Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1. Регуляция синтеза внеклеточных ферментов бактерий 10
2. Внеклеточные гидролазы Serratia marcescens — свойства, регуляция биосинтеза и механизмы секреции 14
2.1. Эндонуклеаза : 14
2.2. Хитинолитические ферменты 20
2.3. Протеазы 28
2.4. Липазы 34
Заключение по обзору литературы 37
Экспериментальная часть : 39
1. Материалы и методы исследований 39
2. Результаты исследований 50
2.1. Характеристика штаммов S.marcescens с повышенной активностью эндонуклеазы и хитиназы 50
2.2. Биосинтез внеклеточной эндонуклеазы S.marcescens 53
2.1.1. Индукция синтеза эндонуклеазы S.marcescens под влиянием агентов, вызывающих повреждения ДНК 53
2.1.2. Влияние митомицина С и налидиксовой кислоты на динамику и уровень синтеза эндонуклеазы 57
2.3. Влияние соединений, индуцирующих SOS-ответ на динамику и уровень синтеза внеклеточных гидролаз S.marcescens 62
2.4. Хитинолитический комплекс S.marcescens и особенности его биосинтеза 73
2.4.1 . Влияние хитина и индуктора SOS-функций клетки на биосинтез ферментов хитинолитического комплекса S.marcescens 73
2.4.2. Рост и биосинтез эндохитиназы исходным и мутантным штаммами в процессе развития на различных средах в присутствии и без митомицина С 77
2.4.3. Общая хитиназная активность в процессе роста исходного и мутантного штаммов 85
2.4.4. Состав внеклеточных белков с хитиназной активностью исходного и мутантного штаммов 85
2.4.5 Получение частично очищенных хитиназ путем аффинной сорбции на хитине 90
2.4.6. Разделение хитиназ частично очищенного препарата путем изоэлектрического фокусирования 90
2.4.7. Фунгистатическая активность хитиназ S.marcescens 94
Обсуждение результатов 97
Выводы 104
Литература 106
- Внеклеточные гидролазы Serratia marcescens — свойства, регуляция биосинтеза и механизмы секреции
- Хитинолитические ферменты
- Биосинтез внеклеточной эндонуклеазы S.marcescens
- Влияние хитина и индуктора SOS-функций клетки на биосинтез ферментов хитинолитического комплекса S.marcescens
Внеклеточные гидролазы Serratia marcescens — свойства, регуляция биосинтеза и механизмы секреции
Внеклеточные белки у бактерий и других микроорганизмов включают различные ферменты, вызывающие деградацию биополимеров (поли- и олигосахаридов, нуклеиновых кислот, белков, липидов и др.), до малых молекул, используемых клеткой в качестве источников С, N, Р. К этому классу относятся также детоксифицирующие ферменты, в первую очередь, инактивирующие (5-лактамные антибиотики. Бактерии секретируют в среду также различные токсины, обладающие литическими свойствами и способностью расщеплять клеточную оболочку эукариотических и прокариотических организмов, а также отдельных органелл.
Благодаря ряду свойств: продукции в высокой концентрации, легкости очистки и тестирования, стабильности и низкому молекулярному весу (в среднем 20-40 кДа) внеклеточные ферменты являются не только идеальной моделью для решения фундаментальных проблем белковой химии и энзимологии, а также для изучения генов, кодирующих эти белки, но имеют большое практическое значение. Внеклеточные ферменты бактерий имеют и большое экологическое значение, отвечая за рециклинг огромного количества мирового нерастворимого материала и могут стать экономически выгодными в будущем, в решении, в частности, энергетической проблемы, за счет использования для деградации растительных отходов. Так как ферменты являются природными продуктами бактериальных клеток, успех их индивидуального производства зависит от усиления потенциальных возможностей их продуцентов за счет селекционной технологии или конструирования штаммов, а также путей использования механизмов генетического контроля и контроля факторами внешней среды (Несмеянова, 1990). Регуляция образования ферментов происходит на уровне транскрипции, посттранскршщионном уровне, трансляции и посттрансляционном уровне (Прист, 1988). У прокариот ведущую роль играет регуляция синтеза ферментов на уровне транскрипции, поскольку у бактерий мРНК отличается коротким временем жизни, и трансляция начинается еще до завершения ее синтеза (Lewin, 1994).
В основе механизмов регуляции транскрипции лежит принцип оперонной организации ДНК, в которой кроме структурных генов, кодирующих аминокислотную последовательность белков, имеются регуляторные, некодирующие участки. Один или несколько структурных генов вместе с прилегающими к нему регуляторными участками образуют элементарную единицу транскрипции — оперон. Эффективность считывания оперона определяется взаимодействием белков-регуляторов и фермента транскрипции — РНК-полимеразы с регуляторным участком. Оперон, в котором оператор допускает свободное продвижение РНК-полимеразы, но эффективно блокируется при связывании молекулы специфического репрессора, находится под отрицательным контролем. Положительный контроль обуславливается оператором, который препятствует транскрибированию структурных генов РНК-полимеразой, но способен связывать специфический активатор, облегчающий продвижение этого фермента. Эти два типа регуляции управляют у бактерий синтезом как индуцибельных, так и репрессибельных ферментов.
Выделяют особый механизм регуляции синтеза белка — катаболитную репрессию, где присутствие легко усвояемого источника углерода (в основном глюкозы) подавляет синтез ферментов, ответственных за утилизацию других источников углерода. Позитивным регулятором транскрипции катаболитных генов является цАМФ, который взаимодействует с белком активатором (Simpson, 1980). Добавление в среду 3 ,5 -цАМФ снимает репрессию, вызываемую глюкозой. Специфическое подавление ионами аммония синтеза большинства ферментов, участвующих в обмене азота, известно как азотметаболитная репрессия (Magasanik, 1982).
Наиболее интересной является позитивная регуляция с участием двухкомпонентных систем сигнальной трансдукции (Msadek et al., 1993). Эти системы включают два семейства гомологичных белков. При этом белок из одного семейства контролирует активность другого, принадлежавшему ко второму семейству. Первый компонент — модулятор получает внеклеточный сигнал, вероятно, через свой N-концевой участок (Kofoid et al, 1988). Затем сигнал трансдуцируется через С-концевой домен модулятора на второй компонент системы — регулятор ответа или эффектор, который и является регулятором транскрипции. Особенностью механизма сигнальной трансдукции является обязательное фосфорилирование регулятора ответа в консервативном остатке аспарагиновой кислоты (Sanders et al., 1989). Двухкомпонентные регуляторные системы можно сравнить с сетью нейронов: они функционируют как логические операторы и обладают феноменом автоамплификации. Из-за большого количества параллельных путей переноса фосфорильной группы и из-за их возможного перекрестного взаимодействия в одной прокариотической клетке совокупность всех двухкомпонентных регуляторных систем проявляет характеристики фосфонейронной сети. Можно представить амплификацию сигнала, ассоциативный ответ и какую-то память (Hellingwerf et al., 1995).
Оказалось, что катаболитная репрессия, азотная регуляция и другие адаптивные ответы регулируются посредством сети сигнальной трансдукции. Таким образом, принцип механизма регуляции во всех случаях одинаков, все адаптивные ответы клетки на воздействия окружающей среды контролируются согласованно.
Хитинолитические ферменты
Секреция эндонуклеазы S.marcescens в среду осуществляется в два этапа. На первом этапе эндонуклеаза, синтезируемая в клетке как белок-предшественник с N-концевой сигнальной последовательностью из 21-го аминокислотных остатка, быстро перемещается через цитоплазматическую мембрану в периплазму, используя основной секреторный путь, в процессе которого происходит отщепление сигнального пептида с помощью сигнальной пептидазы. Одновременно с этим процессом идет образование двух дисульфидных мостиков, необходимых для активности фермента (Ball et al., 1992). Зрелая эндонуклеаза — 26.8 кДа-белок (Ball et al., 1987) накапливается в периплазме. Второй этап секреции фермента — выход в ростовую среду довольно длителен и занимает от одного до двух часов, хотя показано, что секреция белков через основной секреторный путь длится 1-15 минут. Такое длительное пребывание эндонуклеазы в периплазме перед секрецией может быть вызвано определенными процессами, происходящими в этом компартменте, таким как, например димеризация, взаимодействие с белками — шаперонами) (Suh et al., 1996). При этом замечено, что высокий уровень аэрации вызывает выделение нуклеазы в среду, а при низком уровне — фермент накапливается в периплазме. Предполагается, что скручивание молекулы фермента происходит в периплазме после транслокации через цитоплазматическую мембрану и отщепления сигнального пептида, и под влиянием условий культивирования, в частности, аэрации, формируется соответствующая секретируемая структура (Biedermann et al., 1989). Накопление эндонуклеазы в периплазме до ее освобождения в среду роста делает эндонуклеазу S.marcescens отличной от других внеклеточных белков, секретируемых через основной секреторный путь, которые не могут накапливаться в периплазме (Suh et al., 1996). Эндонуклеаза S.marcescens, будучи экспрессированной в E.coli, обнаруживается преимущественно в периплазме, в то время, как в сходных условиях клетками S.marcescens секретируется в окружающую среду. Подобную специфичность секреторного аппарата S.marcescens можно объяснить: уникальностью промотора для внеклеточной секреции — когда транскрипция гена nucA инициируется с lac промотора, фермент обнаруживается преимущественно в периплазме, если фермент экспрессируется с nucA промотора эндонуклеаза накапливается внеклеточно; присутствием непростого сигнала в белке, который вызывает его внеклеточную секрецию (Benedik, Strych, 1998). Так изоформа Sml эндонуклеазы S.marcescens синтезируется в клетке наряду с изоформой Sm2 преимущественно в экспоненциальной фазе роста, но не секретируется в окружающую среду. Появление Sml совпадает с освобождением клеточных белков в стационарной фазе роста при неспецифическом лизисе клеток (Suh et al., 1995).
Несмотря на многолетнее изучение эндонуклеазы S.marcescens, интерес к этому ферменту не ослабевает. Эндонуклеаза остается интересным объектом для многих исследований по секреции ферментов в среду грамотрицательными бактериями, механизма действия и эволюции эндонуклеаз.
Наряду с нуклеазой большой практический и научный интерес особенно в последние годы вызывают хитиназы S. marcescens. Хитин - распространенное органическое вещество, по количеству на Земле занимающее второе место после целлюлозы. Структура хитина имеет большое сходство с целлюлозой, одна из гидроксильных групп которой в хитине замещена аминоацильной группой.
Хитиназы (КФ 3.2.1.14), расщепляющие 1,4-р-гликозидные связи в молекулах полимера беспорядочно, и таким образом, являющиеся ферментами эндо-типа, осуществляют гидролиз хитина главным образом, до олигосахаридов (Тиунова, 1988). Экзохитиназы, названные CHi-ферментами (Тиунова, 1988), а позднее хитобиозидазами (Tronsmo, Harman, 1993) пока не имеют идентификационного номера. Эти ферменты последовательно отщепляют молекулы М,М -диацетилхитобиозы от нередуцирующего конца молекулы хитина. Продуктом реакции является диацетилхитобиоза, в реакционной смеси не появляется значительных количеств моносахарида ІЧ-ацетил-В-глюкозамина или олигосахаридов (Robbins et al., 1988).
До 90-ых годов существование экзохитиназ у микроорганизмов только предполагалось, поэтому многими авторами до настоящего времени используется термин «хитиназы» применительно к ферментам, расщепляющих хитин до олигосахаридов и хитобиозы. Гидролиз хитина до мономера N-ацетил-D-глюкозамина происходит под действием комплекса хитинолитических ферментов: хитиназ и p-N-ацетилглюкозаминидазы (КФ 3.2.1.30) или хитобиазы. Хитобиаза отщепляет мономеры N-АГА с нередуцирующих концов дисахарида хитобиозы и высокомолекулярных хитоолигосахаридов. Кроме того, обнаружены p N-ацетилгексозаминидазы (КФ 3.2.1.52), которые действуют сходным образом, но являются менее специфичными ферментами. Все эти ферменты являются внутриклеточными.
Физиологические функции хитиназ зависят от организма, в котором они обнаружены. У растений эти ферменты являются частью защитной системы против грибных инфекций, а также таких стрессовых воздействий как. тепловой и холодовой шок (Roberts, SelitrennikofF, 1988, Maher et al., 1993; Margispinheiro et al., 1994). Растительные хитиназы легко разрушают изолированные стенки грибов, а также обладают активностью лизоцима У грибов хитиназы играют важную роль в процессах клеточного деления и дифференцировки, а также участвуют в питании энтомопатогенных грибов и таких микопаразитов как Trichoderma (De la Cruz et al., 1992). Хитиназы почвенных и морских микроорганизмов имеют большое значение в природе как ферменты, находящиеся в основе всей последующей цепи превращений хитина в общем процессе круговорота углерода и азота (Тиунова, 1988).
Среди бактерий и микромицетов S.marcescens является одним из наиболее активных продуцентов внеклеточных хитинолитических ферментов (Monreal, Reese, 1969). В культуральной жидкости этого микроорганизма обнаруживается до пяти белков с хитиназной активностью (Watanabe et al., 1997; Gal et al, 1998). В 1982 году путем простой одностадийной процедуры очистки фермента адсорбцией на хитине (Roberts, Cabib, 1982) был получен препарат, который содержал два белка (58 и 52 кДа) с хитиназной активностью. Еще три белка с молекулярными массами между 20 и 50 кДа присутствовали в небольших количествах. Препарат имел следовую протеазную активность и был свободен от других гидролаз, действующих на полисахариды. Фермент отличался стабильностью при хранении в лиофильно-высушенном состоянии и проявлял высокую хитиназную активность в широком диапазоне рН (4.0-7.0). Все это позволило авторам рекомендовать хитиназу для количественного определения хитина, а также для биоконверсии отходов морских промыслов. Дальнейшее усовершенствование этой процедуры очистки позволило провести более детальное исследование хитиназного комплекса S.marcescens. С помощью хроматографии на ультрогеле АсА54 было установлено, что S.marcescens синтезирует пять внеклеточных белков с молекулярными массами 58, 52, 48, 36 и 21 кДа, способных адсорбироваться на хитине (Fuchs et al., 1986). В этой же работе содержится первое сообщение о клонировании гена одной из хитиназ, а именно 58 кДа хитиназы. Ген хитиназы экспрессировался в клетках E.coli и Pseudomonas fmorescens. Хитиназа накапливалась внутри клеток E.coli и была очищена с помощью хитин-аффинной хромотографии до 95%-ной чистоты за одну стадию. Почти одновременно другим авторам (Jones et al., 1986) удалось клонировать в E.coli гены двух хитиназ S.marcescens — chi А, кодирующий 58 кДа хитиназу (сам белок получил название хитиназы А) и ген сЫА, кодирующий 52 кДа хитиназу (хитиназа В). Л
Биосинтез внеклеточной эндонуклеазы S.marcescens
При исследовании влияния МС на динамику роста и синтеза эндонуклеазы S.marcescens использовали одну концентрацию антибиотика 0.05 мкгмл" , вызывающую наибольшее увеличение эндонуклеазной активности (Юсупова с соавт., 1990). Как показали результаты опытов (рис.6), под влиянием МС увеличивается время генерации клеток, соответственно, почти вдвое сокращается удельная скорость роста, одновременно в среде возрастает активность эндонуклеазы (рис.6 а,б) на 24-м часу роста, как и в опытах с Нал, численность клеток восстанавливается до контрольного уровня.
Таким образом, при подавлении деления клеток S.marcescens Нал и МС (в результате нарушения процессов репликации ДНК) индуцируется синтез внеклеточной эндонуклеазы. Индукция синтеза эндонуклеазы предшествует началу деления клеток, преодолевших фазу задержки роста.
Влияние соединений, индуцирующих SOS-ответ, на динамику и уровень синтеза других внеклеточных гидролаз S.marcescens
S.marcescens, как видно из обзора литературы, помимо эндонуклеазы выделяет в среду высокоактивные ферменты, способные гидролизовать белки, липиды, хитин. Представляло интерес выяснить влияние митомицина С и налидиксовой кислоты на динамику и уровень синтеза этих внеклеточных гидролитических ферментов.
В первой серии опытов МС и Нал добавляли в питательную среду 1 одновременно с посевным материалом. Бактерии выращивали в течение 30-и часов. Величину активности фермента в культуральной жидкости и бесклеточном экстракте рассчитывали на единицу биомассы (A/Deso). мкгмл" , остальные обозначения как на рис.4 б - 2-0,05 мкгмл" , остальные обозначения как на рис.5 Исследование динамики и уровня гидролитических ферментов в контрольной культуре показало, что штамм Вй 211 АТСС 9986 синтезирует внеклеточные ферменты: эндонуклеазу, хитиназу, протеазы, липазу, лицитиназу, в культуральной жидкости обнаруживаются следовые количества щелочной фосфатазы, которая у S.marcescens локализуется в периплазме (Tsang et al.,1979).
Активность фосфатазы в культуральной жидкости снижается в процессе экспоненциального роста и сохраняется на одном уровне в течение стационарной фазы (рис.76). Активность сериновой и металлопротеазы в культуральной жидкости увеличивается параллельно увеличению количества клеток, достигает максимума в начале стационарной фазы и сохраняется на достигнутом уровне в течение стационарной фазы (рис.7в,г). Аналогичная картина наблюдается при исследовании липазной активности (рис.8а). Лецитиназная активность снижается в процессе экспоненциального роста и увеличивается в стационарную фазу роста. Максимальная активность фермента достигается в начале стационарной фазы, в дальнейшем продуктивность клеток резко снижается (рис.86). Хитиназа обнаруживается в среде в следовых количествах, что согласуется с литературными данными об индуцибельном синтезе фермента (Monreal, Reese, 1969) в стационарной фазе роста, затем активность медленно повышается до конца опыта (рис.8в).
В присутствии МС хитиназная активность обнаруживается в культуральной жидкости через 6 часов роста и повышается до конца опыта. Активность фермента в опытных колбах в присутствии МС в 20 раз превышает активность фермента в контроле. На среде с Нал (2 мкг-мл"1) фермент обнаруживается через 14 часов роста, высокие концентрации Нал не индуцируют синтез хитиназы. МС и Нал, подавляя деление клеток, одновременно подавляют синтез сериновой и металлопротеазы. В опытных колбах активность протеаз обнаруживается в более поздние сроки значительно ниже контрольных значений. При подавлении деления клеток под влиянием МС и Нал в культуральной жидкости повышается липолитическая, лецитиназная и фосфатазная активности, активность ферментов, как правило, понижается либо приближается к контрольным значениям, что было особенно наглядно в опытах с высокими концентрациями Нал (рис 76; 8а,б). Таким образом, под влиянием МС и Нал в культуральной жидкости S.marcescens увеличивается удельная активность хитиназы, липазы, лецитиназы и щелочной фосфатазы, снижается активность протеаз и изменяется динамика ферментативной активности в процессе роста. Полученные данные свидетельствуют о том, что синтез внеклеточных гидролаз у S.marcescens связан с репликацией ДНК и делением клеток.
Во второй серии опытов бактерии выращивали в течение 6-й часов на жидкой среде 1, затем в опытные колбы добавляли МС, МС и ХФ. Через 24 часа роста определяли количество биомассы, в культуральной жидкости и в клетках измеряли содержание белка и активность гидролитических ферментов.
Результаты опытов показали (Табл.4), что под влиянием МС в культуральной жидкости на 24-й час роста повышается активность хитиназы, липазы, лецитиназы, эндонуклеазы, щелочной фосфатазы и содержание белка. В бесклеточных экстрактах, полученных при разрушении клеток многократным замораживанием-оттаиванием, активности хитиназы, липазы и лецитиназы использованными нами методами не обнаруживается, активность эндонуклеазы является повышенной, фосфатазы — слегка снижается. ХФ, добавленный в среду одновременно с МС, подавляет индуцирующий эффект МС. Под влиянием ХФ активность исследуемых гидролитических ферментов в культуральной жидкости снижается до контрольных значений, что свидетельствует о биосинтезе под влиянием МС ферментного белка de novo.
Влияние хитина и индуктора SOS-функций клетки на биосинтез ферментов хитинолитического комплекса S.marcescens
Проведенные исследования показали, что эндонуклеаза и четыре белка с хитиназной активностью, обнаруженные в культуральной жидкости S.marcescens штамма Вй 211 АТСС 9986 представляют собой ферменты, биосинтез которых осуществляется в период перехода от экспоненциальной к стационарной фазе роста. Переходное состояние между этими фазами можно рассматривать как перекресток, где клетка еще выполняет отдельные функции связанные с ростом, но когда также начинают экспрессироваться гены, продукты которых необходимы для выживания в возрастающих неблагоприятных условиях (Strauch, 1992). В частности, это ферменты, вызывающие деградацию высокополимерных соединений, и обеспечивающие клетку источниками углерода, азота и фосфора.
Биосинтез эндонуклеазы и хитиназ S.marcescens индуцируется при остановке деления клеток в результате блокирования репликации ДНК под влиянием митомицина С. Под влиянием МС индуцируется также биосинтез всех четырех белков с хитиназной активностью, обнаруженных в культуральной жидкости S.marcescens.
Митомицин С - бифункциональный алкилирующий агент, вызывающий образование поперечных сшивок между остатками гуанина в ДНК. МС блокирует репликацию ДНК, препятствуя расхождению комплементарных нитей, и рассматривается как наиболее мощный ингибитор биосинтеза ДНК, эффективный для про- и эукариотических клеток. В концентрации 0.1 мкгмл"1 МС вызывает практически немедленное прекращение синтеза ДНК, в. то время как в контроле ее количество за 90 мин увеличивается в 3 раза. В то же время показатели синтеза белка и РНК при испытанной концентрации антибиотика мало отличаются от контрольной культуры. У E.coli, синтез ДНК полностью подавляется при концентрации 10 мкгмл"1, в то время как синтез РНК и белка тормозится слабо (Сазыкин, 1968).
МС является индуктором SOS-функций клетки. Индукция синтеза эн-донуклеазы и хитиназ под влиянием МС свидетельствуют о регуляции синтеза этих ферментов по типу SOS-ответа. Система SOS-ответа является достаточно изученной системой сигнального реагирования. Повреждения ДНК различной природы и подавление ее синтеза в клетках E.coli индуцируют разнообразные изменения их функций. Это явление объединяется понятием SOS-ответа, которое первоначально было сформулировано как гипотеза SOS-репарации. В настоящее время ясно, что репарация значительная, но не единственная часть SOS-ответа клетки (Жестянников, 1985).
Все соединения, вызывающие повреждения ДНК - УФ, НГ, также как МС и Нал, независимо от механизма действия на ДНК (образование пири-мидиновых димеров ДНК, метилирование оснований ДНК и индукция межнитевых сшивок, блокирование репликации ДНК прокариотических клеток при взаимодействии с ДНК-гиразой), индуцировали синтез эндонуклеазы. Ранее было показано, что индукция синтеза эндонуклеазы происходит также при тиминовом голодании клеток и под влиянием оксимочевины (Юсупова с соавт.,1991). Оксимочевина, ингибитор рибонуклеозидредуктазы, и тиминовое голодание ингибируют репликацию ДНК, ограничивая пул предшественников.
Все перечисленные агенты, так же, как выше упомянутый МС, индуцируют SOS-ответ (Тарасов, 1982). По-видимому, всякий агент с высокой интенсивностью действия, нарушающий репликацию ДНК, индуцирует SOS-систему.
От механизма действия агента зависела интенсивность индукции эндонуклеазы, которую выражали через коэффициент индукции Ки. Коэффициент индукции распределяется следующим образом: 30 (Нал), 40 (НГ), 60 (УФ) и 800 (МС). Наиболее высокий коэффициент индукции получен при обработке клеток МС. При обработке .клеток МС уровень эндонуклеазной активности в клетках увеличивается, однако, секреция фермента в среду осуществляется очень медленно. В отличие от эндонуклеазы, не обнаружено накопления хитиназ в клетках S.marcescens до и после индукции МС.
Увеличение эндонуклеазной активности в среде регистрируется через 60 мин после УФ облучения и через 120 мин после контакта клеток с МС, Нал и НГ. Уровень индукции достигает наибольшего значения на четвёртый час с момента обработки клеток индуктором. Эти данные согласуются с результатами, полученными в последствии американскими исследователями, которые также отмечают, что эндонуклеаза S.marcescens накапливается в периплазме клеток и затем очень медленно освобождается в среду в течение одного-двух часов (Suh et al, 1996).
В настоящее время отсутствуют данные о механизмах секреции эндонуклеазы и хитиназы через наружную мембрану клеток S.marcescens. Известно лишь, что эндонуклеаза и хитиназа А синтезируются как белки-предшественники, несущие сигнальную последовательность,, обеспечивающую им пересечение цитоплазматической мембраны (Ball et al., 1987, 1990; Roberts, Selitrennikoff, 1988; Brurberg et al., 1994). Показано, что хитиназа В синтезируется без сигнальной последовательности (Harpster, Dunsmuir, 1989; Brurberg etal., 1995).
Как видно из обзора литературы, S.marcescens не имеет универсального механизма пересечения наружной мембраны для синтезируемых бактериальными клетками внеклеточных белков. Каждый внеклеточный белок имеет свой собственный, отличный от других, путь для транспорта через наружную мембрану (Shiebel et al., 1989; Akatsuka et al., 1996, 1997; Ohnishi, Horinouchi, 1996). Главная терминальная ветвь общего секреторного пути, подобного найденному у других грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa и Erwinia spp., отсутствует у представителей, рода Serratia (Pugsley, 1993).
Детальное исследование влияния МС и Нал на динамику роста и накопления в среде эндонуклеазы показало, что под влиянием Нал, добавленной в среду одновременно с посевным материалом, снижается число колониеобразующих клеток и резко повышается и сохраняется на высоком уровне активность эндонуклеазы вплоть до начала деления клеток. Преодолев фазу задержки роста, вызванную Нал, сохранившие жизнеспособность клетки начинают делиться с высокой скоростью и достигают уровня клеток контрольной культуры, а в отдельных случаях превышают ее. Время генерации клеток уменьшается до 26-36 мин против 40 мин, ц - 1.3-1.6 против 1.0 едчас" контрольной культуры. Таким образом, при подавлении деления клеток S.marcescens Нал и МС, индуцируется синтез внеклеточной эндонуклеазы. Индукция синтеза эндонуклеазы предшествует началу деления клеток, преодолевших фазу задержки роста. Дальнейшие исследования показали, что в процессе роста бактерий на средах с Нал сохраняются и накапливаются клетки устойчивые к Нал, не отличающиеся в отсутствии Нал по времени генерации от клеток контрольной культуры. Можно предположить, что высокий уровень эндонуклеазы в культуральной жидкости, индуцированный Нал, стимулирует деление клеток, сокращая время их генерации. Куприяновой-Ашиной Ф.Г. с соавт. (1992) было показано в модельных экспериментах, что экзогенные ДНКазы, введённые в питательную среду перед началом синтеза ДНК в клетках, ускоряли деление и стимулировали рост и размножение микробных клеток. Авторы считают, что экзогенные ДНКазы участвуют в инициации репликации ДНК и делении клеток, стимулируя рост и развитие микроорганиз мов.
