Введение к работе
Актуальность. Как известно, токсическое действие противоопухолевых препаратов на гемопоэз является наиболее частым побочным эффектом, возникающим при лечении больных злокачественными новообразованиями. В большинстве случаев глубокая миелодепрессия проявляется в ранние сроки развитием в периферической крови лейкопении, затем тромбоцитопении и в последнюю очередь – анемии. Многочисленные исследования доказывают, что индуцированная химиотерапией нейтропения – распространённый фактор риска развития тяжелых инфекционных осложнений, которые являются частыми причинами смерти онкологических больных [Переводчикова Н.И., 2011; Сакаева Д.Д. и др., 2007; Di Maio M. et al., 2005; Lyman G.H. et al., 2005; Luftner D., Possinger K., 2005; Sharma A., Lokeshwar N., 2005; Takata T., Tamura K., 2006]. Несмотря на современное лечение, продолжают погибать от 3 до 10% пациентов с фебрильной нейтропенией. Особенно следует учитывать, что в их число входят педиатрические пациенты с гематологическими злокачественными заболеваниями, а также потенциально излечимые больные [Groll A.H., Ritter J., 2005; Kamps W.A. et al., 2005; Laws H.J. et al., 2005]. В период нейтропении источником инфекции становится эндогенная и экзогенная флора, резко возрастает роль внутрибольничной инфекции [Manterola A. et al., 2004; Sharma A., Lokeshwar N., 2005; Mays S.R. et al., 2006]. К факторам, усиливающим риск развития инфекции, относятся глубина и длительность нейтропении, иммуносупрессия, изменения микрофлоры.
В связи с этим, изыскание новых способов профилактики и лечения нейтропений, возникающих при проведении противоопухолевой терапии злокачественных заболеваний, приобретает все большее значение.
Весьма перспективной в этом направлении является разработка патогенетически обоснованных методов коррекции патологии системы крови, основанных на принципе подражания естественным регуляторным системам организма [Гольдберг Е.Д. и др., 2008; Дыгай А.М., Жданов В.В., 2010]. Согласно современным представлениям о механизмах регуляции кроветворения, решающая роль в поддержании адекватного плацдарма гемопоэза принадлежит гемопоэзиндуцирующиму микроокружению. При этом элементы микроокружения определяют пролиферативный и дифференцировочный статус кроветворных клеток-предшественников посредством продукции гуморальных регуляторов (цитокинов) и межклеточных взаимодействий (в частности, комплекс гликозаминогликанов и экстрацеллюлярных белков обеспечивает концентрацию гемопоэтических ростовых факторов и модуляцию их функции). Кроме того, пусковым звеном, определяющим адаптивный ответ кроветворной ткани, являются центральные нейроэндокринные механизмы, реализующие свое влияние посредством универсальных стресс-реализующих (вегетативной, гипофизадреналовой) и стресс-лимитирующих систем (гамкергической и др.) [Гольдберг Е.Д. и др., 1997, 1999, 2001, 2007; Воробьев А.И., 2002].
Учитывая центральные и локальные механизмы регуляции кроветворения, представляется целесообразным подход к коррекции возникающих нарушений в системе крови, заключающийся в модуляции функций гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ), центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения и изменении уровней цитокинов путем введения их извне. С патогенетических позиций наиболее перспективными в этом направлении могут быть препараты на основе производных гликозаминогликанов (ГАГ), рекомбинантных форм цитокинов (колониестимулирующие факторы), а также препараты с ноотропным типом действия. Считается, что различные типы ГАГ тесно связаны с тем или иным ростком кроветворения. Кроме того, показано, что ГАГ являются составной частью клеточной мембраны, входят в состав гемопоэтинов, основного вещества соединительной ткани костного мозга и играют определенную роль в процессах пролиферации и дифференцировки клеток гемопоэтической ткани [Науменко О.И., 1992; Юшков Б.Г., Попов Г.К. и др., 1994; Захаров Ю.М., 1998; Jelkmann W., 1994; Egrie J.C., 2003; ., 2011]. Все это свидетельствует о возможном использовании препаратов на основе ГАГ для компенсации повреждений в системе крови при экстремальных воздействиях. Многие отечественные и зарубежные авторы указывают на способность препаратов на основе рекомбинантных форм цитокинов, в частности Г-КСФ, целенаправленно стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников гранулоцитопоэза, что позволило предложить их использование в качестве одного из методов рациональной терапии нейтропений [Попова Н.О., 2005; Дыгай А.М., Жданов В.В., 2010; Bronchud M.H. et al., 1988; Lord B.I. et al., 1989; Nicola N.A. et al., 1989; Williams M.E., Quesenberry P.J., 1992; Basu S. et al., 2002; Parvez T. et al., 2005; Roberts A.W., 2005]. Кроме того, данные о влиянии нейроэндокринной системы на кроветворение свидетельствуют о возможности применения в гематологической практике ноотропных препаратов, способных оптимизировать течение самых разнообразных физиологических процессов, в том числе, процессов клеточной пролиферации и дифференцировки через центральную нервную систему [Гольдберг Е.Д. и др., 1997, 2003, 2007].
Наблюдаемый в последнее время значительный рост частоты лейкопений различного генеза в клинической практике диктует необходимость разработки дифференцированных подходов к терапии нейтропений в зависимости от механизмов их развития, что обусловлено неодинаковыми повреждениями отдельных звеньев системы крови различными факторами. С другой стороны, предполагаемые и уже известные закономерности действия гемостимуляторов дают основания ожидать существенные различия в эффективности их применения в зависимости от патогенеза лейкопении. В то же время, многочисленные исследования показали, что удобными моделями для изучения механизмов развития миелосупрессивного синдрома и разработки методов стимуляции подавленного кроветворения являются цитостатические миелодепрессии.
