Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Чума: заболеваемость, вирулентность возбудителя, клинические формы инфекции 17
1.2. Экстренная профилактика и лечение чумы 24
1.3. Специфическая профилактика чумы 32
ГЛАВА 2. Материал и методы 44
2.1. Штаммы 44
2.2. Антибактериальные препараты 45
2.3. Определение чувствительности / устойчивости штаммов чумного микроба к антибактериальным препаратам 46
2.4. Получение мутантов чумного микроба, устойчивых к ри-фампицину и налидиксовой кислоте 46
2.5. Изучение вирулентности культур чумного микроба 46
2.6. Изучение способности штамма Y. pestis 231 Fra~ преодолевать специфический иммунитет 47
2.7. Расчет суточной дозы антибактериальных препаратов для мышей, исходя из среднетерапевтической человекодозы 48
2.8. Оценка влияния профилактического применения антибактериальных препаратов на формирование поствакцинального (EV НИИЭГ) и постинфекционного иммунитета у мышей в случае вакцинации или инфицирования их чувствительными к антибиотикам штаммами возбудителя чумы 49
2.9. Изучение влияния вакцинации в ранний период развития инфекционного процесса на течение и исход эксперимен тальной чумы у мышей 50
210. Комбинированное использование антибактериальных препаратов в профилактике и лечении чумной инфекции у мышей 51
211. Изучение иммуногенности культур чумного микроба 51
211.1. Отбор иммуногенных клонов из популяции изучаемых культур 51
2112 Определение степени иммуногенности культур (ED50) 52
2.113. Определение степени иммуногенности антибиотикорези-стентных культур чумного микроба на фоне профилактического применения антибактериальных препаратов 53
211.4. Оценка напряженности иммунитета 53
2.12 Изучение эффективности профилактического применения антибактериальных препаратов per se и в сочетании с иммунизацией; оценка формирования противочумного иммунитета... 54
213. Серологические реакции 55
2.14. Статистическая обработка результатов 55
ГЛАВА 3. Сравнительное изучение влияния антибактериальных препаратов разных групп на формирование противо чумного иммунитета у мышей 56
3.1. Влияние профилактического (через 5 ч после иммунизации) применения антибактериальных препаратов на формирование поствакцинального иммунитета у мышей, обусловленного антибиотикочувствительным штаммом EV НИИЭГ -основы вакцины чумной живой сухой 56
3.2. Влияние профилактического (через 5 ч после заражения) применения антибактериальных препаратов на формирование постинфекционного иммунитета в экспериментах на мышах 60
3.3. Влияние вакцинации в ранний период развития инфекционного процесса на течение и исход экспериментальной чумы у мышей 63
ГЛАВА 4. Изучение иммуногенных вариантов штаммов чумного микроба с маркерами резистентности к антибактери альным препаратам 67
4.1. Иммуногенные антибиотикорезистентные варианты штамма чумного микроба EV НИИЭГ \EV Rif Nalr, EV Rif Щтъ)\ 67
4.1.1. Изогенные варианты штамма EV НИИЭГ с мутациями устойчивостик рифампицину (Rif *) и налидиксовой кислоте (NaT) 67
4.1.2. Изогенный вариант штамма EV НИИЭГ с мутацией резистентности к рифампицину (Rif1) и плазмидной устойчиво стью к стрептомицину и тетрациклинам [R(SmTc>] 71
4.2. Иммуногенный авирулентный мономицинорезистентный мутант Y. pestis 363 Мопг с перекрестной устойчивостью к аминогликозидам 74
ГЛАВА 5. Эффективность антибактериальных препаратов per se и в сочетании с иммунизацией антибиотикоустойчивыми культурами чумного микроба и антигеном f i при экспериментальной инфекции у мышей, обусловленной природными типичными штаммами возбудителя; формирование противочумного иммунитета 79
5.1 Доксициклин 80
5.2. Рифампицин 82
5.3. Фторхинолоны 84
5.4. Аминогликозиды 87
5.5. Цефтриаксон (представитель цефалоспоринов Ш поколения) 92
5.5.1. Влияние F I антигена на течение и исход инфекционного процесса в экспериментах на мышах 93
5.5.2. Эффективность профилактического применения цефтриак-сона в сочетании с иммунизацией фракцией І у мышей, инфи цированных типичным в антигенном отношении штаммом возбудителя; формирование противочумного иммунитета 94
ГЛАВА 6. Оценка перспектив сочетанной специфической и экстренной профилактики при экспериментальной чуме мышей, вызванной генетически измененными штам мами возбудителя 97
6.1. При инфекции, обусловленной штаммом 231 с Fra" фенотипом 97
6.1.1. Вирулентность, способность преодолевать специфический иммунитет, антибиогикочувствительность Y. pestis 231 Fra" 97
6.1.2. Влияние профилактического применения (через 5 ч после заражения) антибактериальных препаратов на формирование постинфекционного иммунитета у мышей, инфицированных Y.pestis 231 Fra~ 100
6.1.3. Эффективность профилактического применения антибактериальных препаратов при инфекции у мышей, обусловленной возбудителем с Fra~ фенотипом 102
6.1.4. Эффективность профилактического применения препаратов на фоне иммунизации устойчивыми к ним штаммами чумного микроба при экспериментальной чуме мышей, вызванной Y. pestis 231 Fra" ,, 106
6.2, При инфекции, обусловленной штаммом с плазмидной устойчивостью к стрептомицину и тетрациклинам ИЗ 231
ГЛАВА 7. Некоторые критерии оценки перспективности иммуно- генных антибиотикорезистентных штаммов (лиофили-зированных препаратов) чумного микроба для целей сочетанной специфической и экстренной профилактики чумы; ориентировочные схемы ее применения 119
Заключение 126
Выводы 138
Список использованной литературы
- Чума: заболеваемость, вирулентность возбудителя, клинические формы инфекции
- Определение чувствительности / устойчивости штаммов чумного микроба к антибактериальным препаратам
- Влияние профилактического (через 5 ч после иммунизации) применения антибактериальных препаратов на формирование поствакцинального иммунитета у мышей, обусловленного антибиотикочувствительным штаммом EV НИИЭГ -основы вакцины чумной живой сухой
- Иммуногенные антибиотикорезистентные варианты штамма чумного микроба EV НИИЭГ \EV Rif Nalr, EV Rif Щтъ)\
Введение к работе
Актуальность проблемы. Анализ заболеваемости чумой в мире за последние десятилетия свидетельствует о неблагоприятном прогнозе в отношении этой высококонтагиозной, карантинной, конвенционной инфекции (Мишанькин Б.Н. с соавт., 1995; Иннокентьева Т.И., 2001; Брюханова Г.Д., 2002, 2004). По данным ВОЗ (WER, 2003), за период с 1987г. по 2001г. чума была зарегистрирована в 24 странах, всего заболело 36876 человек, из которых 2861 (7,8%) умер. В 1987-2001гг. основная заболеваемость и смертность приходилась на страны Африки и, прежде всего, на о. Мадагаскар» где в 95% случаев чума протекала в бубонной форме. С 1990г. по 1999г. заболеваемость чумой возросла более чем в 2 раза (WER, 2000). Наибольшую опасность представляет легочная форма инфекции (Gradon J.D., 2002 и др.), которую спустя длительный промежуток времени регистрировали в Танзании и Китае в 1991г. (Ткачев А.В., Мурначев Г.П., 1994; Lyamuya E.F. et al., 1992), в Замбии в 1995г. (Мс Clean K.L., 1995), в Китае - в 1997г. (WER, 1999 а), в Эквадоре в 1998г. (Gabastou J.M. et al., 2000), на Мадагаскаре - в 2000г. (Ratsitorahina М. et al., 2000 а), в Индии - в 1994 и 2002гг. (Butler Т., 1994; Jayaraman K.S., 1994, 1995; WER, 2002),
Конец XX и начало XXI столетия характеризуются активизацией природных очагов чумы. Так, при значительном сокращении объема эпизоотоло-гическнх наблюдений за природными очагами в РФ разлитые и локальные эпизоотии среди грызунов за последние 5 лет выявлены на территориях 7 регионов с общей площадью более 1 млн. га, где было выделено 752 штамма возбудителя чумы, в связи с чем приказом Министра здравоохранения РФ (№ 7, 2004) предложено усилить мероприятия по профилактике чумы.
Положение с заболеваемостью чумой в мире осложняется выделением от больных антибиотикорезистентных штаммов возбудителя. J.D. Wong et al. (2000) сообщают, что из 92 изученных штаммов Y. pestis 20% были устойчивы к рифамшщину и имипенему. Большие опасения вызывают сообщения об обнаружении в 1989г. на о. Мадагаскар у 13% клинических изолятов резистентности к тетрациклину (Rasoamanana В. et al, 1989), выделение там же двух штаммов с R-плазмидами множественной лекарственной устойчивости (inc С и inc Р групп несовместимости), в том числе с маркерами резистентности к стрептомицину, канамицину, тетрациклинам, хлорамфениколу, ампициллину, сульфаниламидам, спектиномицину (Galimand М. et al., 1997; Michel P., 1997; Guiyoule A. et al., 1998, 2001) и, наконец, регистрация снижения чувствительности к стрептомицину у всех клинических изолятов чумного микроба, выделенных на территории Южной Африки и на о. Мадагаскар (Ra-soamanana В. et al., 1989). Во время вспышки чумы в Танзании при легочной форме инфекции культуры возбудителя удавалось высевать из мокроты больных на фоне лечения тетрациклином и комбинацией стрептомицина с тетрациклином (Lyamuya E.F. et al., 1992). Этот регион может стать источником инфекции, вызываемой антибиотикорезистентными штаммами возбудителя, от завоза которой при возможностях современного транспорта не застрахована ни одна страна мира.
В настоящее время чрезвычайно остро стоит проблема биотерроризма (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000, 2003, 2004; Тихонов Н.Г., Липницкий А.В.» 2000; Martin G.J., Marty A.M., 2001; Whitby M. et al., 2002; Boulanger L.L. et al., 2004). По данным А.А. Воробьева (2001,2003), среди наиболее вероятных биоагентов чумной микроб занимает второе место после вируса оспы, При этом автор подчеркивает, что биоагенты должны характеризоваться способностью вызывать инфекцию с атипичной клинической картиной, не поддаваться лечению, иметь трудности в диагностике, преодолевать иммунитет. Если антибиотикорезистентные штаммы стали выделять от больных, в основном, в последние годы, то штаммы возбудителя чумы, лишенные способности продуцировать капсульный антиген фракцию I, выделяются постоянно в конце эпизоотии (Дроздов И.Г. с соавт., 1992; Андросова СВ. с соавт., 2002; Drozdov LG. et al., 1995; Davis К J. et al., 1996; Bakanidze L. et al., 2002; Meka-Mechenko T,V., 2003), и именно они отвечают вышеперечисленным требованиям. В литературе имеются данные о заболеваниях людей чумой, в том числе с летальным исходом, вызванных бесфракционными (Fra~, Fra*) штаммами возбудителя (Lawton W.D. et al., 1960; Winter CX. et al., 1960; Williams I.E. et al., 1978; Williams J. S., Cavanaugh D.C., 1983,1984; Davis KJ. et al., 1996). Среди
52 штаммов чумного микроба, выделенных от людей в разных очагах мира, встречались вирулентные культуры без плазмиды pFra (Fra" Тох" фенотип) и утратившие способность продуцировать F I антиген при сохранении плазмиды pFra (Fra^ Тох+ фенотип) (Лебедева С.А. с соавт., 2002). По мнению Т.А. Гремяковон (2004), именно природные Fra" штаммы возбудителя могут стать биологическим патогенным агентом бактериологического оружия.
