Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1. Почвенные микробные сообщества: структурная и функциональная организация 15
2. Методы оценки таксономической структуры бактериальных сообществ почв: подходы и методы 25
3. Микробные сообщества антропогенных почв 54
4. Некоторые механизмы сохранения жизнеспособности бактериями в почве 74
5. Краткая характеристика наноформ бактерий 84
Глава 2. Объекты и методы исследования 1. Объекты исследования 98
2. Методы исследования 106
Результаты и их обсуждение
Глава. 3. Вертикально-ярусная организация бактериальных сообществ в ненарушенных природных лесных экосистемах 128
Глава 4. Бактериальные сообщества почв ботанических садов и огородов древних монастырей 149
Глава 5. Бактериальные сообщества городских загрязненных почв 182
Глава 6. Изменение физиологического состояния бактерий в почве под влиянием некоторых антропогенных воздействий (модельные опыты) 207
Глава 7. Наноформы бактерий в природных и антропогенно измененных почвах 225
Заключение 250
Выводы 257
Благодарности 260
Список литературы 261
- Методы оценки таксономической структуры бактериальных сообществ почв: подходы и методы
- Некоторые механизмы сохранения жизнеспособности бактериями в почве
- Бактериальные сообщества почв ботанических садов и огородов древних монастырей
- Изменение физиологического состояния бактерий в почве под влиянием некоторых антропогенных воздействий (модельные опыты)
Введение к работе
Актуальность темы
Интенсивная и разносторонняя деятельность человека в пределах крупных городов приводит к существенному и часто необратимому изменению окружающей природной среды. Современные города - это особые экосистемы, которые весьма отличаются от природных зональных биогеоценозов по климатическим, физико-химическим свойствам почв и атмосферы, высокому уровню загрязнения внешней среды (Почва, город, экология, 1997). В настоящее время темпы урбанизации неуклонно растут, и к концу XXI века ожидается вовлечение в этот процесс до 20% всей пригодной для жизни человека территории суши (Современные глобальные изменения природной среды, 2006).
Городская почва - сложный объект, располагающийся на стыке природных и городских систем. Именно здесь происходит наложение антропогенных процессов на естественные процессы почвообразования (Экологические функции городских почв, 2004). Это неминуемо должно сказаться на структуре и функционировании микробных сообществ городских почв. До недавнего времени почвы городских территорий в определенной степени игнорировались почвоведами, и только в последнее десятилетие интерес к этому объекту усилился, что привело к увеличению числа публикаций, посвященных этой важной проблеме (Почва, город, экология, 1997; Экологические функции городских почв, 2004; SUITMA-2007; SUITMA-2009).
Почвенные микробиологи изучали, главным образом, лесные почвы и почвы, находящиеся в сельскохозяйственном использовании. Почвы же городских территорий до последнего времени изучались микробиологами преимущественно с точки зрения выявления патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Только с появлением представлений о функциональной роли почв и почвенной биоты в биосфере (Добровольский и др., 2003) и пониманием роли микроорганизмов в биогеоценотических функциях почв (Звягинцев и др., 1999) интерес к микроорганизмам городских почвах усилился (Почва, город, экология, 1997; Артамонова, 2002; Приваленко, Безуглова, 2003; Марфенина, 2005).
Долгое время изучение бактериального населения почв, как природных ненарушенных, так и антропогенно измененных, развивалось, в основном, в направлениях, связанных с определением численности физиологических групп
бактерий и изучением распространения легко различаемых по морфолого-таксономическому принципу групп бактерий. Только на рубеже XXI века на кафедре биологии почв были сформулированы подходы к изучению структурно-функциональной организации микробных (в том числе бактериальных) сообществ почвы, базирующиеся на изучении таксономической структуры модельной группы организмов (для бактерий - это сапротрофный блок прокариот). Были выработаны также синэкологические критерии для характеристики этой группы (Звягинцев, Добровольская, Чернов, 1997; Экология на рубеже XXI века, 1999; Добровольская, 2002).
Следует отметить, что для оценки характера антропогенных воздействий на почвенные бактериальные сообщества требуется огромный статистический материал, необходимы многолетние исследования, которые проводились бы сходными методами, обеспечивая сравнимость результатов. Это возможно лишь при достаточно стабильных представлениях о таксономии бактерий. Однако в последнее десятилетие в ней произошли революционные изменения, связанные с бурным развитием молекулярно-генетических методов. «Классическая» систематика, базирующаяся в основном на фенотипических признаках, стала рассматриваться как устаревшая, что нарушило преемственность в изучении таксономической структуры микробных сообществ. Внимание микробиологов в последнее десятилетие переключается в основном на ревизию таксономической системы в свете новой методологии, разработку молекулярно-генетических методов идентификации микроорганизмов in situ (Amann et al., 1993; Ward et al., 1995; Chandler et al., 1997) и попытки непосредственного измерения микробного разнообразия без процедуры видовой идентификации (Dilly et. al., 2004; Winding et. al., 2005). Молекулярно-биологическим подходам сулят интересные перспективы, однако вряд ли они могут стать абсолютной альтернативой классическим методам учета микроорганизмов с помощью выделения чистых культур, что позволяет охарактеризовать их участие в процессах, протекающих в почве (Головлев, 1998; Добровольская и др., 2001; 2009).