Цель исследования. Изучить общие закономерности и особенности действия отдельных гемостимуляторов на гранулоцитарный росток кроветворения после введения различных по механизму действия цитостатических препаратов. Разработать патогенетически обоснованные подходы к коррекции лейкопений при цитостатических миелосупрессиях.
Задачи исследования:
1. Изучить механизмы восстановления гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом.
2. Оценить эффективность стимуляции процессов восстановления гранулоцитопоэза с помощью пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и D-глюкуроновой кислоты при миелосупрессиях, вызванных различными цитостатиками.
3. Исследовать механизмы реализации стимулирующего действия пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и D-глюкуроновой кислоты в отношении гранулоцитопоэза, регенерирующего после введения циклофосфана либо 5-фторурацила.
4. Патогенетически обосновать дифференцированное применение гемостимуляторов в зависимости от механизмов, лежащих в основе изменений, развивающихся в кроветворной ткани при применении различных цитостатических препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами гранулоцитарного ростка кроветворения при введении пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и D-глюкуроновой кислоты является неодинаковая чувствительность кроветворных элементов грануломоноцитопоэза и гемопоэзиндуцирующего микроокружения к действию цитостатиков и гемостимуляторов.
2. Более выраженный стимулирующий эффект изучаемых препаратов в отношении кроветворения, подавленного алкилирующим агентом, связан с менее токсичным действием циклофосфана на клеточные элементы кроветворного микроокружения по сравнению с антиметаболитом 5-фторурацилом.
3. В основе активирующего действия пантогематогена и глицирама на костномозговой гранулоцитопоэз в условиях цитостатических миелосупрессий лежит стимуляция продукции гуморальных регуляторов кроветворения клетками ГИМ и нормализация структурно-функциональной организации костного мозга. Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани под действием Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты при назначении антибластомных препаратов связано с непосредственным влиянием на функциональную активность пула коммитированных прекурсоров.
4. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений, возникающих со стороны гранулоцитарного ростка, являются Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция подавленного гранулоцитопоэза наблюдается под влиянием пантогематогена и глицирама.
Научная новизна. В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из гемостимуляторов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота) механизмов активации гранулоцитарного ростка кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции гранулоцитопоэза, в ответ на введение исследуемых препаратов на фоне различных по механизму действия цитостатиков (циклофосфан, 5-фторурацил).
Гемостимулирующий эффект пантогематогена обусловлен возрастанием функциональной активности стромальных элементов ГИМ и накоплением в кроветворной ткани прекурсоров грануломоноцитопоэза. В основе активации регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения глицирамом лежит ускорение процессов дифференцировки (в условиях введения циклофосфана) либо пролиферации (на фоне 5-фторурацила) прекурсоров грануломоноцитопоэза вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения (КСА от адгезирующих миелокариоцитов).
Гемостимулирующая активность Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты связана с непосредственным их эффектом в отношении кроветворных клеток-предшественников, а именно, повышением их функциональной активности. Г-КСФ ускорял выход гранулоцитомакрофагальных прекурсоров в дифференцировку либо увеличивал их пролиферативную активность, в том числе, благодаря повышению секреторной активности неприлипающих миелокариоцитов. D-глюкуроновая кислота в условиях введения циклофосфана ускоряла дифференцировку гранулоцитомакрофагальных клеток-предшественников за счет быстрой нормализации структурно-функциональной организации костного мозга. При миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, D-глюкуроновая кислота способствовала активации деления прекурсоров грануломоноцитопоэза, что связано с увеличением концентрации гуморальных регуляторов гемопоэза в сыворотке крови.
Впервые дана интегральная оценка гемостимулирующему эффекту исследуемых препаратов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота) в отношении гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом, с определением корреляционных взаимосвязей параметров.
Патогенетически обоснована эффективность применения Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом, пантогематогена и глицирама – в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита.
В работе впервые в сравнительном аспекте изучен гемостимулирующий эффект пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и D-глюкуроновой кислоты при миелосупрессиях, вызванных различными цитостатическими препаратами. Установлено, что выраженность эффектов гемостимуляторов на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения, вызванными антиметаболитом.
Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции лейкопений, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию применения гемостимуляторов для лечения лейкопений различного генеза.
Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).
В настоящее время разрешены к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации пантогематоген сухой (ОАО «Синтез», Курган), нейтростим (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск), глицирам (ООО ФК «Здоровье», Харьков).
Получены патенты: РФ № 2088249 от 27.08.1997 г. на изобретение “Гемостимулятор”, РФ № 2182007 от 10.06.2002 г. на “Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластических состояниях кроветворения”, РФ № 2270022 от 20.02.2006 г. на “Способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью”, РФ № 2332667 от 27.08.2008 г. на “Способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ”, РФ № 2399664 от 20.09.2010 г. на “Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток”. Получена приоритетная справка по заявке № 2010141630 от 04.07.2011 г. “Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток”.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, Х Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 2000, 2001, 2003), на I-м Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на 8-м минисимпозиуме по передовым научно-техническим технологиям (Япония, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН “Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины” (Новосибирск, 2000), на II-й объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск, 2002), на 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), на 3-й международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2003), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010), на Всероссийской конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, из них 23 – в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 79 таблицами (таблицы 56-79 размещены в приложении). Библиографический указатель включает 678 источников, из них 293 отечественных и 385 иностранных.
