечных палочек, снижается встречаемость лактозонегативных, гемолизирующих эшерихий, клебсиелл, протея, стафилококков. Однако, по сравнению с более старшими возрастными группами у двухлетних детей эти группы условно-патогенных микроорганизмов еще занимают значительное место в общем микробиоценозе кишечника. Что касается грибов рода Candida, их высеваемость возрастает по сравнению с детьми 1-го года жизни (Онищенко Г.Г., 2002; Амерханова А.М., 2010).
Многолетняя динамика структуры кишечных дисбиозов у детей
Нормальная микрофлора ЖКТ, является первичной мишенью любых попадающих в него с пищей или водой соединений, которые прямо или косвенно влияют на формирование и функционирование ассоциаций микроорганизмов. Если по своей интенсивности такое влияние превышает компенсаторные возможности экологической системы «макроорганизм – его нормальная микрофлора», то возникают микроэкологические или, иначе – дисбиотические нарушения, которые нередко являются пусковым механизмом развития, а в дальнейшем, и поддержания различных патологических состояний (Sekirov I. et al., 2009; Martinez M. et al., 2009; Morowitz J. et al., 2010). По данным научной литературы дисбиозами в настоящее время страдают около 90% населения РФ, при этом частота встречаемости дисбиозов у детей варьирует. К моменту выписки из родильного дома только около 30% детей имеют нормально сформированную микрофлору кишечника. В последние годы прослеживается четкая тенденция к росту дисбиотических состояний среди здоровых детей раннего возраста. В ряде случаев у 45,8% детей грудного возраста выявляется дисбиоз кишечника. У детей от одного года до двух лет дисбиоз кишечника встречается в 8,6% случаев, от 2-х до 3-х лет – от 7,8% до 48,5% случаев, у здоровых детей ясельного возраста – в 33-50% случаев. В то же время у детей, проживающих в экологически более чистых районах, частота встречаемости дисбиоза кишечника не превышает 35-40%, а в некоторых районах России – и 20% (Алешкин В.А. с соавт., 2011).
Все это побудило нас проанализировать динамику структуры кишечных дисбиозов у детей дошкольного возраста, проживающих в нашем регионе на протяжении длительного времени наблюдений (с 1990 по 2011 гг.). Кроме того, особый интерес вызывает вопрос о влиянии социально экономических факторов на кишечную микробиоту человека в динамично изменяющихся экономических условиях. В ряде иностранных исследований уже обсуждалась эта проблема, однако исследования проводились в странах с более устойчивой экономикой (Эстония, Швеция) по сравнению с изменяющейся в последние 10-15 лет экономикой Российской Федерации (Sepp Е. et al., 2007). К тому же в вышеназванных исследованиях анализ осуществлялся на малых выборках, от 8 до 19 детей в группах сравнения. При этом наблюдения охватывали также небольшой период – 1993-1997 гг.
В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования было оценить динамику структуры кишечных дисбиозов у детей дошкольного возраста, рожденных в разные годы за период с 1990 г. по 2011 г. Дошкольный возраст является наиболее показательным для оценки влияния вредных факторов окружающей среды, так как дети данной возрастной группы не испытывают воздействия производственных вредностей и радиус их жизнедеятельности в основном ограничен домом и детским учреждением (Студеникин М.Я. с соавт., 1994; Вельтищев Ю.В., 1995; Леванова Л.А., 2003). Все обследованные на кишечный дисбиоз дети имели клинические проявления дисбиоза кишечника: диспепсический синдром, диареи, запоры, колиты.
Всего на кишечный дисбиоз было обследовано 3538 детей, рожденных и проживающих в г. Иркутске и распределенных на следующие группы: 1. по возрасту - дети до 1 года и дети от 1 года до 6 лет; 2. каждая возрастная группа - в зависимости от периода обследования (1990-1996 гг., 2000-2002 гг., 2006-2007 гг., 2008 г., 2009 г., 2010 г., 2011 г.) (табл. 3.1). Таким образом, в общей сложности материал был проанализирован по 14-и группам сравнения.
Оценка результатов бактериологических исследований основывалась на современных представлениях о физиологических соотношениях различных видов индигенных микроорганизмов кишечника. У детей изучаемых возрастных категорий в первом наблюдаемом нами периоде обследования (1990–1996 гг.) бактериологически определялся как дисбиоз IV степени (16,0±3,2% и 10,0±1,4% соответственно для детей до года и от года до 6 лет), так и эубиоз-микроэкологическая норма (3,0±1,4% и 13,0±1,6%). Причем, у этих детей с возрастом частота дисбиотических нарушений IV степени уменьшилась с 16% до 10% , а доля эубиоза увеличилось с 3% до 13% (р0,05).
