Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Общие механизмы ишемического и реперфузионного повреждения сердца 12
1.2 Роль свободно-радикальных процессов в ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда 14
1.3 Механизмы гибели кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии 16
1.4 Современный взгляд на использование антиоксидантов для коррекции окислительного стресса 20
1.5 Фармакологические эффекты эмоксипина 22
1 .6 Возможность использования липосомальных препаратов при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда 25
Глава 2 Материал и методы исследования 29
2.Эксперименты на изолированном сердце 30
2.1.1 Схема эксперимента 30
2.1.2 Методика подготовки препарата изолированного сердца 31
2.1.3 Методика перфузии изолированного сердца методом Langendorff 32
2.1.4 Методика перфузии изолированного сердца методом Neely 33
2.1.5 Моделирование тотальной нормотермической ишемии 35
2.1.6 Методика оценки сократительной функции изолированного сердца 36
2.1.7 Характеристика регистрируемых параметров сократительной функции изолированного сердца 38
2.1.8 Методика оценки насосной функции изолированного сердца 39
2.1.9 Методика измерения коронарного протока изолированного сердца 40
2.2 Фармакологические агенты, используемые при выполнении исследования 40
2.2.1 Приготовление липосом 41
2.2.2Распределение животных по сериям экспериментов 42
2.3Биохимические методы исследования 43
2.3.1 Определение активности ферментов-маркеров повреждения миокарда 43
2.3.20пределение уровня свободнорадикальных процессов в миокарде 45
2.4Морфологический анализ кардиомиоцитов методом TUNEL 47
2.5Иммуноферментный анализ содержания оксида азота 49
2.6Статистическая обработка результатов 50
Глава 3 Результаты и обсуждение 51
3.1 Влияние введения «пустых» липосом 50 и 100 нм на ишемизированный и реперфузируемый миокард 51
3.2 Влияние введения липосом, содержащих 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл эмоксипина, на толерантность сердца к воздействию ишемии и реперфузии 56
3.2.1 Степень повреждения миокарда при реперфузии в условиях кардиопротекции 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формой эмоксипина 56
3.2.2 Антиоксидантные системы миокарда при тотальной ишемии и реперфузии при введении липосом, содержащих 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл эмоксипина 64
3.2.3 Коронарный кровоток ишемизированного миокарда в период реперфузии при введении 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина 68
3.2.3.1 Активность эндотелиальной NO-синтазы (по уровню стабильных метаболитов N0) после введения 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина при тотальной нормотермической ишемии и реперфузии 71
3.2.3.2 Взаимосвязь выраженности свободнорадикальных процессов в миокарде, уровня NO и уровня коронарного протока реперфузируемого миокарда при введении липосомальной формы эмоксипина 74
3.2.4Сократительная функция миокарда в условиях тотальной нормотермической ишемии и реперфузии после введения 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина 77
3.2.5 Насосная функция миокарда крыс в условиях тотальной нормотермической ишемии и реперфузии после введения 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина 83
Глава 4 Заключение 87
Выводы 93
Список литературы 95
- Механизмы гибели кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии
- Возможность использования липосомальных препаратов при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда
- Степень повреждения миокарда при реперфузии в условиях кардиопротекции 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формой эмоксипина
- Насосная функция миокарда крыс в условиях тотальной нормотермической ишемии и реперфузии после введения 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина
Введение к работе
Актуальность работы. Ишемическая болезнь сердца является одной из главных причин инвалидизации и смертности населения развитых стран. Одним из основных методов лечения ишемической болезни сердца является проведение шунтирующих операций на сердце в условиях искусственного кровообращения. Однако тотальная ишемия и реоксигенация (реперфузия), сопровождающие искусственное кровообращение, провоцируют повреждения эндотелия коронарных сосудов и клеток миокарда, что может приводить к таким взаимосвязанным и клинически значимым изменениям, как гибель кардиомиоцитов, неполное восстановление коронарного кровотока, «станни-рование» миокарда и в конечном счете нарушение сократимости (сократительной дисфункции) (Turer А. Т. et al, 2010). В связи с этим особое значение приобретает эффективность интраоперационной защиты миокарда.
