Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Введени CLASS е 4
2. Обзор литературы 8
2.1. Роль микроорганизмов в функциях почвы 8
2.2. Основные концепции строения комплекса почвенных микроорганизмов 14
2.3. Микробные индикаторы экологического состояния почвы 26
2. 4. Стойкие органические загрязнители 34
2.4.1. Поли циклические ароматические углеводороды 35
2.4.2. Полихлорированные бифенилы 40
3. Объекты и методы исследования 46
4. Метод мультиреспирометрического тестирования ... 52
5. Результаты и обсуждение 61
5.1. Применение метода мультиреспирометрического тестирования для функционального описания сообществ почвенных микроорганизмов в градиенте загрязнения 61
5.2. Влияние интродукции изолированного бактериального Комплекса на нтенсивность самоочищение почвы от пау 68
5.2.1. Биоремедиация дерново-подзолистой почвы, загрязненной креозотом, с помощью адаптированного бк 69
5.2.2. Применение микробных биосурфактантов для интенсификации биоремедиационного потенциала адаптированного бк 81
5.3. Искусственные нейронные сети для мониторинга загрязнения почвы соз 90
6. Заключение 92
7. Выводы 94
8. Список использованных источников 96
- Микробные индикаторы экологического состояния почвы
- Полихлорированные бифенилы
- Влияние интродукции изолированного бактериального Комплекса на нтенсивность самоочищение почвы от пау
- Применение микробных биосурфактантов для интенсификации биоремедиационного потенциала адаптированного бк
Введение к работе
Актуальность проблемы. Реализация обществом концепции устойчивого развития — это обеспечение его здоровья, благополучия, продовольственной и экологической безопасности. Концепция предполагает необходимость гармонизации взаимоотношений человека с природой, поддержание здоровья среды и почвы — главного и незаменимого компонента агросферы и земной биосферы. Антропогенная деградация почвенного покрова может привести его в состояние, непригодное для получения биопродукции.
Значительная роль в формировании «здоровья почвы» принадлежит микробному сообществу, которое выполняет основную работу по поддержанию биосферных процессов (Виноградский, 1952; Звягинцев, 1987; Заварзин, 2003; Кожевин, 2006). Оно является основным компонентом почвенной биоты и выполняют многообразные функции в круговороте веществ, включая самоочищение от ксенобиотиков и природных поллютантов. Микробное сообщество -важнейший объект агроэкологического мониторинга и объективный экологический индикатор состояния почвенного биоценоза, в том числе отклика на его загрязнение различными поллютантами (Умаров, 1986; Гузев, Левин, 1991; Круглов, 1991; Марфенина, 1994; Добровольская, 2002; Терехова, 2006).
В настоящее время многие почвы загрязнены стойкими органическими загрязнителями (СОЗ). Это органические соединения природного или антропогенного происхождения, которые трудно подвергаются фотолитическому, химическому или биологическому разложению. СОЗ — особо опасные токсиканты (канцерогены, мутагены, разрушители эндокринной системы). Ликвидация опасности, вызванной
загрязнением почвы полициклическими ароматическими
углеводородами (ПАУ) и полихлорированными бифенилами (ПХБ) является важной и актуальной экологической проблемой современности, обеспечивающей безопасность жизни настоящего и будущих поколений.
В числе фактологических и функциональных критериев состояния
почвенного микробного комплекса антропогенно загрязненных почв
традиционно используются: микробная биомасса, базальное дыхание,
микробный метаболический коэффициент (Полянская, 1996; Ананьева
2003; Горленко, Кожевин, 2005; Благодатский и др., 2008). В последние
годы разрабатываются новые подходы, основанные на оценке
функционального разнообразия микробных сообществ почвы,
индуцированной загрязнителем толерантности (PICT-эффект — pollution
induced community tolerance). Данные о применении указанных
показателей для оценки экологического состояния почвы, загрязненной {
двумя специфическими группами СОЗ — ПАУ и ПХБ, в литературе отсутствуют.