Увлечение новыми технологиями породило среди микробиологов скептическое отношение к традиционным методам исследования, в первую очередь методу посева. В то же время, использование молекулярно-биологических методов для изучения микробных сообществ - это не столько решение проблем микробной
экологии, сколько подмена объекта исследования, при которой возникают еще большие практические и методические сложности, чем при проведении исследований методом посева (Добровольская, 2003).
Для оценки относительного обилия видов (таксонов) внутри достаточно однородных групп микроорганизмов наиболее простым и удобным остается метод посева на простые питательные среды с последующим дифференцирующим учетом колоний и характеристикой структуры сообщества с использованием синэкологических характеристик.
В последнее время такой подход был успешно использован для количественного описания сообщества почвенных грибов (Марфенина, 1999), дрожжей (Чернов и др., 1997), группы сапротрофных бактерий в ненарушенных природных биоценозах (Добровольская и др., 2002; 2009).
Как уже ранее было отмечено, характерной особенностью городских почв является их значительное загрязнение тяжелыми металлами, нефтепродуктами, ксенобиотиками и прочими загрязнителями. В свете этого особого внимания заслуживает проблема изучения механизма сохранения бактериями жизнеспособности в загрязненных почвах. При помощи электронно-микроскопических и молекулярно-биологических методов исследования в природных средах были обнаружены бактерии, характеризующихся очень малыми размерами и высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды - ультрамикробактерии, или наноформы бактерий (Дмитриев и др., 2004; Panikov, 2005). Однако, еще в прошлом веке, известные почвенные микробиологи Д.М. Новогрудский (1933) и Н.А. Красильников (1954) предполагали, что значительная часть автохтонных почвенных бактерий характеризуются очень мелкими размерами, что и определяет их высокую устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды. Это позволяет предположить, что в сильно загрязненных городских почвах может действовать именно такой механизм сохранения бактериями жизнеспособности, что требует экспериментальных исследований.
Таким образом, изучение бактериальных сообществ городских почв представляется достаточно актуальным как с точки зрения получения представлений о составе бактериальных сообществ, что позволяет охарактеризовать их участие в экологических функциях городских почв, так и с точки зрения индикации различных
городских загрязнений, что имеет важное практическое значение. Изучение механизмов сохранения бактериями жизнеспособности в загрязненных городских почвах позволит расширить наши представления о возможностях сохранения прокариотами жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды и, как следствие, о выполнении почвой важной экологической функции - «банка организмов».
В соответствии со всем вышесказанным целью нашей работы было изучение структуры бактериальных сообществ городских почв в условиях различных типов загрязнения и выявление механизмов сохранения бактериями жизнеспособности в загрязненных почвах.
Задачи исследования:
-
Изучение организации бактериальных сообществ почв в ненарушенных лесных биогеоценозах Европейской части России.
-
Исследование изменений бактериальных сообществ почв и сопряженных субстратов в результате антропогенных воздействий на почвы Московского региона.
-
Изучение бактериальных сообществ окультуренных почв городских Ботанических садов и огородов на территории монастырей («Нилова пустынь», Соловецкий монастырь).
-
Оценка влияния некоторых антропогенных факторов на почвенные бактериальные сообщества (модельные опыты).
5. Изучение численности, физиологического состояния и таксономического
состава наноформ бактерий в природных и антропогенно нарушенных почвах.
Научная новизна
На основе количественных синэкологических критериев изучена структура бактериальных сообществ городских почв. Показано, что под влиянием антропогенных воздействий в городских почвах, загрязненных нефтью, полихлорбифенилами, цементной пылью и хозяйственно-бытовыми отходами наблюдаются разноплановые трансформации бактериальных сообществ, выражающиеся в упрощении структуры бактериальных комплексов и
доминировании резистентных форм, устойчивых к разным типам загрязнений. При загрязнении нефтью и полихлорбифенилами доминируют бактерии рода Rhodococcus, при хозяйственно-бытовом загрязнении - представители семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella), при загрязнении цементной пылью и строительным мусором - представители рода Arthrobacter.
Впервые выявлена тенденция к накоплению потенциально патогенных (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Alcaligenes) и аллергенных бактерий (роды Rhodococcus, Micrococcus) в городских загрязненных почвах, что свидетельствует о нарушении экологической функции почвы как «бактериального фильтра», и представляет опасность для человека.
Впервые показано, что в антропогенно измененных почвах, возникших в условиях длительной земледельческой практики, формируются специфические бактериальные комплексы, характеризующиеся иным профильным распределением бактерий и появлением видов, свойственных более южным регионам.
Впервые предложен метод окраски бактерий в почве люминесцентным красителем LIVE/DEAD (L7012), позволяющий охарактеризовать физиологическое состояние бактерий в природных и загрязненных почвах. Из исследованных факторов максимальное негативное действие на бактерии (повреждение клеточной мембраны) оказывает многократное замораживание и оттаивание почвы, слабее действует на клетки кратковременная обработка 1 н НС1 и 1н NaOH.
