Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Характеристика Serratia marcescens 11
1.2 Бактериальный пигмент продигиозин 18
1.2.1 Биосинтез продигиозина 20
1.2.2 Питательные среды и условия культивирования 9 оптимальные для биосинтеза продигиозина
1.2.3 Локализация пигмента в клетках S. marcescens 30
1.2.4 Методы экстракции и идентификации продигиозина 30
1.2.5 Биологическое значение продигиозина в жизни продуцента и практическое использование ~9
1.2.6 Цитотоксичность продигиозина 36
1.3 Продигиозинподобные пигменты 40
1.4 Биологические маркеры для нефтепродуктов 42
1.5 Стратегия исследований генотоксичности соединений 46
Заключение 48
Экспериментальная часть 51
2 Материалы и методы 51
2.1 Объекты исследования 51
2.2 Использованные материалы 52
2.3 Условия культивирования, определение продуктивности 55
2.4 Определение концентрации продигиозина 55
2.5 Получение продигиозина и его экстракционная очистка 56
2.6 Очистка пигментного препарата 56
2.6.1 Жидкостная хроматография 5 6
2.6.2 Тонкослойная хроматография (ТСХ) 57
2.7 Физико-химические методы анализа очищенного продигиозина 57
2.8 Оценка антагонистической активности Serratia marcescens 58
2.9 Оценка фунгицидной активности препаратов продигиозина 58
2.10 Методы оценки токсичности 58
2.10.1 Оценка влияния препаратов продигиозина на рост корней растении
2.10.2 Оценка влияния препаратов продигиозина на накопление биомассы растений
2.10.3 Определение острой летальной токсичности на тест-объекте Paramecium caudatum
2.11 Методы оценки генотоксичности 62
2.11.1 Тест на токсичность по отношению к Salmonella typhimurium 62
2.11.2 Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест „ Эймса)
2.11.3 Микроядерный тест на эритроцитах , периферической крови мышей in vivo
2.12 Маркирование и идентификация маркированных , нефтепродуктов
2.13 Статистическая обработка результатов 66
3 Результаты исследований 67
3.1 Подбор высокопродуктивных штаммов 67
3.1.1 Сравнительная характеристика роста и пигментообразования исследуемых штаммов S. marcescens
3.2 Подбор оптимальной питательной среды 70
3.2.1 Образование продигиозина при 7П культивировании бактерий на различных средах
3.2.2 Рост и образование продигиозина 79 Serratia marcescens на модифицированной среде Кинга А
3.2.3 Рост и образование продигиозина Serratia marcescens на модифицированной пептон-глицериновой среде
3.3 Определение оптимального количества посевного материала 76
3.4 Подбор метода экстракции пигмента из клеток 77
3.5 Выделение и очистка пигментного препарата продигиозина, его характеристика
3.5.1 Жидкостная хроматография 79
3.5.2 Тонкослойная хроматография 82
3.6 Продигиозин, как фактор антагонистической активности S.marcescens
3.6.1 Антагонистическая активность S. marcescens 85
3.6.2 Характеристика роста фитопатогенных микромицетов на питательных средах с добавлением пигментных препаратов
3.7 Токсическое воздействие препаратов продигиозина на прорастание семян и накопление биомассы растений
3.8 Определение острой летальной токсичности на тест-объекте Paramecium caudatum
3.9 Токсические эффекты продигиозина по отношению к микроорганизмам
3.10 Индукция генных мутаций пигментными препаратами Эймса
3.11 Микроядерный тест на эритроцитах периферической крови мышей in vivo
3.12 Возможное практическое применение продигиозина
3.12.1 Маркирование нефтепродуктов продигиозином и способ идентификации маркированных нефтепродуктов
4 Обсуждение результатов
Выводы
Благодарности
Литература
Приложение
- Характеристика Serratia marcescens
- Условия культивирования, определение продуктивности
- Сравнительная характеристика роста и пигментообразования исследуемых штаммов S. marcescens
- Токсическое воздействие препаратов продигиозина на прорастание семян и накопление биомассы растений
Введение к работе