Научная новизна. Для эколого-токсикологической оценки микробных сообществ почвы, загрязненной СОЗ, разработана и применена мультиреспирометрическая тест-система. С использованием разработанной тест-системы установлен PICT-эффект для микробных сообществ почв, загрязненных ПАУ и ПХБ, созданы и обучены искусственные трехслойные нейронные сети для индикации и прогнозирования загрязнения ПАУ и ПХБ в исследованных дерново-подзолистой почвах.
Практическая значимость. На устройство для выполнения метода мультиреспирометрического тестирования (МРТ) получен патент на полезную модель (RU 74479 U1). Показана эффективность применения
тест-системы для MPT и оценки экологического состояния почвы, загрязненной СОЗ. На биосурфактантобразующие штам мы-деструкторы Pseudomonas alcaligenes MEV, Pseudomonas putida BS получены патенты на изобретение RU № 2228952, RU 2 292 391. Штаммы-деструкторы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика. Результаты исследований используются в курсе преподавания экологии почвенных микроорганизмов на кафедре биологии почв.
Установлено, что выделенный из загрязненной ПАУ почвы адаптированный бактериальный комплекс (БК) может быть использован для микробной ремедиации как самостоятельно, так и в сочетании с микробными биосурфактантами. Полученные результаты могут быть использованы в интересах агроэкологического мониторинга для экспресс—оценки состояния «почвенного здоровья», при бонитировке почв сельскохозяйственных, селитебных и рекреационных территорий.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003); IX конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2004), 3-м и 4-м Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007); 1-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям»- (Москва, 2008), 10th International conference ConSoil 2008, Italy (Milan, 2008), на
заседаниях и научных семинарах кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.
Выражаю искреннюю благодарность за помощь и постоянную поддержку в работе над диссертацией д.б.н. П.А. Кожевину, а также проф. Д.Г. Звягинцеву, сотрудникам, аспирантам и студентам кафедры биологии почв МГУ им. М.В.Ломоносова.
Микробные индикаторы экологического состояния почвы
Полициклические ароматические углеводороды и их гибридные формы входят в состав сложных углеродистых веществ земной коры и ландшафтной оболочки Земли в виде рассеянных битуминозных веществ, нефтей, битумов, компонентов почвенного гумуса, аэрозолей воздуха, липидов растительных и животных тканей (Геннадиев и др., 1997; Alexander, 1999). ПАУ представляют собой высокомолекулярные органические соединения, основным элементом структуры которых является бензольное кольцо (рис. 6). К ПАУ относятся соединения, содержащие в своем составе несколько бензольных колец, соединенных вместе или разделенных парой соседних атомов углерода между примыкающими кольцами. ПАУ насчитывают более 200 соединений (Клар, 1971).
Растворимость ПАУ в чистой воде невелика и значительно варьирует для разных углеводородов (0,1-1,0x10 мкг/л); растворимость в органических растворителях уменьшается с увеличением молекулярного веса соединения в зависимости от взаимного расположения конденсированных бензольных колец в молекуле. Растворимость пирена в воде составляет 0,11 мкг/л, что примерно в тысячу раз выше, чем растворимость 3,4-бензпирена.
Выделяют 4 группы факторов, способствующих образованию углеводородов:
- космические,
- эндогенные геологические,
- биогеохимические
- техногенные. В земной коре происходят геохимические процессы, приводящие к образованию ПАУ в виде смоло-, битумообразных и углистых веществ (Ровинский, 1988; Геннадиев и др., 1992; Геннадиев и др., 1996).
Один из механизмов образования природных ПАУ в современных и древних осадках, а также в почвах - это воздействие глубинного тепла Земли на захороненное в ней органическое вещество. К природным факторам образования ПАУ в осадочных наносах и почвах можно отнести и лесные пожары как современные, так и в прошлые геологические эпохи (Ramdahl, 1982), участившиеся в последние годы пожары на торфоразработках. Кроме того, образование ПАУ возможно в результате биогеохимической трансформации замещенных и незамещенных углеводородов, пептидов, липидов, углеводов, лигнина и его производных, терпенов, никотина и пигмента листьев (Jones, 1991).
