Содержание к диссертации
Глава!. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Генотипирование штаммов NniKpoopraHHSMOB - составная часть эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями
1.2. Методы, используемые при генотипировании микроорганизмов
1.2.1. VNTR- анализ ДНК возбудителей бактериальных инфекций
1.3. Возможная роль тандемных повторов ДНК в биологии клетки СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.2. Реактивы и питательные среды и лабораторные животные
2.3. Выделение ДНК, постановка ПЦР и учет результатов
2.4. Компьютерное обеспечение и поиск таиделтых повторов
2.5. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Поиск и изучение вариабельных тандемных повторов в геноме возбудителя туляремии
3.1. Встречаемость локусов тапдемных повторов в геноме Francisella tularensis
3.2. Изучение стабильности наследования VNTR-локусов на примере дефектных по ЛПС вариантов туляремийного микроба
3.3. Проблема двойных аллелей VNTR-локусов у Francisella tularensis
Глава 4. VNTR- анализ штаммов Francisella tularensis
4.1. Генотипирование штаммов, выделенных в Ростовской области
4.2. Анализ штаммов, изолированных на территории Южного Федерального округа
4.3. Ретроспективный анализ штаммов, выделенных во время зимней эпизоотии туляремии в СССР и других странах в 1988 - годах
4.4. Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие коллекционных штаммов Francisella tularensis по данным VNTR- анализаих ДНК
4.5. Географическая информационная система «Туляремия»
Глава 5. Внутривидовая идентификация и количественное определение возбудителя туляремии
5.1. Конструирование праймеров для внутривидовой дифференциации представителей Francisella tularensis
5.2. Количественное определение возбудителя туляремии с помощью ПЦР в реальном времени
Введение к работе
Актуальность проблемы. Francisella tularensis — возбудитель туляремии, острого зоонозного природно-очагового инфекщюнного заболевания, поражаюш;его многие виды млекопитаюш,их, включая человека, грызунов и лагоморфов. Пути и механизмы передачи микроба многообразны: люди могут заражаться при прямом контакте с больными животными, при вдыхании инфицированного материала, употреблении зараженной воды или пиши, при укусе комарами, москитами и клещами. Природный резервуар чаще остается неизвестным, хотя показана возможность персистенции возбудителя более года в воде и иле (Parker R.R., Steinhaiis Е.А., Kohls G.M. et al., 1951), в организме восприимчивых животных (Олсуфьев Н.Г., 1975), пребывания в окружающей среде в виде некультивируемых форм (Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Пичурина FI.JI. и др., 2000).
Важность проблемы туляремии определяется исключительной стойкостью, цикличностью и нарастающей активностью природных очагов этой инфекции практически на всей территории северного полушария, включая Российскую Федерацию. Активные автономные природные очаги туляремии тундрового типа описаны даже на территории острова Врангеля на границе Восточно-Сибирского и Чукотского морей Северного Ледовитого океана (Подобедова Я.С, Делшдова Т.Н., Кормилицина М.И., Мещерякова И.С, 2006). В целом по стране с 1999 по 2006 год зарегистрировано 1427 случаев туляремии (Безсмертный В.Е., Горшенко В.В., Попов В.П., 2008).
Прослеживается четкая тенденция к расширению ареала обитания возбудителя: микроб обнаружен у больного в Австралии, считавшейся свободной от туляремии (Whipp M.J., Davies J.M., Lum G. et al., 2003). В Словакии от мышевидных грызунов выделены два штамма F. tularensis subsp. nearctica (Gurycova D., 1998), что является первым случаем регистрации высоковирулентного подвида в Европе. И если до 2004 года неэндемичными по туляремии в Европе оставались лишь Великобритания, Португалия и Исландия (Tamvik А., Priebe Н., Grunow R., 2004), то de T.L.Carvalho et al. (2007) уже сообщили о положительных в ПЦР пробах на ДНК F. tidarensis от человека и клещей северной провинции Португалии.
После 60-летнего затишья зарегистрированы вспышки туляремии в европейской части Турции (Gurcan S., Eskiocak М., Varol G., 2006; Willke A., Meric M., Grunow R. et al., 2009), показано существование активных природных очагов в соседней Болгарии, в которых возбудитель обнаруживали вместе с боррелиями и Anaplasnia phagocy tophi him (Christova J., Gladnishka Т., 2005; Marinov K.T., Georgieva E.D., Tvanov I.N., Kantardjiev T.V., 2009), в ряде провинций Китая (Zhang F., Liu W., Chu M.C. et al., 2006).