Актуальность проблемы. Большинство работ, в области изучения бактериальных пигментов посвящено фототрофам, в то время, как пигменты нефотосинтезирующих микроорганизмов изучены в значительно меньшей степени. Ярко-красный пигмент продигиозин, синтезируемый энтеробактериями Serratia marcescens, представляет собой линейный трипиррол (пиррол, 3-метоксипиррол, 2-метил-З-амилпиррол). Как и многие вторичные метаболиты бактерий, продигиозин приобретает практическое значение в промышленности и медицине. В промышленности продигиозин рекомендуется в качестве красителя для полимеров, поскольку он обладает рядом преимуществ по сравнению с применяемыми в настоящее время органическими и неорганическими пигментами. Разработан способ использования продигиозина для маркирования нефтепродуктов [Гарейшина с соавт., 2003]. Пигмент хорошо растворим в различных марках топлива и легко обнаруживается по характерному спектру поглощения. Продигиозин и продигиозинподобные пигменты, синтезируемые некоторыми видами микроорганизмов, рассматриваются как новое семейство противоопухолевых лекарственных препаратов [Montaner et al., 2000; Llagostera et al, 2005]. Показано, что продигиозин действует, как иммунодепрессант, селективно блокируя пролиферацию Т-клеток киллеров [Han et ah, 1998; Azuma et al., 2000], избирательно индуцирует апоптоз различных типов злокачественных клеток [Montaner, Perez-Tomas, 2001; Campas et al., 2003], ингибирует образование метастаз, обладает антиинвазивными свойствами [Perez-Tomas et al., 2003].
В связи с большой практической значимостью продигиозина
возникает необходимость в наработке больших количеств пигмента и
снижении его стоимости. Высокая стоимость пигмента тормозит, в
частности, использование его в качестве маркера нефтепродуктов. Кроме
того, неизученным остается вопрос о мутагенности, генетической токсичности продигиозина. Для изучения этих свойств необходимы высокоочищенные препараты продигиозина. В представленной работе предполагается разработать эффективную схему получения продигиозина и изучить некоторые биологические эффекты пигмента.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в следующем: разработать эффективную схему получения бактериального пигмента продигиозина; определить его токсические и генотоксические свойства и установить возможности практического применения. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
подобрать высокопродуктивные по биосинтезу пигмента продигиозина штаммы Serratia marcescens, оптимизировать питательную среду и условия культивирования для получения продигиозина в лабораторных и полупромышленных масштабах;
получить и охарактеризовать высокоочищенный пигментный препарат с привлечением физико-химических методов;
установить токсичные и безопасные концентрации продигиозина для растений, простейших и микроорганизмов;
определить мутагенные свойства препаратов продигиозина с использованием основных методов генетической токсикологии;
определить возможность применения пигмента в качестве фунгицидного агента для защиты растений от фитопатогенных микромицетов;
оценить возможность и перспективность использования продигиозина в качестве биологического маркера нефтепродуктов и разработать более точный метод идентификации маркера. Научная новизна. Проведена сравнительная оценка токсичности
пигментных препаратов по отношению к прокариотическим и эукариотическим организмам. Получены приоритетные данные о
генотоксических эффектах продигиозина. Показано отсутствие генотоксического воздействия очищенного продигиозина в тесте Эймса и микроядерном тесте in vivo. Определены антагонистические свойства продигиозина в отношении фитопатогенных микромицетов. Оценка возможности применения пигмента в качестве фунгицидного агента для защиты растений проведена с учетом определения эффективной и безопасной концентрации продигиозина.
Практическая значимость. Разработана дешевая, простая в приготовлении питательная среда для культивирования Serratia marcescens — штамма-продуцента продигиозина, способствующая высокому выходу пигмента. Разработан метод получения высокоочищенного пигментного препарата. С учетом использования продигиозина в различных отраслях биотехнологии (красителя полимеров, маркера нефтепродуктов) результаты, полученные в данной работе, позволяют определить возможную экологическую опасность при попадании пигмента и связанных с ним продуктов производства в окружающую среду. Выявленная фунгицидная активность продигиозина, как одно из проявлений токсического эффекта, может служить аргументом в пользу разработки методов применения данного препарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов. Упрощенный метод идентификации продигиозина и хорошая растворимость в различных марках топлива позволяют рекомендовать пигмент в качестве маркера нефтепродуктов.
Связь работы с научными программами и собственный вклад
автора в исследования. Исследования автора по тематике
диссертационной работы поддержаны федеральными программами
«Развитие научного потенциала высшей школы» РНП.2.1.1.1005,
РНП.2.1.1.3222. Грант АН РТ, № 03-3.5-33/ 2006 (Г) 2006 г.
Индивидуальный грант КГУ (2008). Научные положения диссертации и
выводы базируются на результатах собственных исследований автора.
Масс-спектроскопические исследования проведены в лаборатории ИОФХ им. Арбузова. Микроядерный тест проведен в лаборатории ИОФХ им. Арбузова.
Положения, выносимые на защиту:
Разработана эффективная схема получения продигиозина; с применением хроматографических методов получен и охарактеризован препарат продигиозина высокой степени очистки.
В тестах in vitro и in vivo впервые установлены особенности генотоксического влияния продигиозина, определена возможность возникновения мутаций в клетках Salmonella typhimurium ТА 100 и индукции хромосомных повреждений эритробластов у млекопитающих.
Установлены антагонистическая активность штамма Serratia marcescens АТСС 9986 и фунгицидная активность продигиозина. Определены эффективные нетоксичные концентрации пигмента при использовании продигиозина для защиты растений. '
Разработан и рекомендуется к применению новый способ идентификации нефтепродуктов, маркированных пигментом.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены
на: 2-й международной конференции «Наука-бизнес-образование
биотехнология-биомедицина-окружающая среда» (Пущино, 2005), 10-й
Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI
века» (Пущино, 2006), XLV международной научной студенческой
конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск,
2007), Региональной научно-практической конференции «Синтез и
перспективы использования новых биологически активных соединений»
(Казань, 2007), Научной конференции молодых ученых, аспирантов и
студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии
XXI века» (Казань, 2007), I международной практическая конференция
«Микробная биотехнология - новые подходы и решения» (Казань, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 142 страницах, содержит 8 таблиц и 44 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 163 источников, из них 133 на иностранном языке и приложения.
Характеристика Serratia marcescens
S. marcescens представляет собой типовой вид рода Serratia входящего в семейство Enterobacteriaceae. Бактерии представляют собой грамотрицательные, подвижные палочки 0.5-0.8x0.9-2.0 мкм с перитрихиальным жгутикованием. Для S. marcescens характерно роение на твердых поверхностях, отличающееся от обычной подвижности в жидких питательных средах. ДНК S. marcescens содержит 57.5 - 60.0% Г-Ц пар -это самое высокое значение среди энтеробактерий. Лишь для одного штамма S. marcescens определен размер генома — 3.57 109 Да [Энтеробактерий, 1985].
Клеточная оболочка S. marcescens, так же как у всех грамотрицательных бактерий, состоит из нескольких слоев. Внутренний слой - цитоплазматическая мембрана - покрыта снаружи тонким слоем пептидогликана, который составляет менее 10% сухого веса клеточной стенки. Пептидогликан не содержит лизина, межпептидные мостики отсутствуют. Наряду с этим опорным каркасом имеются большие количества липопротеинов, липополисахаридов и других липидов, которые как бы наклеены снаружи на муреиновый каркас. Тейхоевые кислоты у грам-отрицательных бактерий до сих пор не были обнаружены. Самый верхний слой представляет собой наружнюю мембрану. Наружная мембрана грам-отрицательных бактерий выполняет не только механические, но и важные физиологические функции. В ее двойной липидный слой, состоящий из липида А, полисахаридов и фосфолипидов, встроены белки, пронизывающие этот слой. Эти трансмембранные белки представляют собой заполненные водой каналы - гидрофильные поры в липидной мембране. В наружной мембране содержится большое количество молекул порина - трансмембранного белка массой 37 кДа.
Тримеры порина формируют каналы, по которым небольшие полярные молекулы быстро диффундируют, проходя сквозь мембрану.
Факультативные анаэробы, хемоорганогетеротрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Хорошо растут при 30-37С. Катаболизируют D-глюкозу и многие другие углеводы с образованием кислоты, но без образования газа. Не сбраживают лактозу, пептонизируют молоко, обладают денитрифицирующей активностью. Способны расти на среде Симонса с цитратом. Все штаммы вида 5". marcescens каталазоположительны, дают отрицательный тест с метиловым красным; реакция Фогес-Проскауэра обычно положительная. Большинство также положительны по лизиндекарбоксилазе, орнитиндекарбоксилазе, отрицательны по орнитиндегидролазе; H2S не образуют, не гидролизуют мочевину, малонат, как правило, не используют. Углеводы, сбраживаемые всеми или большинством штаммов включают: мальтозу, D-маннитол, D-маннозу, салицин, сахарозу и трегалозу.
Встречаются в почве, в воде, на поверхности растений и других природных источниках, а также в пищеварительном тракте грызунов и насекомых; в последние годы с возрастающей частотой в различных клинических материалах от больных и здоровых людей [Определитель бактерий Берджи, 1997]. S. marcescens вызывает оппортунистические инфекции у госпитализированных больных — септицемии и инфекции мочевых путей. Способность S. marcescens колонизировать широкий ряд экологических ниш связан с образованием спектра внеклеточных продуктов включая хитиназы, протеазы, липазы, нуклеазы, бактериоцины, сурфактанты и смачивающие агенты.
Многие штаммы вида образуют розовый, красный или фуксиновый пигмент, однако пигментообразование является вариабельным признаком. S. marcescens относится к факультативно анаэробным бактериям, способным получать энергию в результате аэробного дыхания и путем анаэробного окисления органических субстратов. Штаммы дикого типа способны расти на минимальной среде с глюкозой и минеральными солями, следовательно, у них имеется полный набор ферментов, для образования всех соединений необходимых для роста. Можно предполагать что пути, используемые S. marcescens для синтеза аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, различных липидов и углеводов, те же, что описаны для Е. coli и других энтеробактерий. Известно, что разложение глюкозы пигментными штаммами S. marcescens происходит за счет гликолиза и окислительного пентозофосфатного пути. Конечное аэробное окисление глюкозы совершается в цикле трикарбоновых кислот, а так же в глиоксилатном цикле.
У беспигментного штамма S. marcescens была обнаружена активность ферментов гликолиза: глюкокиназы, фосфоглюкоизомеразы, фосфофруктокиназы, фруктозодифосфатальдолазы, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а так же первого фермента пентозофосфатного пути - глюкозо- 6- фосфат-дегидрогеназы [Grimont, Grimonl, 1978]. Показана связь глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы с пигментацией S. marcescens. Авторы высказали предположение, что фермент может быть использован как генетический маркер для эволюционных и таксономических исследований. Проведено исследование активности ферментов цикла трикарбоновых кислот - аконитазьт, изоцитратдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, фумаразы, малатдегидрогеназы. Показано, что S. marcescens способна расти на среде, содержащей ацетат в качестве единственного источника углерода. При этом была обнаружена активность изоцитритазы и малатсинтетазы, что дало возможность утверждать, что в клетках S. marcescens также действует глиоксилатный цикл дикарбоновых кислот [Grimont, Grimont, 1978].
Условия культивирования, определение продуктивности
Количество пигмента рассчитывали с использованием удельного коэффициента поглощения, который при X = 535 нм составляет величину 51.5Х103 см2/мг [Williams et ah, 1971], на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer instruments, США). Для этого полученный спиртовый экстракт пигмента разводили подкисленным этанолом (9 мл этанола + 1мл 1NHC1).
Для получения пигмента продигиозина штамм-продуцент S. marcescens АТСС 9986 культивировали на пептоно-глицериновом агаре. Посевным материалом служила двухсуточная культура, выращенная на скошенной агаризованной среде. Инокулят, в виде клеточной суспензии в физиологическом растворе, с плотностью 10 - 10 клеток, засевали по 0.40 - 0.45 мл на чашку. Культивирование проводили при температуре 27-28С в течение 72 часов. Биомассу собирали, клетки дважды отмывали физиологическим раствором и осаждали центрифугированием при 12000g.
Экстракцию продигиозина из биомассы бактерий проводили кислым этанолом (100мл 96% этилового спирта + 1мл НС1КОНц.), до полного обесцвечивания биомассы. Полученный препарат высушивали на воздухе и повторно элюировали. Процедуру повторяли несколько раз до освобождения от нерастворимых примесей. Полученный однородный раствор был обозначен, как неочищенный пигментный препарат (НЛП) и использован для маркирования нефтепродуктов (в качестве маркера).
Этанольный экстракт выпаривали в вакуумном шкафу при температуре 45-50С и перерастворяли пигмент в хлороформе. Полученный раствор смешивали с равной по объему водно-этанольной смесью (объемное соотношение этанол-вода - 1:4) и эмульгировали на магнитной мешалке в течение 1ч. От водорастворимых примесей и водно-этанольной смеси освобождались на делительной воронке. Процедуру повторяли, увеличив объемное соотношение этанола вдвое. Затем пигментный препарат повторно высушивали и перерастворяли в этаноле.
Жидкостную хроматографию проводили на стеклянной колонке общим объемом 628 см с использованием силикагеля марки КСК. Однородную суспензию сорбента готовили из расчета 5 г силикагеля на 20-30 мл смеси гексан - ацетон 90:10 (об/об). После наполнения колонки уровень растворителя опускали до верхней границы столбика силикагеля и дважды промывали смесью гексан — ацетон 90:30 (об/об). Раствор пигмента в этаноле (15 мкг/мл) объемом 5 мл осторожно по внутреннему краю колонки наносили на поверхность сорбента. Колонку промывали следующими растворителями: 350 мл смеси гексана с ацетоном в соотношении 90:30 (об/об), 200 мл ацетона. Скорость движения подвижной фазы (растворителя) в колонке 0.03 мл/сек. Все полученные фракции были по отдельности собраны и проанализированы.
Тонкослойную хроматографию проводили на стеклянных пластинках для препаративного разделения, с силикагелем марки 60 F254 (Merck, Германия). Пигментный препарат наносили на пластинку ровной полосой, объемом 1.4 мл в концентрации 10 мкг/мл. Затем пластинку помещали в камеру, куда предварительно наливали смесь для разделения: гексан — этиловый эфир - уксусная кислота в соотношении 70:30:1 (об/об/об). Для количественной и качественной характеристики измеряли величины Rf полученных полос, затем их по отдельности снимали с пластин вместе с сорбентом и последовательно элюировали следующими растворителями: 96% этанол, ацетон, хлороформ.
Хроматографические полосы анализировали с использованием реактивов для определения фосфолипидов: 0.5% раствор родамина В в этаноле, реактив Драгендорфа, нингидрин, пары йода.
Каждый этап очистки завершали анализом оптических спектров поглощения полученных фракций в ультрафиолетовой и видимой областях спектра.
Сравнительная характеристика роста и пигментообразования исследуемых штаммов S. marcescens
Упрощенный метод учета структурных нарушений хромосом был предложен Хеддле (Heddle) как маркер генотоксического действия различных соединений. Суть теста заключается в выявлении и количественной оценке потенциальной цитогенетической активности исследуемого соединения в полихроматофильных эритроцитах периферической крови мышей. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Спонтанная частота возникновения таких клеток составляет 0.2-0.3%.
Инъекции НПП и очищенного пигмента делали из расчета 0.05 мл вещества в исследуемой концентрации на 1 г. веса животного. Опытные концентрации (25, 8, 4 мкг/кг) вводили подкожно. В качестве негативного контроля использовали 10% спиртовой раствор. На протяжении всего эксперимента животные находились под ежедневным наблюдением на общевиварной диете в стандартных условиях, соответствующих санитарным правилам по содержанию, устройству и оборудованию вивария. Образцы крови из хвостовой вены животного отбирались через 48, 72 ч после введения исследуемых концентраций. Препараты готовили следующим образом: 1-2 капли крови наносили на обезжиренное предметное стекло и распределяли ее по всей поверхности. Мазки на предметном стекле высушивали на воздухе, фиксировали метанолом (3-5 мин), а затем выдерживали в красителе Романовского-Гимза 30-40 минут.
Препараты промывали водой, высушивали и микроскопировали. В каждом препарате анализировали 1000-2000 нормохромных эритроцитов. Для здоровых животных, не подвергавшихся воздействию цитогенотоксических препаратов, как правило, характерно наличие 1-4 клеток содержащих микроядра на 1000 норхромных эритроцитов. Достоверное превышение этого показателя считали проявлением цитогенетической активности исследуемых веществ.
В работе использовали бензины марок А 76, АИ 92, АИ 95, АИ98 и дизельное топливо производства «Татнефть», авиационный бензин и авиационный керосин. 0.13 г маркера-продигиозина растворяли в 100 мл 96% этанола, смешивали с бензином до конечной концентрации продигиозина, равной 4.85x10"6 г/л (0.250 опт. единицы/мл).
С целью идентификации маркированных нефтепродуктов отбирали 5 мл маркированного бензина (керосина) и снимали оптический спектр поглощения в области длин волн Л = 350...600 нм. Контролем служил оптический спектр поглощения топлива без добавления маркера. По степени интенсивности спектральных линий, сравнивая их с интенсивностью известного эталона, определяли наличие и концентрацию маркера в исследуемом нефтепродукте.
Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе "Microsoft Excel". Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение а в группе не превышало 13%. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности р 0.05.
С целью подбора высокопродуктивных по биосинтезу продигиозина штаммов был изучен рост и пигментообразование 22-х штаммов S. marcescens, хранящихся в коллекции лаборатории ББФ КГУ кафедры микробиологии. Исследуемые штаммы со среды LB, были отсеяны в пробирки со средой Кинга А и дважды пассированы. Все используемые штаммы хорошо росли на среде Кинга А, из них 12 штаммов образовывали пигмент Из 12-ти образующих пигмент штаммов, ярко-красный пигмент образовывали два штамма, красный пигмент образовывали четыре штамма, которые были отобраны для дальнейшей работы. Остальные были окрашены в розовый цвет. На рисунке (рис. 6) представлены образующие ярко-красный, розовый пигмент и не образующие пигмент штаммы.
Показатели роста и количества синтезируемого продигиозина на вторые сутки роста шести отобранных пигментообразующих штаммов представлены на рисунке (рис.7). Наибольшие количества продигиозина образовывали два штамма S. marcescens АТСС 9986 и S. marcescens ВКМ В-851. Остальные штаммы, образующие пигмент продигиозин, синтезировали мало пигмента. Полученные данные свидетельствуют о том, что различные штаммы S. marcescens отличаются между собой по уровню биосинтеза продигиозина.
Соотношение интенсивности роста и количества синтезированного клетками продигиозина показало отсутствие прямой зависимости между ростом культуры и биосинтезом пигмента. Результаты проведенной работы позволяют рекомендовать штаммы S. marcescens АТСС 9986 и & marcescens ВКМ В-851 в качестве перспективных продуцентов продигиозина.
Токсическое воздействие препаратов продигиозина на прорастание семян и накопление биомассы растений
Эффективность биотехнологического производства, связанного с использованием микроорганизмов в первую очередь определяется правильным подбором штаммов-продуцентов продуктов производства, а также оптимальностью условий биосинтеза. Кроме того, важным критерием является сравнительная дешевизна сырья для приготовления питательной среды. Решающее значение для жизнедеятельности продуцентов имеют набор и соотношение компонентов среды культивирования (качество сырья, отношение C:N, содержание примесей). Для получения пигмента S. marcescens в литературе предложены разнообразные среды [King et al., 1954; Williams et ah, 1961, 1971; Kats, Sobleski,1979; Трутко, Акименко,1989; Cang et ah, 2000; Giri A. et ah, 2004]. На сегодняшний день относительно дешевой и экономически выгодной является пептон-глицериновая среда, содержащая всего 5г пептона и 20г глицерина на 1 л. Благодаря простому составу и доступности она нашла широкое применение в биотехнологии. Вей с соавторами [Wei et ah, 2005] для выращивания Serratia модифицировали среду LB добавлением аминокислот, строение молекул которых подобно пиррольному кольцу продигиозина. Изучали влияние гистидина, пролина, дрожжевого экстракта, содержащего смесь аминокислот, и их различные концентрации и установили оптимальные дозы аминокислот: наибольший выход пигмента наблюдали при содержании в среде 10 г/л пролина. Предполагается, что повышение пигментации связано с включением аминокислот в синтез предшественников. Однако при добавлении аминокислот значительно повышается стоимость среды, что сказывается на рентабельности производства.
Разработанная ранее, овсяная среда (пептон-Юг, овсяная мука — 4, галактоза - 1-4г, NaCl-5r на литр среды) также стимулирует рост и обеспечивает стабильное пигментообразование, однако содержит значительное количество пептона [Юсупова с соавт., 1983]. Среды Кинга А и Б предназначены для выделения и первичной идентификации псевдомонад (Pseadomonas mirabilis, P. aeruginosa вырабатывающих сине-зеленый или зеленый пигменты в качестве селективных и дифференциальных сред [King et al., 1954]. Впервые применение среды Кинга для получения продигиозина S. marcescens встречается в работах Трутко и Акименко [Трутко, Акименко, 1989].
Таким образом, большинство рекомендуемых сред содержит дорогостоящий пептон, который необходимо заменить каким-либо более дешевым аналогом, способным обеспечить соизмеримый биосинтез продигиозина. Неоднократно упоминалось, что продигиозин - вторичный метаболит. Образование его в растущих культурах S. marcescens начинается обычно через 10-12 часов от начала культивирования, то есть после прохождения экспоненциальной фазы роста. В конце стационарной фазы количество пигмента продолжает возрастать. Степень питательности среды определяет скорость перехода растущей культуры в стационарную фазу роста и соответственно интенсивность пигментообразавания.
Разработанная питательная среда (модифицированная среда Кинга А, в которой пептон (20 г/л) заменен гидролизатом коллагена в концентрации 5 г/л), обеспечивает хороший рост и высокий выход пигмента при использовании рекомендуемых штаммов-продуцентов (S. marcescens АТСС 9986 и S. marcescens ВКМ В-851). Использование штамма S. marcescens АТСС 9986 и модифицированной питательной среды (5 г/л гидролизата коллагена), удешевляет получение конечного продукта -продигиозина в 5 раз (по сравнению с оригинальной средой Кинга А). В процессе модификации среды Кинга А уровень пигментообразования штамма S. marcescens ВКМ В-851 увеличивался по мере уменьшения концентрации гидролизата коллагена в среде до 5 г/л. Мы предполагаем, что отношение источника азота (пептон) к источнику углерода (глицерин) 2:1 в среде Кинга А, не оптимально для роста и синтеза продигиозина S. marcescens. По мере уменьшения концентрации гидролизата коллагена в среде достигается соотношение источника азота и углерода, равное 1:2, что более благоприятно для бактерий.