Однако значительная часть, присутствующих в биосфере ПАУ, имеет техногенное (антропогенное) происхождение. ПАУ образуются при сгорании органических веществ в условиях высокой температуры и являются весьма распространенными загрязнителями внешней среды. ПАУ загрязняют окружающую среду в результате сгорания органических соединений (уголь, нефть, древесина), аварийных разливов нефти и нефтепродуктов, работы коксо-, газо- и нефтехимических производств (Агапкина и др., 2007; Wakeham et al., 1980; Cerniglia, 1992; Cerniglia et al., 1992). Большое количество ПАУ поступает в окружающую среду с выхлопными газами автомобильной и автотракторной техники.
Так, поступление углеводорода 3,4-бензпирена в окружающую среду составляет около 5000 т в год, из них 60% приходится на процессы, связанные со сжиганием угля, 20% - на производство кокса, 4% - на сжигание древесины, 8% - на открытое сжигание леса, травостоя и сельскохозяйственных культур, 1% - на выбросы от транспорта и лишь 0,15% на сжигание нефти и газа. Например, в США в 1976 г. при сжигании угля (промышленные и бытовые) в окружающую среду попало 87% всей эмиссии 3,4-бензпирена; при сжигании древесины и сельскохозяйственных отходов - 4%, работа транспорта — 2,8%, при сжигании нефти и газа - десятые доли процента (Suess, 1976).
ПАУ обладают канцерогенным, мутагенным и генотоксическим действием на широкий круг живых организмов.
Так, бенз[а]антрацен (тетрафен) и хризен являются слабым, а бенз[а]пирен (3,4-бензпирен) - сильным канцерогеном (Harvey, Dunne, 1978). Наряду с 3,4-бензпиреном сильные канцерогенные свойства отмечены для следующих ПАУ: диметил (9,10-, 1,9-) тетрафенов, 20-метилхолантрена, 1,2-5,6-дибензантрацена, метил (1-,5-) и 5-окси-3,4-бензпиренов, 3,4-9,10-дибензпирена, 3,4-8,9-дибензпирена и 3,4-5,6-дибензкарбазола (Геннадиев и др., 1966). Считается, что канцерогенные свойства ПАУ могут быть обусловлены их метаболитами, диол- и эпоксипроизводными, представляющими собой высокоактивные промежуточные соединения, способные образовывать ковалентные связи с ДНК. Такая метаболическая активация ПАУ происходит в микросомах эндоплазматического ретикулума и катализируется монооксигеназами, ассоциированными с цитохромом Р-450.
Полихлорированные бифенилы
Полихлорированные бифенилы (ПХБ) - класс химических ароматических соединений, содержащих в молекуле от одного до десяти атомов хлора (рис. 6). Общая формула ПХБ - CnHio-nCln, где п варьирует от 1 до 10. ПХБ получают хлорированием бифенила — производного бензола, в присутствии катализатора путем замещения атомов водорода атомами хлора.
Первые полихлорированные бифенилы (ПХБ) были произведены в США компанией "Монсанто" в 1929 г. В силу своих уникальных физико-химических свойств эти соединения нашли самое широкое применение во всех развитых странах. Начиная с 1929 г. ПХБ производили в разных странах под торговыми марками Совол, Совтол, Гексол, Aroclor, Clophen, Del or, Kanechlor, Phen-clor, Pyralene (Афанасьев и др., 1982; Кухарчик, 2006). В коммерческих смесях обычно присутствуют от 20 до 60 конгенеров ПХБ, преимущественно с 3-6 и в небольших количествах с 2, 7 и 8 атомами хлора. Благодаря своей термической и химической устойчивости, негорючести и диэлектрическим свойствам ПХБ, широко использовались в качестве диэлектрических жидкостей, теплоносителей, гидравлических жидкостей, пластификаторов, адгезивных веществ. В 70-80-х годах прошлого столетия после обнаружения повышенной персистентности в окружающей среде, токсичности и способности накапливаться в жировых тканях человека и животных, производство ПХБ во многих странах было запрещено, а использование резко ограничено. Сейчас эти соединения признаны одними из самых опасных поллютантов в мире (Ревич, 2000). В настоящее время в России производство, импорт, торговля и использование ПХБ официально не запрещены, хотя их производство прекращено между 1987 и 1993 гг. . До середины 80-х годов прошлого столетия мировое производство ПХБ составило около 1.5 млн. тонн, и до сих пор около 750 тыс. тонн ПХБ продолжает использоваться, в основном в закрытых системах, и примерно столько же находится в биосфере Земли (Ohtsubo et.al., 2004; Кухарчик, 2006 ). Большая часть попавших в окружающую среду ПХБ локализована в почве и седиментах водоемов вблизи мест их бывшего производства и использования. В загрязненных местах концентрации этих химикатов в почве и осадках могут достигать 10-104 мг/кг (Pieper, 2005). Это на порядки превышает допустимый уровень, который варьирует от 0.01 до 50 мг/кг в зависимости от страны и предназначения территории. Фоновое содержание суммы ПХБ в почве для стран центральной Европы варьирует в пределах 1-10 мкг/кг, для городских территорий - 10-100 мкг/кг. В России действует ОДК (ориентировочные допустимые количества): для ПХБ - 0.06 мг/кг, для ТХД - 0,03 мг/кг, для пентахлорбифенила - 0,1 мг/кг (Перечень ПДК и ОДК ..., 1991). В Канаде все почвы, содержащие более 50 мг ПХБ/кг, должны храниться в отдельных помещениях или подвергаться очистке.
В России было произведено около 0,3-0,5 млн. тонн ПХБ, преимущественно в Дзержинске Нижегородской обл. и Новомосковске Тульской обл.. Кроме этих городов, сильно загрязненные ПХБ почвы имеются также в Чапаевске Самарской обл., вблизи завода-изготовителя конденсаторов и трансформаторов в г. Серпухове Московской области, а также в ряде мест использования и хранения электротехнического оборудования (Бобовникова и др., 1980; Попова и др., 2000; Галиулин, Галиулина, 2008; Какарека, Кухарчик, 2003; Кухарчик и др., 2003; Кухарчик и др. 2007; Коноплев, 2001; Майстренко и др., 1996; Майстренко и др., 1998). Так, на расстоянии 300 м от завода «Конденсатор» в г. Серпухове в поверхностном слое почвы содержание ПХБ составило 37500 мг/кг (сумма ПХБ), на глубине 5-10 см -18300 мг/кг; 10-20 см - 2350; 20-30 см - 2740; 30-40 см - 29,4; 40-60 см - 50,6 мг/кг (Хакимов и др. , 2003; Кухарчик, 2006). Наиболее используемые в мире методы утилизации ПХБ-загрязненных отходов (высокотемпературное сжигание и захоронение) требуют больших материальных и энергетических затрат, приводят к потере почвенного плодородия и образованию самых опасных токсикантов-диоксинов. Одним из альтернативных методов очистки загрязненных ПХБ почв, грунтов и сточных илов является биоремедиация (Васильева, Стрижакова, 2007; Mackova et. al., 2006; Vasilieva et. al., 2006).