У детей, обследованных в 2000-2002-2010 гг., отсутствовали эубиоз и IY степень дисбиоза, эубиотические состояния микробиоценоза кишечника были зарегистрированы только в 2011 г. у небольшой части обследованных детей до года (0,5±0,5%) и детей второй возрастной группы (6,81±0,98%). У детей обеих возрастных групп, обследованных в период 2000-2002 гг., наблюдается стойкий рост (р0,05) дисбиозов II степени по сравнению с ранним этапом наблюдений (табл.3.1,3.2 ; рис.3.1,3.2).
Особенности интестинальных микробиоценозов у детей с функциональными нарушениями старше одного года
Спектр и коэффициенты постоянства облигатных микроорганизмов кишечного биоценоза детей более старшего возраста, повторяли параметры детей первого года жизни. При бактериологическом исследовании кала у них выявлены следующие дисбиотические нарушения: I степень дисбиоза – у 109 (63,0%); II степень – у 28 (16,3%);III дисбиоза у 3 (1,7%); нормоценоз определялся у 33 (19,0%) из обследованных детей (рис.4.2.1). Доминирующее положение в кишечном биоценозе детей старшего возраста занимали бифидобактерии и лактобациллы, которые имели коэффициент постоянства 100%, т.е. выделялись у всех детей (Табл.4.2.1). Среднее содержание бифидобактерий в кишечнике составляло 7,5±1,17 lg КОЕ/г, что было ниже нормы по общефизиологическим стандартам. Содержание лактобацилл соответствовало норме и составляло 7,0±1,43 lg КОЕ/г. Эшерихии также присутствовали у всех детей, однако у каждого третьего ребенка (31,2±3,52%) выделенные эшерихии определялись как атипичные, с потерей некоторых биохимических свойств (либо слабоферментативные, либо гемолитические).
Характер микроэкологического дисбаланса представлен на рисунке (Рис.4.2.2).У 35,2% детей отмечался дефицит бифидобактерий; у 20,8%- дефицит высокоактивных эшерихий, УПМ (суммарно) с высокой популяционной плотностью определялись у половины детей (48,6%). По сравнению с детьми первого года жизни у детей старшего возраста уже значительно реже выделялся золотистый стафилококк (12,7±2,53 случаев), а также УПМ сем. Enterobacteriaceae (у 45,7±3,78% детей).Спектр видов УПМ, изолированных из кишечника детей старшего возраста, в основном, повторял таковой детей первого года жизни, однако выделение патогенных грибов рода Candida у них увеличилось почти в 2 раза (12,7±2,53% случаев) по сравнению с младшей группой (7,8±3,0% случаев), а встречаемость УПМ из семейства Enterobacteriaceae была достоверно ниже (p0,5): Klebsiella spp.–у 22,0%; Enterobacter spp. у 16,1%; Citrobacter spp. у 4,6%; Proteus spp.у 3,4% обследованных.
Постоянными участниками (С50%) кишечного микробиоценоза детей были бифидобактерии (С=100%), лактобациллы (С=100%), эшерихии с нормальной ферментативной активностью (С=77,9%). Добавочными видами (25%С50%) эшерихии с атипичными свойствами суммарно (С=31,2%), энтерококки (С=49,7%), УПМ семейства Enterobacteriaceae (С=45,7%), клостридии (С=27,7%). Случайными видами (С25%) грибы рода Кандида (С=12,7%) и золотистый стафилококк (С=12,7%). Микроэкологические связи компонентов биоценоза у детей старшего возраста так же были противоречивыми (Табл.4.2.2). Значения коэффициента Жаккара, характеризующие взаимодействие между E. сoli, бифидобактериями, лактобациллами, энтерококками указывали на возможность совместного существования. Критерий же Р, как и в группе детей до года, характеризовал взаимодействие между бифидобактериями, лактобациллами и энтерококками, бифидобактериями и E. сoli как случайное распределение(Р=С). Взаимодействие между E. сoli и энтероккоками было определено как возможность совместного существования (Р С;СР=1,0).
Отношения в группе добавочных видов - УПМ сем. Enterobacteriaceae и основными представителями индигенной флоры - бифидобактерии, высокоактивная E. сoli свидетельствуют о способности к совместному существованию. При этом, значение Р в группе бифидобактерии - УПМ сем. Enterobacteriaceae характеризовалось как случайное распределение. В группе УПМ - высокоактивная E. сoli отмечалась высокая экологическая общность и склонность к совместному существованию (Р С;СР=2,7). В группе случайных видов между E. сoli- S. аureus отмечались антагонистические отношения (Р С;СР=-0,2).Коэффициент Жаккара у E. сoli и Candida spp. указывал на антагонистические отношения (q=13,1), но использование критерия Р показало наличие экологической общности и склонность к совместному существованию (СР=0,8). Отношения в биотопе между группой бифидобактерии - S. аureus -Candida spp. характеризовались как антагонистические.