Поскольку в развитии ишемического и реперфузионного повреждения миокарда особую роль играет активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) на фоне снижения активности защитных антиоксидантных ферментных систем (окислительный стресс) (Schulz R. et al., 2004; Меньшикова Е. Б. и др., 2008), нивелирование дисбаланса антиоксидантной системы является одним из направлений возможного терапевтического воздействия. Патогенетически обоснованным в данном случае представляется использование средств фармакологической коррекции окислительного стресса - экзогенных антиоксидантов (Besse S. et al, 2006).
Многочисленные исследования в области антиоксидантной защиты не позволяют сделать однозначные выводы о целесообразности применения антиоксидантов при заболеваниях, сопровождающихся окислительным стрессом (Holger К. et al, 2004; Seo М. Y. et al, 2002). Во многих экспериментальных исследованиях была продемонстрирована эффективность использования антиоксидантных препаратов при заболеваниях, в которых окислительный стресс играет значительную патогенетическую роль (Неверов И. В., 2001; Kaikkonen J. et al., 2001;). Однако в ряде исследований была установлена не только неэффективность применяемых антиоксидантов, но и их способность оказывать негативный прооксидантный эффект (Ланкин В. 3. и др., 1999; Dyatlov V. A. et al., 1998; Ohshima Н. et al., 1998). Поскольку определяющим фактором проявления антиоксидантами прооксидантного эффекта является концентрация самого антиоксиданта (Bouayed, J. and Bohn, 2010), одной из возможных причин неоднозначности полученных результатов может быть неправильный выбор величин вводимых доз антиоксиданта.
Такая ситуация диктует необходимость проведения дальнейших исследований, направленных на изучение механизмов реализации кардиопротективного эффекта антиоксидантов и разработку их новых лекарственных форм, обеспечивающих возможность снижения терапевтически активных доз с параллельным нивелированием побочных эффектов.
В ряде отечественных экспериментальных и клинических исследований продемонстрирована высокая эффективность препаратов производных 3-оксипиридинов для снижения выраженности окислительного стресса, в том
числе при ишемии-реперфузии миокарда (Танашян М. М. и др., 2006; Сыренский А. В. и др., 2008; Поллумиксов В. Ю. и др., 2004; Голиков А. П., 2005). Классическим представителем производных 3-оксипиридина является препарат эмоксипин, разрешенный к использованию в кардиологической практике при остром инфаркте миокарда для профилактики синдрома реперфузии и при нестабильной стенокардии (Машковский М. Д., 2000; Приказ минздравмедпрома РФ, 2007; Государственный реестр лекарственных средств, 2004). Эмоксипин обладает широким спектром биологического действия и выраженной антиоксидантной активностью, подтвержденной рядом научных работ (Мезен Н. П., 2006; Голиков А. П. и др., 1990; Афанасьев С. А. и др., 1994).
В качестве возможного способа его использования можно рассматривать целенаправленную доставку эмоксипина в виде липосомальной формы к очагам, пораженным в результате ишемии-реперфузии (Сейфулла Р. Д., 2010; Landi-Librandi А. P. et al., 2011; Zacharias Е. Suntres, 2011; Юлиш Е. И. и др., 2008).
Липосомальная форма лекарственных препаратов обладает рядом фармакологических преимуществ перед свободными формами лекарств. Доказано, что включение лекарственного вещества в состав липосом позволяет увеличить его биодоступность за счет направленного транспорта к участкам, нуждающимся в фармакологической коррекции и внутриклеточной доставке, что позволяет снижать дозу препарата с сохранением его терапевтического эффекта (Zacharias Е. Suntres, 2011; Song Н. et al., 2006; Жигальцев И. В. и др., 1999). Кроме того, известно, что липиды, входящие в состав липосом, могут замещать поврежденные в результате ишемии и реперфузии эссенциальные фосфолипиды мембран, оказывая тем самым протективный эффект (Ипатова О. М., 2005).