Поиск путей увеличения эффективности биодеградации ПХБ в твердых природных матриксах проводился преимущественно в лабораторных условиях в твердофазных и жидкофазных биореакторах и микрополевых (пилотных) экспериментах (Рыбкина и др.; 2003; Demnerova et.al., 2002). К настоящему времени опубликованы десятки работ, в которых изучались возможности анаэробной, аэробной и анаэробно-аэробной биоремедиации загрязненных ПХБ природных сред. В основном разрабатывались методы биостимуляции специфической аборигенной микрофлоры, способной кометаболизировать ПХБ, путем внесения специфических индукторов и оптимизации условий среды. В некоторых исследованиях для увеличения численности и разнообразия ПХБ-деструкторов или усиления их биоремедиационного потенциала использовали биоагментацию - интродукцию в загрязненную ПХБ почву отдельных популяций микроорганизмов-деструкторов или в виде ассоциации (Zharikov et. al., 2007). Ход процесса биоремедиации почвы, загрязненной ПХБ почвы обязательно сопровождается оценкой ее «здоровья». Как показали многочисленные литературные источники, загрязнение почвы токсичными и канцерогенными СОЗ приводит к серьезным нарушениям экологического состояния почвы. ПАУ и ПХБ являются гидрофобными органическими веществами, плохо растворимы в воде и поэтому только часть органических поллютантов может быть доступна почвенной биоте. Химические методы анализа достаточно чувствительны и позволяют подтвердить валовое содержания загрязнителя в окружающей среде по сравнению с фоновым. Однако, основываясь исключительно на данные химических анализов, невозможно адекватно оценить экологический риск присутствия ПАУ и ПХБ в почве. Использование биологических показателей позволяет в определенных пределах определить уровень действующих концентраций поллютанта на биоту, почвенные процессы, экологические функции почвы в биосфере.
Итак, для оценки экологического состояния почв, загрязненных СОЗ, наряду с данными химических анализов, в наших исследованиях была оценена функциональная реакция микробного комплекса -ключевого катаболического компонента почвенной биоты, разлагающего органическое вещество, поступающее в почву. Именно функциональный потенциал микробной системы обеспечивает круговорот основных биофильных элементов почвы и определяет ее «здоровье».
Влияние интродукции изолированного бактериального Комплекса на нтенсивность самоочищение почвы от пау
В настоящее время для очистки почв от загрязнения различными углеводородами наряду с механическими, физико-химическими методами используется биоремедиация. Биологические методы экономичны и удовлетворяют современным жестким требованиям экологической безопасности (Biological degradation..., 1994). В природных условиях скорость процесса деструкции ксенобиотиков естественной микрофлорой почвы обычно мала. Интенсификация биологического разрушения ПАУ в окружающей среде может быть достигнута путем интродукции популяций специализированных микроорганизмов-деструкторов (биоаугментация), использования растений (фиторемедиация), применения микробных и растительно-микробных ассоциаций.
Вероятным путем оптимизации микробиологических параметров загрязненной ксенобиотиками почвы для ускорения процессов самоочищения от загрязнения поллютантами могла бы стать интродукция микробных комплексов, извлеченных из загрязненных почв, осадков сточных вод и иных местообитаний. Это позволяет в полной мере использовать природный экологический потенциал - микробное биоразнообразие. Известно, что БК, выделенный из плодородной почвы с помощью ультразвуковой обработки и центрифугирования без подращивания на питательных средах, эффективно применялся в качестве микробного удобрения (Кожевин, Корчмару, 1995). Однако вопрос о влиянии интродукции адаптированного к ПАУ природного БК на скорость процессов самоочищения почвы от загрязнения ПАУ, еще не исследован.
В настоящем работе мы изучали возможность интенсификации самоочищающей способности почвы, загрязненной ПАУ, при помощи адаптрованного БК, выделенного из почвы, и толерантного к поллютанту (PICT-эффект). В работе использовали выделенный из загрязненной креозотом дерново-подзолистой почвы и толерантный к поллютанту БК. Известно, что креозот на 85% состоит из ПАУ (Murphy, Brown , 2005).
Адаптацию микробного сообщества почвы проводили в почвенных микрокосмах, добавляя поллютант в почву при запуске сукцессионного процесса увлажнением ее до 60% от полной влагоемкости и температуре 28С. Загрязнение почвы ПАУ моделировали однократным внесением каменноугольной смолы (креозота), полученной из коксующихся углей Донецкого угольного бассейна (Standard GOST 2770-74 SD TRADE Donetsk region, Ukraine). Водную эмульсию каменноугольной смолы получили при обработке ультразвуком. БК извлекали из образцов дерново-подзолистой почвы без подращивания на питательных средах на основе ультразвуковой обработки и центрифугирования.
Загрязненный креозотом (750 мг/кг) и контрольный образцы почвы были увлажнены 1 %-ным раствором глюкозы для инициации сукцессии. Образцы почв инкубировались при постоянной влажности (60%- полной влагоемкости и температуре 28 С в течение месяца. Через месяц адаптированный к ПАУ и контрольный БК извлекали из почвы. Для этого выделенную почвенную суспензию (1:5) обрабатывали ультразвуком (установка УЗДН-2 т, сила тока - 0,08 А, частота - 22 кГц, время — 30 с) с последующим центр фугированием (ОПН - 4 , 5000 об/мин, 1,5 мин.). В качестве дополнительного контроля использовали также инактивированный БК, полученный после температурной обработки (100С, 5 мин) адаптированного БК. Относительную эффективность инактивации клеток БК контролировали высевом на агаризованную питательную среду с гидролизатом рыбной муки.
Результаты оценки толерантности микробного сообщества дерново-подзолистой почвы в ходе микробной сукцессии показали (рис. 14), что толерантность микробной системы почвы увеличиваясь со временем, достигла максимума на 21 суткам и стабилизировалась. На 21 сутки микробной сукцессии эффективные концентрации фенантрена (ЭК5о) для адаптированного почвенного микробного комплекса превышали таковые показатели для незагрязненной дерново-подзолистой почвы по 4 использованным субстратам: глюкозе, арабинозе, ацетату натрия и гистидину в среднем в 3,2 раза (рис. 14) при определении методом МРТ.
. Влияние интродукции адаптированного БК на содержание ПАУ в загрязненной дерново-подзолистой почве
Основные эксперименты по изучению эффективности биоремедиации загрязненной почвы с помощью БК проводили в условиях почвенных микрокосмов. В пластмассовые стаканчики объемом 500 см помещали по 400 г почвы, просеянной через сито размером 2 мм. Загрязненная ПАУ почва была увлажнена водой и инкубировалась при заданных режимах температуры и 60% влажности в течение 28 суток после интродукции БК. В экспериментах использовали дерново-подзолистую почву (Московская область).
Применение микробных биосурфактантов для интенсификации биоремедиационного потенциала адаптированного бк
Биоремедиационный потенциал адаптированного БК может быть увеличен за счет применения поверхностно-активных веществ. Применение синтетических сурфактантов создает дополнительную экологическую проблему. Биологические поверхностно активные вещества (биосурфактанты) нетоксичны и легко подвергаются биодеструкции в почве.
В работе по интенсификации биоремедиационного потенциала адаптированного БК использовали микроорганизмы-деструкторы:
1. Биосурфактантобразующий штамм P. alcaligenes MEV, деструктор углеводородов нефти, выделен из загрязненной креозотом почвы;
2. Биосурфактантобразующий штамм P. putida BS, деструктор нитроароматических соединений, выделен из загрязненной тритнитротолуолом почвы.
Штаммы поддерживали па агаризованной среде из ферментативного гидролизата рыбной муки. Для получения биосурфактантов культивирование микроорганизмов проводили в питательной среде следующего состава (г/л): СаСЬ 2 Н20, 2.0; МпСЬ 4Н20, 0.4; NiCb. 6Н20, 0.4; ZnS04 7Н20, 0.4; FeCl3 6Н20, 0.2; Na2Mo04 2 Н20, 0.2; и 2% гексадекана или 2% глюкозы в качестве источника углерода, рН 7,2. Посевная доза бактерий-деструкторов составила 1,0 105 кл/мл. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера в течение 18-20 ч при температуре 29 С и 180 оборотах/мин мешалки. Для получения биосурфактанта микробные клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин. в течение 10 мин. Биосурфактант, находящийся в культуральной жидкости, экстрагировали хлороформом, сушили с использованием безводного Na2S04 и последующим выпариванием на роторном испарителе. Содержание биосурфактанта (гликолипид) в полученных образцах определяли с помощью орциноловой пробы. Для этого 330 мкл супернатанта дважды экстрагировали 1 мл диэтилового эфира. Эфиросодержащую жидкость выпаривали досуха, добавляли 0,5 мл воды. К 100 мкл полученного водного раствора добавляли 900 мкл 0,19%-ного раствора орцинола в 53%-ном растворе серной кислоты, экспонировали 30 мин при 80С и фотометрировали при длине волны 421 нм. Количественно содержание гликолипидов рассчитывали по стандартной кривой, построенной для L-рамнозы и выражали в единицах рамнозного эквивалента (RE), мг/мл.