Впервые для выделения из почвы и характеристики физиологического
состояния наноформ бактерий предложен комплексный метод фильтрации,
центрифугирования и окраски красителем LIVE/DEAD (L7012). Впервые
определена численность, охарактеризовано физиологическое состояние и таксономический состав наноформ бактерий на уровне филотипов в природных почвах и городских почвах, загрязненных нефтью и тяжелыми металлами. Показано, что численность и доля наноформ бактерий в городских загрязненных почвах выше, чем в природных незагрязненных почвах. Установлено, что среди
клеток более крупного размера доля клеток с ненарушенной мембраной ниже (60 - 70%), чем среди наноформ бактерий (95-98%), что свидетельствует о высокой жизнеспособности наноформ. Высказывается предположение о способности бактерий к переходу в состояние наноформ как возможном механизме сохранения жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды.
Практическая значимость работы
Разработаны подходы для оценки реакции почвенных бактериальных
сообществ на антропогенные воздействия, что позволило охарактеризовать
бактериальные сообщества городских почв. Выявлены резистентные к
некоторым антропогенным воздействиям таксономические группы бактерий,
которые могут быть использованы в целях индикации загрязнения почвы нефтью
и полихлорбифенилами - некоторые виды рода Rhodococcus, комплексного
хозяйственно-бытового загрязнения - представители семейства
Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella).
Выявлены группы потенциально патогенных (роды Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella) и аллергенных бактерий (род Rhodococcus,Micrococcus), наиболее часто встречающиеся в загрязненных почвах городских экосистем. Установлены местообитания (верхний горизонт почвы, опад), где эти бактерии накапл ив аются.
Разработан метод определения показателей численности и физиологического состояния бактерий в природных и антропогенно нарушенных почвах при помощи двухкомпонентного люминесцентного красителя LIVE/DEAD (L7012), позволяющий оценить состояние клеточной мембраны бактерий после антропогенных воздействий.
Для выделения из почвы и характеристики физиологического состояния наноформ бактерий предложен комплексный метод фильтрации, центрифугирования и окраски люминесцентным красителем LIVE/DEAD (L7012) с последующим просмотром под люминесцентным и электронным микроскопом.
Предложены качественные и количественные показатели для оценки экологического состояния бактериальных сообществ городских почв, вошедшие в систему показателей оценки экологического состояния городских почв и
стоимостной оценки земель («Методические рекомендации по оценке экологического состояния городских почв», 2001).
Результаты проведенных исследований включены в учебные пособия
«Методы выделения и идентификации почвенных бактерий» (1989), «Методы
оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных
бактерий» (2003) и использованы в лекционных курсах по почвенной
бактериологии, экологии почвенных бактерий, биохимии почвенных
микроорганизмов, экологической биохимии, читаемых на факультете
Почвоведения МГУ.
Проведение исследований было поддержано грантами РФФИ (проекты 96-04-49264, 99-04-48973, 00-15-97886, 00-04-48029, 03-04-48620, 08-04-90201), Грантами Президента РФ для поддержки Ведущих научных школ (НШ-1518.2003.4, НШ-8797.2006.4, НШ-2227.2008.4), ФЦНТП «Биологическое разнообразие», «Биотехнология в охране окружающей среды», «Наноструктуры почв и их роль в функционировании биокосных систем» (ГК 02.740.11.0283). Основные защищаемые положения диссертации
-
Под действием антропогенных факторов происходят значительные изменения в бактериальных сообществах почв, проявляющиеся в изменении показателей общей численности и физиологического состояния бактерий, таксономической структуры бактериальных комплексов, появлении бактериальных таксонов, не свойственных природным ненарушенным почвам.
-
Почвы, сформированные в условиях длительной земледельческой практики (ботанические сады, монастырские огороды) характеризуются высокой численностью и иным профильным распределением бактерий по сравнению с фоновыми почвами. Структура сапротрофного бактериального комплекса проявляет черты сходства с бактериальными комплексами более южных регионов.
-
В сильно загрязненных городских почвах по сравнению с фоновыми почвами существенно изменены микробные сообщества. Они характеризующиеся снижением доли физиологически активных клеток бактерий и отличаются от сообществ ненарушенных зональных почв соотношением таксонов и спектром
потенциальных доминантов. При загрязнении нефтью и полихлорбифенилами потенциальными доминантами становятся родококки (род Rhodococcus), комплексном хозяйственно-бытовом загрязнении - энтеробактерии (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella), при загрязнении цементной пылью - род Arthrobacter.
4. В городских сильно загрязненных почвах прослеживается тенденция
накопления опасных для человека бактерий - потенциально патогенных (роды
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Alcaligenes) и аллергенных (род Rhodococcus,
Micrococcus).
5. Численность наноформ бактерий и их доля в городских почвах, загрязненных
нефтью и тяжелыми металлами выше, чем в природных ненарушенных почвах,
что свидетельствует о способности бактерий к переходу в состояние наноформ,
как возможном механизме сохранения жизнеспособности в неблагоприятных
условиях среды.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены на VI (Рига, 1980), VII (Алма-Ата, 1985) съездах Всесоюзного микробиологического общества, VI (Тбилиси, 1981) съезде Всесоюзного общества почвоведов, II (Санкт-Петербург, 1996), III (Суздаль,2000) и IV (Новосибирск,2004), V (Ростов-на-Дону, 2008) съездах Докучаевского общества почвоведов, Всесоюзном симпозиуме «Микроорганизмы как компонент биогеоценоза» (Алма-Ата, 1982), III Всесоюзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Москва, 1986), III Всесоюзном симпозиуме «Биодинамика почв» (Таллинн, 1988), III (Москва, 1994) и IV (Санкт-Петербург, 1998) Международном аэрозольном симпозиуме, Всесоюзной конференции «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду» (Москва, 1994), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт-Петербург, 1998), Международном симпозиуме «Функции почв в биосферно-геосферных системах» (Москва,2001), Всероссийской конференции «Перспективы развития почвенной биологии» (Москва, 2001), Международной конференции «Биогеография почв» (Сыктывкар, 2002), Всероссийской конференции «Биосферные функции почвенного покрова» (Пущино, 2005), II Международной научно-практической конференции «Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно преобразованных экосистем (Иркутск, 2006),
Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва,2006), II Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2007), International conference "Structure and function of soil organisms communities" (Ceske Budejovice,1990), Biogeomon Workshop of integrated monitoring in small catchments (Prague, 1993), International Symposium of Actinomycetes (Moscow, 1994), International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Prague, 1994), на заседании кафедры биологии почв (2010).
Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом многолетних (1975-2010 гг.) исследований автора. Автор принимал личное участие на всех этапах исследования, ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Автор принимал личное участие в сборе образцов, получении значительной части лабораторного материала, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке основного числа научных публикаций, многократно выступал с научными докладами. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 99 работ, в том числе 6 глав в монографях, 3 научных и учебных методических пособий, 45 работ в изданиях, соответствующих списку ВАК, 14 статей в научных журналах и сборниках. Опубликовано 31 тезисов докладов на Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, изложена на 350 страницах компьютерного текста, включает список литературы из 400 наименований, в том числе 250 на иностранных языках, 30 рисунков, 20 таблиц и приложения.
Благодарности. Автор благодарен своим учителям, коллегам и друзьям: Т.Г. Добровольской, Г.М. Зеновой, П.А. Кожевину, А.В. Куракову, Е.В. Лапыгиной, О.Е. Марфениной, Л.М. Полянской, Т.В. Прокофьевой, B.C. Соиной, М.Н. Строгановой, М.М. Умарову, И.С. Урусевской, И.Ю. Чернову за поддержку идей, консультации, дискуссии, помощь при выполнении отдельных разделов экспериментальной работы, а также аспирантам и студентам, принимавшим участие в проведении экспериментов:
Н.Н. Сидоренко, Н.А. Семионовой, А.В. Раппопорту, М.А. Постниковой, М.И. Волде,
И.А. Коновой, Т.Ф. Вустиной, Е.А. Бакулиной, Е.С. Ударовой, Н.Н. Студеникиной,
А.С. Мясоедову, С.А. Ваниной, М.Ю. Гудиме, Е.М. Киселевой. Отдельная
благодарность всем сотрудникам кафедры биологии почв за теплую обстановку и доброжелательность. Автор выражает глубокую признательность и благодарность проф. Д.Г. Звягинцеву за постоянное внимание, активную поддержку, критические замечания и советы, оказавшие решающее влияние на формирование научного мировоззрения автора.
Методы оценки таксономической структуры бактериальных сообществ почв: подходы и методы
В работах по почвенной микробиологии традиционно употребляется понятие «микробное сообщество». Сообщество служит объектом системного подхода и. требует,, с одной стороны, знания ключевых взаимодействующих видов, а, с другой - условий,, в которых сообщество функционирует, и.на которые оно влияет (Звягинцев и др., 1999; Заварзин, Колотилова, 2001). В этом; смысле употребление термина; «микробное сообщество», в самых общих чертах, обозначает совокупность, всех совместно существующих В1 пространстве и во времени популяций, взаимодействующих друг с другом (Звягинцев и др:, 1999). Употребление термина «микробное сообщество»- означает довольно искусственное выделение группы популяций только по признаку микроскопических размеров. Микробиологи в качестве синонимов используют термины: «микробоценоз», «ассоциация», «микробный комплекс», «группировка» и др. (Звягинцев, 1987). Такой путь позволяет расширить границы исследования, не сосредотачиваясь на отдельной группе организмов, и не детализировать степень взаимодействия между компонентами микробного комплекса, так как термин «сообщество» подразумевает наличие структурной и функциональной организации.
Взгляд на почву как сложную биокосную систему с множеством сред обитания представляется весьма продуктивным для выявления закономерностей строения и функционирования почвенных микробных сообществ (Звягинцев, 1987). В системе иерархии местообитаний предложено выделять сообщества различного масштаба или уровня в зависимости от цели конкретного исследования (Звягинцев и др., 1999; Добровольская, 2002).
Под структурой микробного сообщества в широком смысле понимают ее внутреннее устройство. В работах почвенных микробиологов наиболее часто фигурируют четыре основных аспекта структуры микробного сообщества: морфологический, таксономический, функциональный и экологический (Добровольская, 2002). Морфологический структура - соотношение разных морфотипов. Морфотипы могут быть представлены как одноклеточными, так и мицелиальными организмами, а также клетками различной формы. В узком понимании под морфологической структурой микробного сообщества понимают набор и соотношение групп микробных клеток разных форм (палочки, кокки, нити, спирали), наблюдаемых при прямой микроскопии почв. При этом оказалось, что морфологическая структура микробных сообществ значительно сложнее, чем можно было предположить, изучая морфологию чистых культур бактерий. Такое заключение было сделано С.Н. Виноградским (1952).