Цель исследования: изучить эффективность применения липосомальной формы эмоксипина (производного 3-оксипиридина) в экспериментальной терапии ишемии и реперфузии миокарда.
Задачи исследования:
-
Определить оптимальный размер «пустых» липосом для направленного транспорта производных 3-оксипиридина (на примере эмоксипина) и реализации кардиопротективного эффекта при тотальной нормотермической ишемии и реперфузии миокарда на модели изолированного сердца крысы.
-
Оценить степень повреждения миокарда в реперфузионном периоде тотальной нормотермической ишемии на фоне интракоронарного введения липосомальной формы эмоксипина.
-
Оценить активность антиоксидантной системы миокарда в реперфузионном периоде тотальной нормотермической ишемии в условиях кардиопротекции липосомальной формой эмоксипина.
-
Изучить влияние липосомальной формы эмоксипина на восстановление коронарного кровотока в реперфузионном периоде тотальной нормотермической ишемии.
-
Изучить влияние липосомальной формы эмоксипина на восстановление сократительной и насосной функций миокарда в условиях тотальной нормотермической ишемии и реперфузии.
Новизна исследования
Установлены основные механизмы формирования толерантности миокарда к повреждающему воздействию ишемии и реперфузии в условиях кардиопротекции липосомальной формой эмоксипина.
Оценена зависимость кардиопротективного эффекта от дозы антиоксиданта в составе липосом на модели изолированного сердца крысы в условиях ишемии и реперфузии.
Доказана возможность использования липосомальной формы эмоксипина для коррекции ишемического и реперфузионного повреждения миокарда на модели изолированного сердца крысы.
Практическая значимость работы
Определен оптимальный размер «пустых» липосом (не более 50 нм) для оказания кардиопротективного эффекта и обеспечения направленного транспорта эмоксипина в миокард, находящийся в условиях тотальной нормотермической ишемии и реперфузии.
Установлено положительное влияние липосомальной формы эмоксипина в отношении ишемических и реперфузионных повреждений миокарда.
В результате исследования определена оптимальная лекарственная форма эмоксипина для оказания кардиопротективного эффекта в отношении ишемизированного и реперфузируемого миокарда.
Полученные результаты могут явиться основой для разработки протоколов применения липосомальной формы эмоксипина, направленных на коррекцию ишемических и реперфузионных повреждений миокарда.
Положения, выносимые на защиту:
-
Интракоронарное введение липосомальной формы эмоксипина в период ишемии приводит к повышению резистентности миокарда к повреждающему действию ишемии и реперфузии. Наиболее эффективно использование липосом размером не более 50 нм.
-
Липосомальная форма эмоксипина в низкой концентрации (0,1 мг/мл) обладает антиоксидантным эффектом, в то время как более высокая (0,25 мг/мл) предположительно оказывает незначительное прооксидантное действие. При применении препарата в концентрации 0,25 мг/мл гибель кардиомиоцитов в период реперфузии происходит преимущественно за счет некроза. Введение меньших концентраций липосомальной формы эмоксипина (0,1 мг/мл) способствует переключению механизма гибели кардиомиоцитов с некроза на апоптоз.
-
В основе кардиопротективного эффекта 0,1 мг/мл липосомальной формы эмоксипина лежит снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов. Восстановление функционирования миокарда на фоне введения липосомальной формы 0,1 мг/мл эмоксипина происходит за счет снижения влияния свободных радикалов на мембраны кардиомиоцитов, что обеспечивает их структурную целостность, и эндотелиальной NO-синтазы, что обеспечивает восстановление коронарного кровотока в периоде реперфузии.
Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 15 работ в журналах, материалах научных съездов и конференций (из них
5 статей в журналах, рецензируемых ВАК). Список прилагается.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Второй научной сессии молодых ученых «Наука - практике» (Кемерово, 2012 г.); на VIII международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 2012 г.); на IV съезде кардиологов Сибирского федерального округа «Сердечно-сосудистые заболевания: от первичной профилактики до высоких технологий в повседневной практике» (Кемерово, 2011 г.); на II Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2011 г.); на III Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2012 г.).