Медицинская служба РФ должна быть готова к адекватному осуществлению полномасштабных противоэпидемических мероприятий на случай чрезвычайной ситуации.
При угрозе антропогенного распространения чумы наиболее действенным мероприятием является проведение сочетанной специфической и экстренной профилактики среди контингентов с наибольшим риском заражения (Абакаров У.А., 1965 а, б). Это положение, озвученное еще в 1965г., нашло понимание среди чумологов, что реализовалось в ряде исследований, направленных на получение иммуногенных антибиотикорезистентных штаммов чумного микроба (Малинина З.Е., 1962; Узенцов С.А., 1967; Рыжко И.В., Гамлешко Х.П., 1968; Гамлешко Х.П. с соавт., 1969; Домарадский И.В., Лебедева С. А., Сучков Ю.Г. с соавт., 1970). Однако наиболее близко к внедрению в практику полиантибиотикорезистентной вакцины подошли сотрудники НИИ микробиологии МО РФ (Евстигнеев В.И. с соавт., 1991; Пименов Е.В. с соавт., 1998, 2003; Дармов И.В. с соавт., 2003). Несмотря на то, что к настоящему времени разработана и <ошмическая» вакцина (Дальвадянц СМ. с соавт., 1998, 2003 а, б; Евстигнеев В.И. с соавт. 1998; Kutyrev V.V. et al., 2002), которая в принципе может быть применена одновременно с любым антибактериальным препаратом, авторы (Дальвадянц СМ. с соавт., 1997; Евстигнеев В.И., Кутырев В.В., Дальвадянц СМ. с соавт., 1998) предлагают ее только для ревакцинации, отдавая предпочтение живой корпускулярной вакцине из штамма EV НИИЭГ в качестве препарата «непревзойденного грундиммунизирующего». Именно живые вакцины, по мнению С.Н. Щелкунова (1998), должны быть использованы в чрезвычайных ситуациях, когда требуется создать иммунитет в кратчайшие сроки. Еще Е.И. Коробкова (1956), Е.И. Коробкова и Л.В. Самойлова (1962), Л.В. Самойлова (1963 a), R. Pollitzer (1954) указывали, что при вакци- нации живой вакциной иммунитет формируется к 5-7 дню.
В настоящее время сочетанное применение средств экстренной и специфической профилактики считается обязательным при использовании возбудителей высококонтагиозных инфекций (чума, оспа) в качестве бактериологического оружия в целях биотерроризма (Кузьмин М.Н. с соавт., 1999).
Приоритетность проведения сочетанной специфической и экстренной профилактики в системе противоэпидемических мероприятий определяется необходимостью купирования инфекционного процесса у потенциально инфицированных и скорейшего создания иммунной прослойки среди населения, прежде всего в группах с наибольшим риском заражения: медицинские работники, служба охраны порядка, транспорта, лиц, привлекаемых к подворным обходам, и т. д. В группах контактных, подлежащих изоляции, проведение сочетанной специфической и экстренной профилактики призвано в кратчайшие сроки (6 сут.) обеспечить не только эрадикацию возбудителя, если заражение имело место, но и формирование защиты от инфицирования в случае, если очаг еще не ликвидирован. Последовательное проведение экстренной профилактики и вакцинации (антибиотикочувствительная вакцина из штамма EV НИИЭГ) через 2 сут. после окончания курса этиотропной терапии (Инструкция по экстренной профилактике и лечению опасных инфекционных заболеваний, 1984; Руководство по профилактике чумы, 1992) удлиняет срок изоляции до 7-9 сут. в зависимости от применяемого препарата. В соответствии с Методическими указаниями (МУ 3.4. 1030-01., 2001) для док-сициклина и фторхинолонов курс экстренной профилактики - 7 сут., что создает дополнительные трудности экономического и организационного плана при том, что требуется еще 5-7 сут. для формирования специфической защиты от возможного заражения в очаге инфекции. .
До настоящего времени нет прямых экспериментальных доказательств преимуществ сочетанной специфической и экстренной профилактики перед их раздельным применением у потенциально инфицированных, в то время как важнейший вопрос, который должен быть решен - это безопасность (полезность) вакцинации под прикрытием антибиотикотерапии у лиц в инкубационном периоде заболевания.
Несмотря на хорошо известный положительный результат широкомасштабной иммунизации населения на о. Мадагаскар и о. Ява живыми вакцинами, обеспечившей резкое снижение числа заболеваний чумой вплоть до ее ликвидации (Often L., 1941; Girard G., Robic J., 1942), до настоящего времени высказываются сомнения о целесообразности проведения вакцинации в ходе эпидемии (Дмитровский A.M. с соавт., 1994 б). Необходимость экспериментального обоснования перспективности проведения экстренной профилактики на фоне иммунизации при угрозе антропогенного распространения чумы связана и с имеющимися данными о способности антибактериальных препаратов (тетрациклинов, фторхинолонов и др.) воздействовать на систему фагоцитоза, формирование гуморального иммунитета, на иммунокомпетентные клетки и т. д. (Смолкина Т.В, с соавт., 1992 а, б; Йорданова А.И. с соавт., 1995; Никитин А.В. с соавт., 1996; Иванова О.А., Калачев И.Я., 1999; Брискин Б.С. с соавт., 2000; Егоров A.M., Никитин А.В., 2003; Azuma Y. et al., 1999, 2001). Эти сведения, носящие противоречивый характер, нельзя не учитывать, в связи с чем требуются прямые доказательства отсутствия отрицательного влияния антибактериальной терапии, начатой одновременно с вакцинацией, на формирование противочумного иммунитета у инфицированных.
Цель исследования. Экспериментальное обоснование преимуществ сочетанного применения средств специфической (иммуногенные антибиоти-корезистентные штаммы, антиген F I) и экстренной (антибактериальные препараты) профилактики перед их раздельным использованием на модели чумной инфекции у беспородных белых мышей.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние рекомендованных (МУ 3.4. 1030-01., 2001) средств экстренной профилактики чумы (фторхинолоны, тетрациклины, аминогли-козиды, рифампицин, цефалоспорины III поколения) на формирование постинфекционного и поствакцинального иммунитета у мышей, инфицированных антибиотикочувствительными вирулентным и вакцинным (EV НИИЭГ) штаммами чумного микроба.
Оценить влияние иммунизации культурой штамма EV НИИЭГ (10 м.к.) или антигеном FI (100 мкг/мышь) в ранние сроки (через 5 ч) после заражения (-1000 LD50) на течение и исход экспериментальной чумы у мышей.
Провести оценку сохранения спектра, степени резистентности, иммуно-генности культур EV Rif rNalr, EV Rif rR
Получить сравнительные данные по эффективности (курс 5 сут.) средств экстренной профилактики per se и на фоне иммунизации устойчивыми к ним штаммами чумного микроба на модели инфекции у мышей, вызванной типичными в антигенном отношении штаммами возбудителя и вариантом, утратившим способность продуцировать F I антиген (Fra~ фенотип) (инфицирующая доза -1000 LD50); оценить напряженность формируемого противочумного иммунитета.
Изучить возможность применения доксициклина и стрептомицина на фоне иммунизации EV Rif rR
Оценить эффективность сочетанной иммунизации антигеном F I и экстренной профилактики цефтриаксоном, а также формирование специфической защиты у мышей от последующего заражения возбудителем чумы.
Разработать некоторые критерии оценки пригодности антибиотикорези-стентных иммуногенных штаммов чумного микроба для целей сочетанной специфической и экстренной профилактики чумы и ориентировочные схемы ее применения.
Научная новизна работы.
В результате проведенных исследований впервые: - дана сравнительная характеристика влияния рекомендуемых в настоящее время средств экстренной профилактики и лечения чумы на формирование постинфекционного и поствакцинального иммунитета у мышей, инфицированных антибиотикочувствительными вирулентным и вакцинным (EV НИИЭГ) штаммами чумного микроба: профилактическое применение фторхинолонов, аминогликозидов, рифампицина, цефалоспоринов Ш поколения резко подавляет формирование противочумного иммунитета (ИИ=п* 101 -102), в меньшей степени это характерно для тетрациклинов (ИИ=^п-103); показано, что иммунизация мышей культурой штамма EV НИИЭГ (106 м.к.) через 5 ч после заражения приводит к увеличению значений LD5o штаммов чумного микроба 231 и 231 Fra" на два порядка и удлинению средней продолжительности жизни павших на 2-5 сут., что свидетельствует о целесообразности вакцинации даже у инфицированных в инкубационном периоде заболевания; для проведения экспериментов использо доказано, что профилактическое применение фторхинолонов, аминогли-козидов, рифампицина, тетрациклинов на фоне иммунизации устойчивыми к ним штаммами чумного микроба на модели инфекции у мышей, вызванной типичными в антигенном отношении штаммами возбудителя (при курсе 5 сут.), обеспечивает не только высокий терапевтический эффект (80-100% выживших животных), но и не подавляет формирование противочумного иммунитета (ИИ=п-103); аналогичны результаты применения цефтриаксона на фоне иммунизации антигеном F I (ИИ=п-105); при инфекции, обусловленной Fra- штаммом возбудителя чумы, показано, что профилактика аминогликозидами, ципрофлоксацином, рифампици-ном и комбинацией последних (курс 5 сут), начатая одновременно с иммунизацией устойчивыми штаммами чумного микроба, приводит к выживанию 80-100% мышей и формированию иммунитета достаточной напряженности (ИИ=п-104); показано, что применение доксициклина и стрептомицина одновременно с иммунизацией устойчивым к ним штаммом чумного микроба обеспечивает достаточную степень эффективности даже при заражении устойчивым к этим препаратам вирулентным штаммом возбудителя, что делает реальным их профилактическое применение до определения антибиотикограммы возбудителя с возможной последующей заменой на высокоэффективный антибактериальный препарат.
Практическая значимость работы.
Проведена оценка перспективности сочетанной специфической и экстренной профилактики антибактериальными препаратами, рекомендованными МУ 3.4. 1030-01. (2001) в случае инфекции, вызванной возбудителем чумы, типичньж в антигенном отношении, и «Методическими рекомендациями по использованию антибактериальных препаратов в профилактике и лечении чумы, обусловленной антигенизмененными формами возбудителя (Fra~, FnTTox" фенотип)», одобренными Ученым Советом и утвержденными директором РостНИПЧИ (протокол № 7 от 26.12.2002г.), разработанными с нашим участием.
Согласно результатам экспериментов, доказана возможность сокращения курса экстренной профилактики всеми изученными препаратами до 5 сут. на фоне иммунизации, если вакцинирующий штамм имеет однородную популяцию и степень резистентности: к рифампицину - при значениях МПК=400-800 мг/л; к фторхинолонам (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин) - при значениях МПК=3,2-6,4 мг/л; к аминогликозидам: стрептомицину (МПК=400-800 мг/л), канамицину (МПК=400-800 мг/л), амикацину (МПК=200-400 мг/л), геитамицину (МПК=200-400 мг/л); к доксициклину - при значениях МПК=200-400 мг/л.
Экспериментально обоснована перспективность проведения сочетанной специфической и экстренной профилактики в группах риска и у контактных даже при условии потенциального заражения, но до появления клинических признаков инфекции. На основе полученных данных разработаны «Методические рекомендации по оценке некоторых критериев перспективности иммуногенных антибиотикорезистентных штаммов (лиофилизированных препаратов) чумного микроба для целей сочетанной специфической и экс- тренной профилактики; ориентировочные схемы ее проведения» одобренные Ученым Советом и утвержденные директором РостНИПЧИ (протокол № 11 от 10.11.2004г.), которые могут быть использованы при разработке и внедрении в практику полиантибиотикорезистентных вакцин.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научных конференциях Ростовского НЙПЧИ в 2002, 2003, 2004гг., на Ученом Совете Ростовского НИПЧИ в 2004г.; представлены на третьей Международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера: «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - Санкт-Петербург, 2003г.; на IV Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс». -Сочи ОК «Дагомыс», 2003 г; на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век». - Саратов, 2004г.
Диссертационная работа выполнена в рамках двух государственных тем: № ГР 0120,0 410670 «Экспериментальное обоснование целесообразности сочетанной специфической и экстренной профилактики чумы на модели инфекции у белых мышей», где автор является ответственным исполнителем и № ГР 01.970 009326 «Изучение эффективности антибактериальных препаратов широкого спектра действия при экспериментальной чуме, вызванной ан-тигенизмененными штаммами чумного микроба (Fra~ Fra~Tox~; FraTTox" PsQ», в которой автор являлась соисполнителем.
Публ икации. Основные материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя источников литературы. Общий объем диссертации 172 страницы. Работа иллюстрирована 47 таблицами. Библиографический указатель содержит 358 источников: 212 отечественных, 146 иностранных.
Основные положения, выносимые на защиту:
Рекомендуемые в настоящее время средства экстренной профилактики чумы (аминогликозиды, фторхинолоны, рифампицин, цефалоспорины III поколения, тетрациклины) подавляют формирование поствакцинального и пост-инфекционного иммунитета у белых мышей в случае вакцинации или инфицирования их чувствительными к антибиотикам штаммами возбудителя чумы.
Иммунизация мышей культурой штамма EV НИИЭГ через 5 ч после заражения приводит к увеличению значений LDS0 штаммов чумного микроба 231 и 231 Fra~ на два порядка и удлинению средней продолжительности жизни павших на 2-5 сут., что свидетельствует о перспективности проведения сочетанной специфической и экстренной профилактики в группах потенциально инфицированных (в инкубационном периоде).
Антибиотикоустойчивые иммуногенные штаммы чумного микроба (EV Rifг Nalr, EV Rifr R
На фоне иммунизации антибиотикорезистентными штаммами чумного микроба или антигеном F I эффективность 5-дневного курса профилактики антибактериальными препаратами при инфекции, вызванной Fra+ и Fra" штаммами чумного микроба, или повышается (до 80-100%) или не меняется (100%); у животных формируется напряженный противочумный иммунитет.
Иммунизация антибиотикорезистентным штаммом чумного микроба в сочетании с профилактическим курсом доксициклина и стрептомицина в ранние сроки после заражения обеспечивает достаточную эффективность этих препаратов даже при инфекции, вызванной устойчивым к ним возбудителем, обеспечивая резерв времени для определения антибиотикограммы инфицирующего штамма и замены неэффективного антибиотика на высокоэффективный.
Чума: заболеваемость, вирулентность возбудителя, клинические формы инфекции
Чума - особо опасная высококонтагиозная инфекция, относящаяся к группе зоонозов и способная к быстрому антропогенному распространению, известна человечеству не менее 25 столетий (с V в. до н.э.). Достоверно доказаны три пандемии чумы (I, XIV, XDC-XX вв.), которые уносили миллионы человеческих жизней, опустошались города, гибли государства, исчезали целые народы (Кокушкин А.М., 1995; Ефременко В.И. с соавт., 2000 и др.). Так, в последнюю третью пандемию чумы только в Индии с 1898г. по 1957г. погибло более 12 млн. человек (Николаев Н.И., 1968). Смертность от инфекции во время эпидемии в Маньчжурии с 1933г. по 1947г. составляла в разные годы от 63 до 100%. (Мартиневский И.Л., Молляре Г.Г., 1971).
В начале XX в. было установлено, что источником инфекции являются больные животные. К настоящему времени известно, что представители более чем 250 видов млекопитающих (грызуны, зайцеобразные, копытные, хищные и др.) могут болеть чумой. В 1939-1946гг. Е.Н. Павловский сформулировал учение о природной очаговости зоонозных болезней человека (Павловский Е.Н., 1964). Природные очаги чумы (нозоареалы - по Черкасскому Б.Л., 2001) обнаружены на территориях 46 стран мира на всех континентах (кроме Австралии) (Фенюк Б.К., 1966; Козлов М.П., 1979). На территории бывшего СССР было обнаружено 43 природных очага чумы, занимающих 216 млн. га, что составляло 8,6% общей территории СССР (Айкимбаев A.M., 1992; Покровский В.И. с соавт., 2003). В России известно 11 активных природных очагов чумы, из которых 6 расположены на Северном Кавказе (Грижебовский Г.М. с соавт., 1997).
Сформированная к 1924г. в СССР противочумная организация начала проводить систематические обследования природных очагов чумы, т. е. перешла к мерам, предупреждающим заболевания людей чумой. Результатом явилось пятикратное снижение заболеваемости чумой в 30-е гг. (Наркевич М.И, с соавт., 1991 а). В целом уровень заболеваемости людей за период 1980-1989гг. в сравнении с периодом 1920-1929гт. снизился в 220 раз, а по сравнению с периодом 1940-1949гг. - в 39 раз при сохранении высокой эпизоотической активности природных очагов чумы (Наркевич М.И. с соавт., 1991 б). Высокую оценку организации и деятельности противочумной системы дал В. Velimirovic (1990), назвав ее уникальной и высокоэффективной.
Н.И. Николаев (1968) отмечает, что с 1950г. по 1965 г. заболеваемость чумой во всем мире резко снизилась, тем не менее, подчеркивает он, за периодом упадка обычно следует период активизации чумы, что многократно наблюдали в истории этого заболевания. К концу XX в. этот прогноз полностью подтвердился. Активизировались очаги чумы, проявилась тенденция к росту числа заболеваний среди людей, возрос риск распространения инфекции (Мишанькин Б.Н. с соавт., 1995; Покровский В.И. с соавт., 1995; Они-щенко Г.Г., 1998; Онищенко Г.Г. с соавт., 1998; Иннокентьева Т.И., 2001; Брюханова Т.Д., 2002, 2004; Информационное сообщение, 2003; WER, 1999 а, б, 2000, 2003). N.G. Gratz (1999), анализируя процесс появления новых и возрождения «старых» заболеваний, вынес в название работы фразу: «чума возвращается».
Характеризуя современное состояние заболеваемости чумой в мире, необходимо отметить, что ВОЗ ежегодно информирует мировую общественность о вспышках и спорадических случаях чумы. В период с 1990г. по 1999г. заболеваемость чумой в мире увеличилась более чем в два раза (WER, 2000). Постоянно регистрируется высокая заболеваемость среди людей на о. Мадагаскар (Michel Р., 1997; Buchrieser С. et al., 1998 б; Chanteau S. et al., 2000), в Танзании, в Китае, в Монголии, в Индии и во Вьетнаме (Покровский В.И. с соавт., 1995; Dongzheng Yu. et al., 1998; Kas yan A.F., 1998; Altantsetseg L., Batbold J., 2000), в Перу (WER, 2000, 2003). В 1999г. заболевания чумой людей были зарегистрированы в Казахстане и Узбекистане (Атшабар Б.Б. с соавт., 2000; Покровский В.И. с соавт., 2003), в 2001г. - в Казахстане (Аскаров А.М., 2001). Особую настороженность вызывают вспышки легочной чумы в Танзании и Китае в 1991г. (Ткачев А.В., Мурначев ГЛ., 1994; Lyamuya E.F. et al., 1992), в Индии в 1994г. (Онищенко Г.Г. с соавт., 1996; Butler Т., 1994; Jayaraman K.S., 1994, 1995; WER, 1994 а), в Замбии в 1995г. (Мс Clean K.L., 1995), в Эквадоре в 1998г. (Gabastou J.M. et al., 2000), на Мадагаскаре в 2000г. (Ratsitorahina М. et al., 2000 а), которые не регистрировались в течение нескольких десятилетий. В 2002г. в Индии зарегистрировано 16 случаев легочной чумы, из которых 4-е летальным исходом (WER, 2002). Вспышки носили локальный характер и обычно не распространялись за пределы природных очагов стран, неблагополучных по чуме (Козлов М.П., 1979). В связи с усилением в настоящее время различных видов международных связей, внешней и внутренней миграции населения, военными конфликтами существует не только потенциальная, но и реальная опасность завоза этой особо опасной инфекции в любую страну мира (Мишанькин Б.Н. с соавт., 1995; Инокентьева ТЛИ., 2001; Федоров Ю.М. с со-авт., 2001; Брюханова Г.Д., 2002, 2004; Покровский В.И. с соавт., 2003; Про-метной В.И, с соавт., 2003). Этому способствуют современные виды транспорта, способные доставить инфицированного в любой регион мира в срок, соответствующий среднестатистическому инкубационному периоду - 6 дней. Так в 2002г. зарегистрированы 2 случая завоза чумы в Нью-Йорк из штата Нью-Мексико (Perlman D.C. et al., 2003), в котором имеется активный природный очаг инфекции. За период с 1985г. по 1999г. в этом штате зарегистрировано 70 подтвержденных случаев заболевания чумой (Boulanger L.L. et al., 2004).
Определение чувствительности / устойчивости штаммов чумного микроба к антибактериальным препаратам
Определение антибиотикочувствительности штаммов Y. pestis проводили методом серийных разведений антибактериальных препаратов в плотной питательной среде (агар Хоттингера, рН 7,1 +0,1, агар Мюллера-Хинтона, рН 7,4). Для определения чувствительности / устойчивости чумного микроба использовали суспензии суточных агаровых культур в дозе п-107 м.к. по стандартному образцу мутности ГИСК им. Тарасевича. Минимальную подавляющую концентрацию (МІЖ) препарата определяли содержанием его в плотной питательной среде (мг/л), на которой не регистрировали роста культур чумного микроба при инкубации посевов в течение 3 сут. при 28С.
Устойчивые к рифампицину (Rifг) и налидиксовой кислоте (Nal1) мутанты чумного микроба получали методом однократного воздействия антибактериального препарата на плотной питательной среде (агар Хоттингера, рН 7Д±0,1), содержащей 100 мг/л рифампицина или налидиксовой кислоты. Использовали суспензии двухсуточных агаровых культур (28С) в дозе 2-4-109 м.к. по стандарту мутности. Посевы инкубировали при 28С на протяжении 3-5 сут. Выросшие колонии отсевали для определения степени резистентности. Частоту мутаций определяли отношением числа мутантов к числу живых особей в посевной дозе культуры.
Вирулентность штаммов чумного микроба изучали при подкожном инфицировании беспородных белых мышей массой 18-20 г суспензиями суточных агаровых культур (28С) в изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,1 мл с использованием 4-6 инфицирующих доз, взятых с десятикратным интервалом, и не менее 4 животных на одну дозу. Расчет значений
LD5o и доверительных интервалов проводили по методу Кербера в модификации ИЛ. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962) исходя из формулы: lg LD50=lg DN-ст ( - 0,5) , где DN - максимальная испытуемая доза; ст - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей, т. е. логарифм кратности; Li - отношение числа павших животных к общему числу зараженных одной дозой вирулентного штамма; 2Li - сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.
Величины верхней и нижней границ доверительного интервала, в котором с вероятностью 95% находится действительное значение LDJO, вычисляли по формулам: (lg LD50) min = lg LD50 - a G \ (lg LD50) max = lg LD50 + a G+, где (lg LD50) min - значение нижней границы доверительного интервала; (lg LD50) max - значение верхней границы доверительного интервала; т - логарифм кратности; G" и G+ - коэффициенты, находимые в таблице в соответствии с усло виями опыта.
Иммунитетпреодолевающие свойства бесфракционного штамма чумного микроба изучали в опытах на беспородных белых мышах. Экспериментальных животных иммунизировали 106 м.к. второй генерации вакцины чумной живой сухой EV НИИЭГ и через 21 сут. заражали исходным штаммом чумного микроба 231 (контроль сформировавшегося иммунитета) и бесфракционной культурой возбудителя (231 Fra") с использованием 4 инфицирующих доз для последующего расчета значения LD50. Для оценки степени преодоления иммунитета введено понятие ИП - индекс преодоления: LD50 штамма 231 на иммунном поголовье животных ИП = . LD5o штамма 231 Fra на иммунном поголовье животных
В экспериментах на мышах препараты использовали в дозах, эквивалентных суточным человекодозам. Расчет проводили по формуле, предложенной I.E. Paget, Y.ML Barnes (1964) с учетом коэффициентов для мышей и человека. Вычисления по этой формуле осуществлялись с учетом массы тела (мг/кг) и площади поверхности тела (мг/м2).
Влияние профилактического (через 5 ч после иммунизации) применения антибактериальных препаратов на формирование поствакцинального иммунитета у мышей, обусловленного антибиотикочувствительным штаммом EV НИИЭГ -основы вакцины чумной живой сухой
В настоящее время число рекомендованных средств экстренной профилактики чумы значительно расширилось за счет новых аминогликозидов, цефалоспоринов III поколения и фторированных производных хинолонов (МУ 3.4. 1030-01, 2001). Однако сведений по сравнительной оценке антибио-тикочувствительности штамма EV НИИЭГ и влиянии антибактериальных препаратов на формирование поствакцинального иммунитета в доступной нам литературе нет, хотя такие исследования с некоторыми антибиотиками (стрептомицин, мономицин, рифампицин, тетрациклин, доксициклин, налидик-совая кислота) проводились и ранее (Тинкер И.С., Гулида М.М., 1961; Самойлова Л.В., 1964; Хохлов Д.Т., 1964; Узенцов С.А., 1967; Рогозин И.И., Беляков В.Д., 1968; Рыжко И.В., Гамлешко Х.П., 1968; Ткаченко Л.Н., 1973 и др.).
В таблице 4 приведены значения МПК 19 антибиотиков (на агаре Хот-тингера, рН 7,1±0,1 и агаре Мюллера-Хинтона, рН 7,4) в отношении культуры штамма чумного микроба EV НИИЭГ. В соответствии с критериями чувствительности / устойчивости, разработанными Европейским обществом микробиологов и инфекционистов (Statement 1996 CA-SFM) для неприхотливых бактерий с использованием агара Мюллера-Хинтона, штамм EV НИИЭГ чувствителен ко всем, взятым в опыты антибактериальным препаратам, независимо от использованной среды. Значения МПК препаратов на среде Мюллера-Хинтона и агаре Хотгингера существенно не отличались. Наименьшие значения МПК регистрировали для фторхинолонов, цефалоспоринов, наибольшие - для стрептомицина, канамицина, амикацина, тетрациклинов, нали-диксовой кислоты, рифамгащина, что является закономерностью в отношении большинства микроорганизмов и связано с особенностями антибактериального действия различных препаратов.
В исследованиях, проведенных ранее, авторы использовали одну иммунизирующую и одну заражающую дозы при изучении влияния антибактериальных препаратов на выживаемость животных (белых мышей, морских свинок) после контрольного заражения (через 21 день после вакцинации) и сравнивали процент выживших.
Представлялось более информативным показать различия в значениях ED30 культуры штамма EV НИИЭГ в зависимости от применяемого для профилактики антибактериального препарата, т. к. величина этого показателя строго регламентирована (ФС 42-3877-99,2000) и в опытах на белых мышах не должна превышать 104 КОЕ. Опыты были поставлены в соответствии с требованиями вышеуказанного документа.
Для иммунизации мышей использовали 4 дозы (2,0-102-1,0-103-5,0-103-2,5-104 м.к.) второй генерации вакцины чумной живой сухой производства Ставропольского НИПЧИ. Через 5 ч после иммунизации начинали профилактическое лечение антибиотиками в дозах, эквивалентных человекодозам, курсом 5 дней, учитывая, что срок изоляции контактных составляет 6 сут. Через 21 день после вакцинации производили заражение 200 DCL вирулентного штамма 231.
Результаты экспериментов (табл. 5) свидетельствуют о высокой имму-ногенности использованной для вакцинации культуры штамма EV НИИЭГ -значение ED5o=l,5 103 КОЕ; даже максимальное значение доверительного интервала (3,3-103 КОЕ) не превышает регламентированной величины -104КОЕ (ФС 42-3877-99, 2000).
В наименьшей степени на показатели ED50 влиял доксициклин (1,25-104 КОЕ) препарат с бактериостатическим характером действия, но и при его использовании значение ED30 оказывалось на максимальном пределе допустимых величин. Все остальные препараты - рифампицин, фторхинолоны (ци-профлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин), аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, тобрамицин, сизомицин, гентамицин, амикацин), цефалоспорины III поколения (цефотаксим, цефтриаксон) в течение курса профилактики полностью подавляли процесс формирования иммунитета: даже использование максимальной иммунизирующей дозы 2,5-Ю4 м.к. (1,25-104 КОЕ) не обеспечивало выживания животных.
Иммуногенные антибиотикорезистентные варианты штамма чумного микроба EV НИИЭГ \EV Rif Nalr, EV Rif Щтъ)\
Длительное хранение культур в лиофилизированном состоянии могло привести как к снижению степени резистентности, так и к утрате иммуногенности.
Прежде всего, были изучены спектр и степень устойчивости двух культур Y. pestis EV Rifг NaT № 2 и № 7 (табл. 8). Установлено, что длительное хранение ( 10 лет) в лиофилизированном состоянии не повлияло на спектр и степень антибиотикорезистентности культур. Варианты Y. pestis EV Rifг NaT были высокоустойчивы к рифампицину, налидиксовой кислоте, имели перекрестную резистентность к фторхинолонам (ципрофлоксацин, офлокеацин, пефлоксацин).
В сравнении со значениями МПК препаратов в отношении антибиотико-чувствительной культуры EV НИИЭГ величины МІЖ для культур EV Rifг Nalr были выше в 32-800 раз.
При изучении однородности популяции штамма EV Rifг NaT по признаку устойчивости к вышеназванным препаратам установлено, что все субкультуры (50) давали рост на пластинах агара с концентрациями рифампицина, на-лидиксовой кислоты, превышающими пограничные значения для устойчивых культур (Statement 1996 CA-SFM...). Используемые в этих опытах концентрации фторхинолонов (0,8-1,6-3,2 мг/л) были ниже пороговых значений для устойчивых к ним штаммов неприхотливых бактерий (Statement 1996 CA-SFM...). Это обстоятельство определялось тем, что перекрестная резистентность штамма EV Riff NaT к фторхинолонам была невысокой (МПК=3,2-6,4 мг/л). Однако нами было установлено, что при значении МПК ципрофлокса-цина, равном 0,8 мг/л, вирулентные Nalr мутанты чумного микроба вызывали летальную инфекцию у белых мышей на фоне интенсивной терапии этим препаратом (1.050=5,0 м.к.). В связи с этим однородность популяции по признаку устойчивости к ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину (табл. 9), показанную на агаре с концентрациями 0,8-1,6-3,2 мг/л, мы посчитали достаточной для использования штамма EV Rifr Nalr в дальнейших опытах in vivo с профилактическим применением фторхинолонов.
Однородность популяции по признаку экспрессии маркеров антибиотикорези-стентности у иммуногенных вариантов Y. pestis EV Rifr Nalf (№2 и № 7)
После однократной анимализации культур на морских свинках (5 млрд. м.к., подкожно) на 4-5 сут. были выделены культуры из регионарных лимфатических узлов и селезенки (после растирания органа песком и высева суспензии). Значения ED» для двух вариантов EV Rifr Nalr в сравнении с ED50 второй генерации вакцины чумной живой сухой представлены в таблице 10.
Установлено, что иммуногенность мутантов для белых мышей и морских свинок не уступала таковой штамма EV НИИЭГ - основы вакцины чумной живой сухой. Значения ED5o для мышей составляли 1140-3311 КОЕ, » для морских свинок 565-600 КОЕ. Для дальнейших экспериментов была отобрана субкультура № 2 с меньшими значениями ED50 для обоих видов экспериментальных животных.
Следующим этапом была проведена сравнительная характеристика значений ED5o отобранной культуры на фоне применения антибактериальных препаратов в опытах на беспородных белых мышах (табл. 11). В этом опыте наименьшее значение ED5o было получено при 5-дневной профилактике пеф-локсацином (2236 КОЕ) и наибольшее - при использовании ципрофлоксацина и офлоксацина (5520 и 5590 КОЕ). В контроле (без лечения) и на фоне применения рифампицина показатели ED5o не отличались (3311 и 3435 КОЕ). В связи с тем, что ни в одном случае значения ED5o Y. pestis EV Rif fNalr не превышали допустимой величины - \04 КОЕ (ФС 42-3877-99, 2000), мы посчитали возможным использование этой культуры в дальнейших экспериментах.
Характеристика спектра и степени антибиотикорезистентности двух вариантов (№ 9 и № 10) Y. pestis EV Rifг R (SmTc) представлена в таблице 12. Значения МПК рифампицина и стрептомицина составляли для обеих культур 1600 мг/л, тетрациклина и доксициклина - 200 мг/л, степень нарастания значений МПК в сравнении с таковыми для исходного штамма EV составляла 100-800 раз. Полученные результаты вновь свидетельствуют о том, что в процессе длительного хранения культур в лиофилизированном состоянии стабильно сохраняется как хромосомная, так и плазмидная резистентность к антибактериальным препаратам.