Помимо контроля состояния природных очагов, определенное значение приобретает возможность использования возбудителя туляремии в террористических целях как агента II группы патогенности с высоким индивидуальным и низким общественным риском (Воробьев А.А., 2001). И если терроризм - это преднамеренное, политически мотивированное насилие, осуществляемое против граждан в невоенное время с целью воздействия на общественное мнение (Кондрик Е.К., Волков В.В., Кавызина Л.И., 2003), то биотерроризм превратился в одну из реальных угроз национальной безопасности любой страны. Ведь многие из современных биотехнологических разработок с использованием опасных патогенов бактериальной и вирусной природы являются сложными технологиямР! двойного применения. В случае сознательного использования биологических (генетических) агентов для поражения людей, животных и растений они «классифицируются как биологическое оружие» (Спирин А.С., 1997). Поэтому не удивительно, что и Центры по контролю за заболеваемостью (CDC) США отнесли F. tidarensis к категории А потенциальных агентов биотерроризма (Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al., 2002), a сам возбудитель в рамках программы Bio Watch подвергли постоянному люниторингу на случай возможной биотеррористической атаки (Bams S.M., Grow С, Okinaka R.T. et al., 2005).
Известен высокий консерватизм фенотипа (антигенная однородность, однотипность биологических свойств, невысокая биохимическая активность и др.) штаммов F. tularerisis при исследовании традиционными методами (Олсуфьев Н.Г., 1975), поэтому оперативное расследование вспышек заболевания для выявления источника инфекции и путей передачи возбудителя в настоящее время затруднительно без комплекса молекулярно-биологических методов, способных быстро и четко дифференцировать различные подвиды и штаммы возбудителя, что исключительно важно на фоне требований практики жизни и реальной угрозы биотерроризма. Только благодаря использованию приема VNTR (Variable Number Tandem Repeat, Вариабельные Тандемные Повторы) - типирования удалось в короткие сроки установить происхождение штамма Bacillus anthracis, распыленного членами религиозной секты Аум Синреке в Японии в 1993 году (Keim Р., Smith K.L., Keys et a l , 2001), и справиться с почтовым терроризмом в США, когда погибло пять и заболело кожной формой сибирской язвы несколько человек (Hoffmaster A.R., Fitzgerald С, Ribot Е.Е. et al., 2002). В этой связи представлялось актуальным использование активно разрабатываемого в последние годы в интересах молекулярной эпидемиологии VNTR-анализа для дифференциации штаммов F.
tularensis, неразличимых рутинными методами диагностики и типирования, тем более что однородность возбудителя не укладывается в фундаментальное положение эпидемиологии, согласно которому основной характеристикой популяции является гетерогенность (неоднородность) составляющих ее особей, обусловленная разнообразием генотипов в пределах генофонда и определяющая в совокупности с другими факторами устойчивость паразитарной системы в целом.
Цель исследования. Изучение генотипического разнообразия среди штаммов представительной коллекции возбудителя туляремии, выделенных в 1941 -2004 годах в различных регионах мира, с помощью мультилокусного VNTR - анализа.
Поставленную цель предполагалось реализовать выполнением следующих задач:
• разработка программного обеспечения и проведения компьютерного анализа генома туляремийного микроба для выявления локусов, содержащих тандемные повторы;
• конструирование и синтез специфических праймеров, фланкирущих участки генома с тандемными повторами, отработка методики генотипирования;
• формирование коллекции штаммов всех подвидов F. tularensis из различных регионов бывшего СССР, а также из-за рубежа;
• VNTR-анализ подобранной коллекции штаммов и создание базы данных по выявленным VNTR- генотипам штаммов F. tularensis;
• анализ собранного материала с целью установления возможной связи между VNTR- генотипом штамма и его происхождением, местом, временем и источником выделения;
• изучение стабильности аллелей выявленных локусов вариабельных тандемных повторов;
• подработка подходов к дифференциации подвидов рода Francisella и количественному определению возбудителя туляремии с помощью ПЦР. Научная новизна работы. Впервые с помощью методики генотипирования возбудителя туляремии, основанной на определении кратности вариабельных тандемных повторов, проведен VNTR - анализ по четырем локусам обширной коллекции из 352 штаммов F. tularensis, включавшей представителей всех четырех подвидов возбудителя туляремии. Показана генотипическая гетерогенность (разнообразие) штаммов возбудителя туляремии. Изучена стабильность наследования аллелей VNTR-локусов у дефектных по ЛПС вариантов туляремийного микроба. Разработан алгоритм кластерного анализа распределения аллелей VNTR- локусов. Дано возможное объяснение феномену возникновения штаммов с двойными аллелями. Впервые выявлены особенности географического распределения генотипов штаммов на территории Ростовской области, Южного Федерального округа, республик бывшего СССР, Америки и ряда стран Восточной Европы. Показано, что согласно генотипированию вызываемые туляремийным микробом вспышки можно разделить на поликлональные, моноклональные и кластерные. Изучена связь между активизацией природных очагов туляремии и солнечной активностью.