Видовой состав бифидобактерийу детей разного возраста с функциональными нарушениями
Результаты наших исследований видового состава кишечной бифидофлоры у детей разного возраста представлены в таблице (Табл.5.2.1). Было установлено, что B.bifidum с высокой частотой встречались у людей всех возрастных групп, но наибольшей частота их встречаемости была у грудных детей (80,5%). С возрастом имело место снижение частоты встречаемости бифидобактерий этого вида (до 53,3% в группе 12-15 лет) и оно было статистически значимым (р0,05). Частота обнаружения бифидобактерий вида B.longum в интестинальной микрофлоре детей от рождения до 6 лет составляла более 50 % и достоверно снижалась к подростковому возрасту до 23% (р0,05). Наоборот, частота встречаемости бифидобактерий вида B.catenulatum имела тенденцию к росту с увеличением возраста, этот вид доминировал в группе детей 1-2 года и у 4-6-ти летних детей (в 70,3% и 65,8% соответственно).)
B.breve были обнаружены только у детей до 6 лет, а в группе подростков 12-15 лет бактерии этого вида обнаружены не были. Наиболее физиологичный для детей грудного возраста вид B.infantis встречался только у 14,2% детей в группе до 6 месяцев. Частота встречаемости B.adolescentis составляла более 30 % во всех возрастных группах. Вид B.angulatum не был обнаружен у детей до одного месяца, в дальнейшем у детей 3-6 месяцев и 1-2 года бактерии этого вида обнаружены с частотой 7,8% и 9,5% соответственно. У детей старшего возраста частота обнаружения B.angulatum составила 8,2% у детей 4-6 лет и 11,5% у подростков 12-15 лет. Обращает на себя внимание довольно высокий уровень обнаружения
B.dentium у грудных детей (22%) и детей подростков (26,9%). По данным ряда авторов, B. dentium является единственным оппортунистическим микроорганизмом рода Bifidobacterium, он был обнаружен в высоких титрах в дентине кариозных повреждений у детей и вызывал кариес зубов (Becker M.R. et al., 2002; Ventura M. et al., 2009). Этот вид обладает более высокой, чем у других бифидобактерий биохимической, катаболистической, ферментативной, адгезивной активностью, что способствует выживанию его в полости рта. Определение B. dentium в кишечнике, по нашему мнению, может свидетельствовать о высоком риске развития кариеса у детей.
Таким образом, при изучении видового состава кишечных бифидобактерий было выявлено, что у детей до двухлетнего возраста доминирующими таксонами являются бифидобактерии видов B.bifidum, B. longum и B. catenulatum,а также B. adolescentis и B.breve. У детей 6 лет и у подростков бифидофлора в основном была представлена видами B. bifidum , B. catenulatum ,B. longum, B. adolescentis и B.dentium.
Полученные нами данные по возрастному видовому профилю бифидобактерий у детей отличались от предложенных другими исследователями ориентиров для здоровых детей. Так, по данным (Кулагина Е.В., Шкопоров А.Н., 2010; Жиленкова О.Г., 2011) у детей в возрасте до 1 мес. чаще встречались B. breve, B. infantis, B. longum, а у детей более старшего возраста бифидофлора, в основном была представлена B. longum, B.adolescentis, B. catenulatum и B. bifidum. Данные различия и предопределили направленность наших исследований с целью проведения анализа видового состава бифидофлоры в зависимости от состояния здоровья и микробиоценотической структуры кишечника. В исследовании была сформирована группа детей старше одного года, у которых микробиоценоз кишечника прошел все стадии сукцессии и находился в состоянии динамического равновесия. В зависимости от состояния микробиоценоза дети были поделены на две группы: 1 группа -эубиоз кишечника (33 человека); 2 группа - дисбиоз кишечника (140 человек). Из группы здоровых детей ДНК бифидобактерий по техническим причинам удалось получить только у 32 человек, которые составили 3 контрольную группу. Микробиоценоз кишечника у детей с эубиозом характеризовался отсутствием УПМ, содержанием бифидобактерий в количестве 8,3±0,46 lg KOE/г, наличием кишечной палочки без атипичных форм. Микробиоценоз кишечника здоровых детей описан выше (раздел 3.3). Видовой пейзаж бифидобактерий здоровых детей характеризовался доминированием B.catenulatum, который определялся у всех детей в 100% случаев, высоким уровнем детекции B.longum (у 75,0%), B.infantis и B.adolescentis (у 46,8%), B.breve (у 28,1%) обследованных детей. Виды B. dentium и B. angulatum у здоровых детей не были обнаружены.