Одним из наиболее совершенных методов выявления, изучения и количественного учета микроорганизмов в почве является люминесцентная микроскопия в падающем (отраженном) свете с использованием в качестве флуорохрома акридина оранжевого для учета бактерий и мицелия актиномицетов (Звягинцев, 1980). Достоинства метода люминесцентной микроскопии связаны с надежным выявлением клеток на поверхности непрозрачных частиц почвы (вйт ег, 1948). Однако нерешенной до конца остается проблеме интерпретации результатов с точки зрения дифференциального учета «живых» и «мертвых» клеток (Кожевин, 2000). Показано, что цвет люминесценции зависит не только от проницаемости клеток для красителя, но и от внутриклеточной концентрации некоторых соединений (прежде всего ДНК и РНК), которые в комплексе с акридином дают красное или зеленое окрашивание (Кожевин, 2000).
Уникальные возможности в области прямых наблюдений за микроорганизмами почвы открылись с использованием электронной микроскопии. Сканирующий электронным микроскоп позволяет работать с образцами почвы, растений и т.п. в широком диапазоне увеличений (Kilbertus et al., 1979; Гузев, 1988), что позволило обнаружить наибольшее (на 1-2 порядка по сравнению с другими приемами) количество бактерий в почвах (Никитин, Никитина, 1978). Современные исследования с применением прямой микроскопии почвенной суспензии (Никитин, Васильева, Лохмачева, 1966; Ананьева, Никитин, 1979), а также прямой микроскопии на базе компьютерных программ «распознавания образов» подтверждают также высокое морфологическое разнообразие бактериальных сообществ почвы по морфологическому разнообразию клеток (Liu et al., 2001; Баринова, 2008).
Таксономическая структура — соотношение таксонов, выделяемых на разном иерархическом уровне: видов, родов, семейств, классов. Этому направлению в изучении структуры микробных сообществ начало было положено работами по исследованию соотношений биомассы крупных таксономических групп почвенный организмов: бактерий, актиномицетов и микроскопических грибов (Полянская, 1996; Звягинцев и др., 1999). В отечественной и зарубежной литературе по почвенной микробиологии часто используются такие термины как бактериальное сообщество (Добровольская, 2002), сообщество почвенных актиномицетов (Звягинцев, Зенова, 2001), сообщество почвенных микроскопических грибов (Мирчинк, 1988; Марфенина, 2005), сообщество почвенных дрожжей (Чернов, 1997; Чернов, Бабьева, Решетова, 1997).
Анализ структуры бактериальных сообществ почв на видовом уровне встречается в литературе довольно редко. Причины этого кроются в сложности и трудоемкости видовой идентификации бактерий. Имеющиеся в литературе сведения касаются, в основном, представителей видов бактерий, которые довольно легко могут быть идентифицированы на основании фенотипических: культуральных, микроморфологических и некоторых других признаков. Это - некоторые виды родов Bacillus (Мишустин, 1954), Clostridium (Емцев, 1984), Rhodococcus (Нестеренко и др., 1985; Добровольская и др., 1986), Azotobacter (Сушкина, 1949), целлюлозоразрушающих бактерий (Мишустин, 1938; Имшенецкий, 1953). Как правило, бактериологи ограничиваются анализом сообществ на уровне групп или таксонов на уровне семейств и родов. Перспективным в этом направлении- могут стать интенсивно развивающиеся в последние- десятилетия молекулярно-биологические методы таксономии бактерий. Однако основная проблема заключается не столько в технической стороне идентификации, которая сама по себе является сложной и дорогостоящей, сколько в сложности и запутанности (недостаточной разработанности) концепции вида у прокариот (Добровольская и др., 2001). Поскольку в нашей работе для характеристики бактериальных сообществ природных и городских почв широко применялся таксономический анализ структуры бактериального сообщества при помощи традиционного метода посева, в следующем разделе обзора литературы мы более подробно остановимся на достоинствах и недостатках этого метода и сравнении его с интенсивно развивающимися в последнее время молекулярно-биологическими методами.
Некоторые механизмы сохранения жизнеспособности бактериями в почве
Все выводы о структурно-функциональной организации микробных сообществ почв были сделаны вышеперечисленными авторами на основании результатов микробиологических анализов почвенных образцов, выполненных традиционным методом посева. В настоящее время зарубежные микробиологи ставят на обсуждение те же вопросы и пытаются решить их на основании результатов молекулярнобиологических методов. Однако на уровне крупных филумов, как замечают и сами авторы, очень трудно найти корреляцию между филогенетическим и экологическим микробным разнообразием. Переход от баз данных по микробному разнообразию, составленных на основании молекулярно-биологических методов, к анализу экологических функций почвенных микроорганизмов - одна из главных задач почвенной микробиологии в настоящее время. Значимость этой проблемы отражена в названиях обзоров, опубликованных за последние годы: «Ап ecological perspective on bacterial biodiversity» (Homer-Devine et al., 2004), «Microbial diversity and soil functions» (Nannipieri, 2003), «Toward an ecological classification of soil bacteria» (Fierer at al., 2007). Анализируя преимущества и недостатки каждого из существующих ныне методов оценки бактериального разнообразия, авторы приходят к выводу о том, что необходим дальнейший поиск методов и подходов, чтобы ответить на тот главный вопрос, который они ставят на обсуждение - как связаны между собой генетическое разнообразие, структура микробных сообществ и почвенные функции.