Предложена упрощенная методика определения подвидов туляремийного микроба с использованием ПЦР. Разработан вариант количественного определения возбудителя туляремии в пробе помощью ПЦР в режиме реального времени.
Практическая ценность. Разработаны методические рекомендации «Способ приготовления смеси маркерных фрагментов (ладдеров) Д1Ж для тестирования аллелей вариабельных тандемных повторов у возбудителей чумы и туляремии». Рекомендации рассмотрены Ученым Советом и утверждены директором РПЧИ (протокол № 9 от 21.09.2004).
Депонирован штамм в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб» Francisella tularensis 503/840 в качестве тест - штамма для определения числа повторов по локусу FtA у возбудителя туляремии.
Получена справка о депонировании охраноспособного штамма Francisella tularensis siibsp. holarctica 503/840 в ГКПБ «Микроб» от 9 марта 2004 года.
Создана и зарегистрирована в ФГУ ФИПС База данных «Геоинформационная система «Туляремия». Получено свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2006620302 от 21 сентября 2006 года.
Создана и зарегистрирована в ФГУ ФИПС База данных «Коллекция штаммов туляремийного микроба». Получено свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2008620076 от 30 января 2008 года.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В геноме Francisella tidarensis содержится большое количество тандемных повторов, часть из которых являются вариабельными и пригодными для генотипирования штаммов возбудителя туляремии.
2. Анализ вариабельных тандемных повторов (VNTR-анализ) в геноме 352 штаммов возбудителя туляремии всех четырех подвидов Francisella tu- larensis выявил существование среди них генотипической гетерогенности, а также территориальной приуроченности изолятов определенных генотипов.
3. Ретроспективный анализ распределения генотипов позволил заключить, что в межэпидемический период в природных очагах одновременно циркулируют штаммы одного либо нескольких близкородственных генотипов.
4. Выделенные в разных географических регионах во время разлитой эпизоотии зимой 1988-89 гг. штаммы Francisella tularensis являются резидентными и характерны для мест их постоянного пребывания в пределах устойчивых очагов.
5. Идентификация (дрхфференциация) подвидов Francisella tidarensis возможна с помощью полимеразной цепной реакции.
Апробация работы Результаты исследований неоднократно обсуждались:
• на научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2003 -2006 гг.;
• на IV Всероссийской научно — практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва, 22-24 октября 2002 г.;
• на 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 30 сентября - 2 октября 2003 г.;
• на VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств», Оболенск, 3-5 октября 2006 г.;
• на VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007», Москва, 28-30 ноября 2007 г.;
• 4 International Conference on Tularemia. The Assembly Rooms, City of Bath, United Kingdom, 2003.
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 5 в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных материалов диссертации на соискание искомой ученой степени, 2 свидетельства о государственной регистрации баз данных и подготовлен один методический документ.
План диссертационной работы был рассмотрен и утвержден Ученым Советом РостНИПЧИ 28.03.2007 года (протокол № 2). Исследование выполнено в рамках плановой научной темы «Генотипическое разнообразие Francisella tularemis» (№ 67-2-05), № гос. регистрации - 0120.0 507855, в которой автор являлся ответственным исполнителем.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, состоит из введения и пяти глав, включающих обзор литературы, результаты собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками. Указатель литературы включает 219 источников, из них 69 отечественных и 150 иностранных авторов.
Похожие диссертации на Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ
