Введение к работе
Актуальность проблемы
Термоацидофильные сообщества вулканических гидротерм давно привлекают внимание исследователей из-за воздействия на микроорганизмы сразу двух экстремальных факторов — высокой температуры и низкого значения рН. Из кислых гидротерм, расположенных в различных географических зонах, разными авторами были выделены термоацидофильные бактерии и археи, однако полного представления о микробных термоацидофильных сообществах нет.
Особый интерес к термоацидофилам обуславливается возможностью их промышленного использования. Внеклеточные ферменты термоацидо-филов ценны для ряда производственных процессов, идущих при высоких температурах и низких значениях рН, например, для переработки крахмала и целлюлозы. Экстремофильность микроорганизма или фермента обуславливает и общую его стабильность. В высокотемпературных процессах (и процессах с низкой кислотностью) снижается риск микробного загрязнения; очистка ферментов, клонированных в мезофильные клетки, упрощается благодаря процедуре температурного (и рН) шока, денатурирующего остальные белки клетки-хозяина (Vieille and Zeikus, 2001; Bertoldo et al., 2004).
Анаэробные процессы, осуществляемые известными термоацидофильными прокариотами, ограничиваются автотрофной фиксацией углерода в биомассу, литотрофным и органотрофным восстановлением элементной серы и некоторых серных соединений, а также окислением Сахаров, полисахаридов и пептидов. Процессы, идущие непосредственно в термоацидофильных сообществах, не изучались. Поэтому одним из направлений данной работы было определение с помощью радиоизотопных методов скорости процессов, идущих в горячих кислых источниках.
На момент начала этой работы группа анаэробных термоацидофильных органотрофных прокариот была крайне малочисленной и состояла только из представителей факультативно анаэробного рода Thermoplasma (Johnson, 1998). В последующие годы было описано еще несколько новых родов этой группы (Itoh et al., 1998, 1999, 2002, 2003), и в результате группа расширилась. Однако облигатно анаэробные термоацидофилы были представлены лишь одной археей — литотрофным Stigiolobus azoricus (Segerer et al., 1991). Поэтому исследования в рамках данной работы были сфокусированы на поиске новых анаэробных термоацидофилов, в том числе органотрофных.
Способность к брожению не известна среди мезофильных ацидофи-лов; нейтрофильные мезофилы чаще всего прекращают брожение при рН
около 4.0, и лишь единичные нейтрофилы способны осуществлять брожение при более низких рН, например Sarcina ventriculi (Canale-Parola, 1986). Среди термофильных ацидофилов способность к брожению известна только у Thermoplasma spp.; представители рода Caldisphaera также способны расти в отсутствие внешних акцепторов электронов. Из-за столь малого количества организмов, способных к брожению в кислых условиях, актуален поиск других термоацидофилов-бродилыциков.
Т/ели и задачи исследования
Целью работы было изучение термоацидофильных микробных сообществ из природных местообитаний.
Задачи исследования состояли в следующем:
-
Определение микробной активности в континентальных горячих кислых источниках с помощью радиоизотопных методов.
-
Получение анаэробных термоацидофильных накопительных культур из континентальных горячих кислых источников и их филогенетический анализ.
-
Получение анаэробных термоацидофильных накопительных культур из глубоководных гидротермальных источников и их филогенетический анализ.
-
Выделение и характеристика термоацидофильных и термоацидо-толерантных микроорганизмов.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые с помощью радиоизотопных методов показана высокая активность микробиологических процессов цикла углерода в горячих кислых источниках. С помощью молекулярно-биологических и микробиологических методов исследовано разнообразие термоацидофильных прокариот в наземных и морских гидротермах.
Разработан метод приготовления твердых сред, устойчивых при высоких температурах и низких значениях рН.
Выделены и полностью охарактеризованы новые ацидофильные и ацидотолерантные термофильные микроорганизмы. Описан новый род термоацидофильных архей Acidilobus gen. nov., включающий 2 вида -Acidilobus aceticus sp. nov. и 'Acidilobus saccharovorans' sp. nov.; новый вид архей ' Vulcanisaeta moutnovskid' sp. nov.; а также новая термофильная бактерия 'Thermoanaerobacterium acidotolerans' sp. nov.
В анаэробных термоацидофильных накопительных и чистых культурах обнаружены новые морфотипы вирусоподобных частиц.
Полученные результаты расширяют представление о филогентиче-ском и фенотипическом разнообразии анаэробных микроорганизмов, населяющих горячие кислые источники. Кроме того, новые микроорганизмы,
обитающие при экстремальных значениях температуры и рН, могут являться потенциальными источниками новых ферментов, обладающих устойчивостью к этим параметрам среды и поэтому ценных для использования в производствах, требующих повышенных температур или низких значений рН среды.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Thermophiles 1998", "IXth International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology" 1999, "Extremophiles 2000"; "Extremophiles 2002"; "1-st FEMS Congress of European Microbilogists", 2003; "2-nd FEMS Congress of European Microbilogists", 2006, а также на международной студенческой конференции "Ломоносов-99", 1999; школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", 2000; Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии — 2005".
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 15 печатных работ (6 публикаций и 9 тезисов).
Место проведения работы
Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Филогенетический анализ накопительных культур был выполнен во время стажировки в лаборатории микробиологии Европейского Института моря Университета Западной Бретани (Брест, Франция) под научным руководством д-ра Кристиана Жантона и с участием сотрудника лаборатории Оливье Нерсессяна.
Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполнили к.б.н. А.М. Лысенко и K.6.H. Н.А. Черных (ИНМИ РАН). Анализ последовательностей 16-S рДНК чистых культур выполнили к.б.н. Б.Б. Кузнецов, к.б.н. Т.В. Колганова (Центр Биоинженерии РАН) и к.б.н. Т.П. Турова (ИНМИ РАН). Электронную микроскопию накопительных и чистых культур проводили совместно с Н.А. Кострикиной (ИНМИ РАН). Радиоизотопные исследования проводили совместно с И.И. Русановым и Н.В. Пименовым (ИНМИ РАН). Исследование метаболизма Acidilobus асе-ticus проводили совместно с д.б.н. М.Ю. Грабович, к.б.н. Д.А. Подкопае-вой и М.А. Арабцевой (кафедра физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского Государственного университета).
Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым участникам работы, а также сотрудникам и аспирантам лаборатории гипертер-
мофильных микробных сообществ за поддержку и участие в этой работе. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на страницах машинописного
текста и включает 24 рисунка и 11 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 180 наименований.