Из анализа экспериментальных работ, проведенных разными исследователями, становится очевидным пока лишь то, что нет четкой корреляции между микробным разнообразием почв и скоростью деструкции органического вещества. Элиминирование одной из групп бактерий не оказывало значительного влияния на этот процесс, так как другие группы микроорганизмов осуществляли эти функции (Nannipieri et al., 2003). Этот принцип, названный «дублирование экологических функций», давно был сформулирован одним из авторов настоящего обзора (Звягинцев, 1987). Из результатов данных многочисленных экспериментальных исследований следует, что чем больше дублеров, тем быстрее идет процесс (разложение сахаров, спиртов, органических кислот) и чем меньше дублеров, тем медленнее идет процесс (разложение фенола, анилина, ряда пестицидов и др.). Принцип дублирования весьма широко действует в почвах и, очевидно, дает возможность более точно и тонко поддерживать гомеостаз даже в изменяющихся физико-химических условиях (Звягинцев, 1987).
Для выявления роли микроорганизмов в ведущих почвенных процессах необходимо, по мнению многих исследователей, научиться определять соотношение активных и покоящихся форм микроорганизмов в почве. Для этого предлагается использовать радиоуглеродные метки, которые помогут установить связь между количеством лабильной и общей ДНК в микробной биомассе. Кроме того, дальнейшая таксономическая и функциональная характеристика С13ДНК позволит так же более точно предсказать изменения в составе микробных сообществ, происходящие при внесении разных источников С13 в почву (Nannipieri et al., 2003).
Нам представляется, что, несмотря на имеющиеся в настоящее время глубокие противоречия в результатах оценки бактериального разнообразия почв молекулярно-биологическими и традиционными методами посева, следует идти по пути одновременного использования в будущем этих методов. Следует отметить, что в настоящее время в Рибосомальной Базе Данных (RDP) содержатся сведения о более, чем 10 000 тысячах полных и частичных последовательностях фрагментов генов 16 Б рРНК коллекционных культур и “почвенных клонов” (Ма1с1ак й а1., 1999). База эта все время пополняется, что позволит со временем более точно трактовать сведения, получаемые на основании изучения амплификации фрагментов гена 16Б рРНК экстрактов ДНК из почвы.
Совместная работа молекулярных биологов, микробиологов и почвоведов должна начинаться, во-первых, с выработки единого методического подхода к отбору почвенных проб для анализа образцов, что представляется весьма значимым в плане интерпретации полученных результатов. Во-первых, необходимо привлечение почвоведов, которые должны грамотно описать и определить тип почвы, разделив ее на генетические горизонты, определив ее физические и химические свойства. В большинстве публикаций, посвященных оценке бактериального разнообразия почв с помощью молекулярно-генетических методов, не указывается ни тип почвы, ни ее положение в рельефе, ни название горизонта, из которого отбирается образец, не всегда приводится и описание растительности, нет описания климата и диапазона температур, которые определяют водно-воздушный режим почв. Только при таком описании можно будет вести дискуссию о возможности функционирования в той или иной почве термофильных креноархей или анаэробных фототрофных бактерий.
Далее, необходим отбор почвенных образцов с учетом как вертикально-ярусной структуры, так и почвенных мезо- и микролокусов. Поскольку таксономический состав микробных сообществ подвержен сезонным изменениям, следует проводить отбор проб несколько раз в году, учитывая влажность и температуру почв.
Бактериальные сообщества почв ботанических садов и огородов древних монастырей
У 13 штаммов бактерий родов АНкгоЪа ег и Яко(1ососсш был исследован состав внеклеточных полисахаридов. Все исследованные внеклеточные полисахариды, образуемые этими бактериями, осаждались цетавлоном, что свидетельствует о наличии в их составе кислотных групп (табл. 11). Семь из 13 изученных штаммов содержали в составе полисахаридов уроновые кислоты. Кислотность полисахаридов, не содержащих уроновые кислоты, вероятно, была обусловлена кислотами несахарной природы, не обнаруживаемыми использованными методами, или же кислотами сахарной природы, разрушающимися в условиях жесткого кислотного гидролиза, на что указывает ряд авторов (Егоров и др., 1984; Виноградов и др.. 1988).
В гидролизатах внеклеточных полисахаридов исследованных бактерий, помимо гексуроновых кислот, были обнаружены в разных сочетаниях галактоза, глюкоза, манноза, фукоза, рибоза, рамноза, ксилоза (табл. 11). Моносахаридный состав внеклеточных полисахаридов бактерий родов АгИігоЬасІег и
Очевидно,, что способность к образованию внеклеточных полисахаридов типичными педобионтами — бактериями родов Arthrobacter и Rhodococcus, достаточно характерный для них признак.
Принимая во внимание значительное количество образуемых клетками экзогликанов, спосоность к образованию кислых полисахаридов имеет немаловажное экологическое значение для исследованных организмов, обеспечивая им определенные преимущества, позволяющие выживать в неблагоприятные периоды в почве. Правомочно предположить, что способность к образованию внеклеточных полисахаридов относится к числу характерных свойств истинных педобионтов, сформировавшихся у них в процессе: эволюции. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что почвенные дрожжи липомицеты и многие представители родов Arthrobacter и Rhodococcus выделяются из почвы в, слизистом состоянии, утрачивая это свойство при поддержании культур на богатых лабораторных средах. Образование экзогликанов способствует созданию и поддержанию благоприятных для микроорганизмов условий обитания, а также положительно влияют на формирование водопрочной структуры почвенных агрегатов.
Другой важной особенностью коринеподобных бактерий родов Arthrobacter, Rhodococcus и Micrococcus является способность к росту в широком диапазоне температур, в том числе и при низких, близких к 0 температурах. Ранее нами было показано, что штаммы артробактерий и родококков, выделенные их южных почв, характеризовались более высокой максимальная:для роста температурой (40-45), чем штаммы, выделенные из тундровых почв (30-35).
Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus и Micrococcus, выделенные нами из дерново-подзолистой почвы, в соответствии с общепринятым определением (Современная микробиология.Прокариоты, 2005), отнесены к психротолерантным (факультативным психрофилам). Они растут в температурном диапазоне от 0 до 24, оптимальная- для накопления биомассы температура 20.
Динамику накопления биомассы и содержания ДНК и РНК при минимальной (0) и оптимальной (20) для роста температурах изучали у трех штаммов: A. globiformis 17, R. erythropolis 22, М. ruber М-69. Кривые, отражающие накопление биомассы и динамику нуклеиновых кислот в процессе роста всех трех организмов имели общие закономерности и представлены для штамма A. globiformis 17 на рис. 5.
Характер полученных зависимостей изменения содержания ДНК и РНК в процессе роста периодической культуры различен. Содержание ДНК в расчете на единицу объема бактериальной суспензии соответствует изменению концентрации биомассы. Количество ДНК в среднем составляет 3 - 4 % от веса биомассы у разных культур и практически не изменяется при изменении температуры культивирования, что свидетельствует о значительной стабильности этого компонента на единицу биомассы. Таким образом, при минимальной для роста температуре процесс синтеза ДНК в клетке сохраняет те же закономерности, что и при оптимальной температуре.
Количество РНК претерпевает в процессе роста значительные изменения и характеризуется одновершинной кривой с максимумом в экспоненциальной фазе роста. В стационарной фазе развития происходит резкое падение содержания РНК в биомассе культур. Сравнение кривых, выражающих изменение содержания РНК в процессе роста культур при 0 и 20, показывает, что при 0 кривая имеет более пологий характер, что свидетельствует о постепенных изменениях в содержании РНК при пониженных температурах роста.
Имеется много данных о прямой связи между скоростью роста микробных культур и содержанием в них РНК (Хмель, 1970; Работнова, Иванова, 1971). Показателем скорости роста микробных культур является величина удельной скорости роста ц. В условиях периодической культуры происходит изменение удельной скорости роста в связи с меняющимися условиями. Вследствие этого возникает необходимость сопоставления величины р и содержания РНК в динамике развития микробной культуры. Исходя из полученных данных, была вычислена удельная скорость роста р на каждом прямолинейном отрезке кривой роста в полулогарифмической системе координат.
Связь между полученными расчетными данными удельной скорости роста (х и соответствующими величинами содержания РНК при разных температурах культивирования представлена на рис. 6. С увеличением д содержание РЕПС у исследованных культур при 0 и 20 линейно возрастает. Однако одной и той же удельной скорости роста д соответствует более высокое содержание РНК в варианте с более низкой температурой. Снижение температуры культивирования исследованных штаммов уменьшает продуктивность рибосом, и для того, чтобы поддержать скорость роста на определенном уровне, бактерии компенсируют малую эффективность рибосом дополнительным синтезом РНК. Можно предположить, что дополнительный синтез РНК при низкой температуре происходит при росте бактерий в почве; вероятно, этим можно объяснить повышение рибосомальной насыщенности, отмеченное при изучении ультратонких срезов бактерий, полученных прямо из почвы, методом, дифференциального центрифугирования (Вае е! а1., 1972):
Изменение физиологического состояния бактерий в почве под влиянием некоторых антропогенных воздействий (модельные опыты)
Близкие закономерности в структуре сапротрофных бактериальных комплексов почвы были выявлены при изучении бактериальных сообществ урбаноземов, расположенных в непосредственной близости и на расстоянии 10 м от автомобильных магистралей на территории мегаполиса - г. Москвы (Фрунзенская набережная, Гоголевский бульвар, Ленинский проспект, Ломоносовский проспект). Во всех исследованных образцах урбаноземов доминировали грамположительные бактерии родов Arthrobacter, Bacillus, Streptomyces, в качестве субдоминантов выступали в осенний период выступали скользящие бактерии (роды Myxococcus, Polyangium Cytophagd) и представители семейства Enterobacteriaceae. В группу среднего обилия, и в качестве минорных компонентов выступали коринеподобные бактерии родов Micrococcus, Rhodococcus, Cellulomonas, Promicromonospora и грамотрицательные бактерии родов Pseudomonas, Spirillum, Aquaspirillum. В весенний период увеличивалась относительная доля представителей рода Rhodococcus в образцах, отобранных вблизи трасс, что связано с воздействием на бактериальный комплекс солей, обильно поступающих в почву в зимний период с антигололедными реагентами, и рода Aquaspirillum, что объясняется высокой влажностью отобранных в этот период образцов.
Таким образом, установлено, что в городских почвах с разными типами загрязнений бактериальные сообщества имеют ряд специфических особенностей и отличаются от естественных бактериоценозов ненарушенных почв той же природной зоны как по показателям таксономической структуры бактериального сообщества, так и по функциональной активности, проявляющейся в способности к гидролизу ФДА и интенсивности трансформации широкого круга спектров субстратов по методу МСТ. Особого внимания заслуживает изменение структуры бактериального комплекса в почвах, загрязненных нефтью и полихлорбифенилами в пользу увеличения доли родококков, что имеет индикационное значение:
Накопление в городских загрязненных почвах потенциально патогенных (семейство Enterobacteriaceae), а также аллергенных бактерий (роды Rhodococcus и Micrococcus), свидетельствует о нарушении экологической функции почвы как «бактериального фильтра» и может представлять определенную опасность для человека. Глава 6. Изменение физиологического состояния,бактерий в почве под влиянием некоторых антропогенных воздействий (модельные опыты)
Изучение реакции бактериального сообщества почвы на разнообразные воздействия окружающей среды, основанные на характеристике физиологического состояния клеток непосредственно в почве, требует применения новых методов в почвенной микробиологии. В настоящее время для характеристики изменения состояния бактериальных клеток в чистых культурах хорошо себя зарекомендовал флуоресцентный краситель LIVE/DEAD L7012 (BacLight bacterial viability kit) (Terzieva et al., 1996; Auty et al., 2001). Краситель состоит из двух компонентов - изотиоцианатфлуоресцеина, который окрашивает клетки бактерий с неповрежденной клеточной мембраной в зеленый цвет и пропидиум йодида, проникающего через поврежденную мембрану клеток и окрашивающего клетку в красный цвет. Соотношение зеленых и красных клеток позволяет сделать вывод о соотношении клеток с поврежденной и неповрежденной мембраной (интактных), т.е. о физиологическом состоянии бактерий в исследуемом образце почвы, (рис. 21). Клетки, окрашенные в.зеленый цвет, рядом авторов рассматриваются как «живые», а в красный - как «мертвые» (Terzieva et al., 1996; Auty et al., 2001).
Разработанный нами метод окраски почвенной суспензии красителем LIVE/DEAD L7012 позволило определить численность и охарактеризовать физиологическое состояние бактериальных клеток в образцах природных ненарушенных почв и городских почв, загрязненных тяжелыми металлами, нефтепродуктами и гербицидами. При помощи окраски почвенной суспензии красителем LIVE/DEAD L7012 была определена общая численность и охарактеризовано физиологическое Рис. 21. Оценка физиологического состояния бактерий в почве - окраска почвенной суспензии красителем ЫУЕ/ОЕЛО Ь7012 (изотиоцианатфлуоресцеин + пропидиум йодид). Зеленые клетки - бактерии с неповрежденной мембраной (интактные), красные - бактерии с поврежденной мембраной.
Численность и доля интактных клеток (%) в исследованных образцах почв (окраска ЫУЕ/ОЕАО Ь7012), черный цвет - клетки с поврежденной мембраной, серый - интактные клетки Почвы: 1 - аллювиальная луговая, А1; 2 - дерново-подзолистая, А1; 3 - чернозем выщелоченный, А; 4 - торфяная верховая болотная, Т1; 5 - горно-луговая, Ад; 6 - дерново-карбонатная горная, Ад; 7 - бурая лесная (горная), А1; серая лесная (горная), А1. состояние бактерий в исследованных образцах почв. Результаты представлены на рис. 22 и табл. 34.
Общая численность бактерий в свежеотобранных образцах верхних горизонтов почв: дерново-подзолистой (А1, 1-10 см), аллювиальной луговой (А1, 1-10 см), чернозема выщелоченного (А, 1-10 см) и торфяной почвы (Т1, 1-10 см), выявленная при помощи красителя 177012, была сопоставима с показателями численности бактерий, полученными другими авторами при исследовании верхних горизонтов аналогичных почв с помощью метода окраски акридином оранжевым, красителем традиционно используемым в почвенной микробиологии (Полянская и др., 1995; Полянский и др., 2002) и составляла 1,4-7,8 млрд, клеток в 1 г почвы (табл. 33). Доля клеток с неповрежденной мембраной (интактных), что выявлялось зеленым свечением клеток после окраски почвенной суспензии красителем иУЕ/ОЕАБ Ь7012, незначительно колебалась в свежеотобранных образцах исследованных почв и составляла 60-70%, остальные клетки (30- 40%) имели поврежденную мембрану, о чем свидетельствует красное свечение после окраски красителем Ь7012 (рис. 22).
Детальное исследование образцов выщелоченного чернозема, отобранных из основных генетических горизонтов почвенного профиля (А, 1-15; АВ, 15-40 см; В, 40-75 см; Вса, 75-120 см), проведенное при помощи окраски почвенной суспензии акридином оранжевым (АО) и красителем Ь7012, свидетельствовало о значительной численности бактерий в исследованной почве. По почвенному профилю показатели численности бактерий (окраска АО) снижались от 14 млрд, клеток в 1 г почвы (в верхнем горизонте) до 1-3 млрд, клеток в 1 г почвы (в нижних горизонтах). Самые высокие показатели численности соответствовали горизонту А (1- 15 см) - 14 млрд, клеток в 1 г почвы, самые низкие - горизонту ВСа (75-120 см) - 1,1 млрд, клеток в 1 г почвы (рис. 23).