Рис. 18. Кольцевой тензиометр компании Cole-Parmer
Измерение поверхностного натяжения культуральной жидкости после культивирования штаммов проводили с использованием кольцевого тензиометра (рис. 18).
Перед измерением поверхностного натяжения клетки штамма отделяли центрифугированием. Стерильную питательную среду использовали в качестве контроля.
На рис. 19-20 представлены результаты периодического культивирования штаммов P. alcaligenes MEV и P.putida BS на глюкозе и гексадекане в качестве единственных источников углерода и энергии. Как показали результаты исследований, при культивировании на глюкозе оба штамма достигли стационарной фазы быстрее (для штамма MEV - 20-й час культивироывния, для штамма BS - 30-й час), чем при выращивании на гексадекане (для штамма MEV 60-й час культивирования, для штамма BS - 70-й час). Однако, образование биосурфактантов интенсивнее шло на среде с гексадеканом. Так на 20-й час культивирования на глюкозе поверхностное натяжение культуральной жидкости штамма MEV составило 32 дин/см, а при выращивании на гексадекане - 21 дин/см. У штамма BS поверхностное натяжение культуральной жидкости на 20-й час культивирования на глюкозе составило 38 дин/см , а на гексане -27 дин/см. Поверхностное натяжение дистиллированной воды (контроль) в эксперименте было равно 69 дин/см.
Максимальное количество гликолипида при культивировании штамма на гексадекане было получено в начале стационарной фазы. При этом выход биосурфактанта на гексадекане у штамма MEV 0,05 мг/мл, у штамма BS - 0,07 мг/мл.
Для проведения лабораторных экспериментов по биоремедиации были наработаны препаративные количества биосурфактантов штаммов P. alcaligenes MEV и P. putida BS массой 1,0 г и 1,1 г соответственно. Биосурфактант вносили в почву из расчета 0, 1 мг биосурфактанта на 1 г почвы. 5.2.2.2. Биоремедиация дерново-подзолистой почвы, загрязненной ПАУ, при совместном использовании адаптированного БК и биосурфактантов
Биосурфактанты, увеличивая растворимость многих органических гидрофобных соединений в почвенном растворе, повышают их биодоступность для микроорганизмов-деструкторов и ускоряют разложение поллютанта. Результаты исследований показали, что комбинированное применение адаптированного БК с микробным биосурфактантом, полученым из культуральной жидкости штамма Pseudomonas alcaligenes MEV более эффективно для очистки загрязненной ПАУ дерново-подзолистой почвы по сравнению с обработкой почвы только одним БК (табл. 12). В вариантах опыта с внесением адаптированного БК и биосурфактанта время полуисчезновения ПАУ уменьшилось в 1,7 раза (для суммы 16 ПАУ) по сравнению с вариантом, при котором применяли только адаптированный БК. Наибольшее снижение периода полуисчезновения индивидуальных ПАУ в ходе биоремедиации почвы наблюдалось для бензантрацена (в 2,2 раза), наименьшее - для бепзо[Ь]флуарантена и бензо[к]флуарантена (в 1,2 раза).
Близкие результаты по интенсификации биоремедиационного потенциала адаптированного БК в экспериментах по очистке почвы от ПАУ были получены также при использовании биосурфактанта, выделенного из штамма P. putida BS совместно с адаптированным БК. Для суммы 16 ПАУ время полуисчесновения из дерново-подзолистой почвы уменьшилось в 1,5 раза по сравнению с вариантом, когда применялся только адаптированный БК.