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста. Диссертация содержит 9 таблиц, 11 рисунков. Указатель литературы включает 174 работы (из них 103 - зарубежные).
Механизмы гибели кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии
Согласно современным представлениям, на сегодняшний день выделяют два основных механизма клеточной гибели - запрограммированная клеточная гибель (апоптоз) и некроз.
Некроз (от греч. vsKpoq - мертвый) - это патологический процесс, выражающийся в местной гибели ткани в живом организме в результате какого либо экзо- или эндогенного ее повреждения. Данный процесс вызывается значительными повреждающими факторами и является неуправляемым процессом, как правило, не поддающимся фармакологической коррекции (Galluzzi L. et al., 2007; Golstein P. et al., 2006). При этом критическим моментом, определяющим необратимость утраты жизнедеятельности клетки, является утрата целостности плазматической мембраны (Galluzzi L. et al., 2007). В патогенезе некроза особое значение принадлежит таким факторам, как осмотический лизис, нарушение кальциевого гомеостаза и активные формы кислорода (Зенков Н. К. и др., 2001; Golstein P. et al., 2006). При этом последние являются одной из важнейших причин разрушения плазматической мембраны и органелл клетки с ее последующей гибелью (Бережное А. В. и др., 2009; Golstein P. et al., 2006; Proskuryakov S. Y. et al., 2003).
В целом некроз проявляется в набухании, денатурации и коагуляции цитоплазматических белков, разрушении клеточных органелл и в конечном счете всей клетки (Golstein P. et al., 2006; Proskuryakov S. Y. et al., 2003).
Апоптбз (греч. албтпанзц - опадание листьев) - программируемая клеточная смерть, регулируемый процесс самоликвидации, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Важной особенностью апоптоза является его регулируемость (Владимирская Е. Б., 2002).
Апоптотические процессы энергозависимы, нуждаются в АТФ, ионах Са2+ и синтезе некоторых белков. Для реализации данного механизма гибели необходим не только достаточный уровень АТФ, но и целостность плазматической мембраны.
Выделяются два основных пути индукции апоптоза: рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь.
Рецепторный путь активации апоптоза Процесс апоптоза осуществляется с взаимодействием специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (англ. tumor necrosis factor receptor или кратко TNFR - «рецептор фактора некроза опухолей»). Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами - пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз - с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд - рецептор - адаптер - эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Ключевая роль в дальнейшем каскаде отводится эффекторной каспазе 3, что в результате приводит к активации эндонуклеаз, фрагментриующих ДНК и дальнейшему лизису клетки.
Митохондриальный путь активации апоптоза
Митохондриальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки (Javadov S. et al., 2007). Высвобождение апоптогенных белков, предположительно, может осуществляться двумя путями: за счет разрыва митохондриальной мембраны или же путем открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий. Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала (Kroemer G., 2002; Foster D. В. et al., 2009). Раскрытие пор обусловлено истощением клеток восстановленным глутатионом; образованием активных форм кислорода; разобщением окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличением содержания Са2+ в цитоплазме; истощением митохондриального пула АТФ и др. При этом собственно повышение уровня кальция в цитозоле является сильным индуктором апоптоза (Головкин А. С. и др., 2010; Hausenloy D. J. et al., 2003; PerrelliM.-G.etal.,2011).
Итогом программируемой клеточной гибели вне зависимости от изначального инициирующего воздействия является деградация клетки путем фрагментации на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной.
Определенный вклад в активацию апоптоза в миокарде могут вносить активные формы кислорода (Залесский В. Н. и др., 2006; Бра М. и др., 2005; Li W. G. et al., 1998; Oskarsson H. J. et al., 2000; Perrelli M.-G. et al., 2011; Viatour P. et al., 2005; Han H. et al., 2004). При этом их влияние на про- и антиапоптотические мишени и механизмы осуществляется как непосредственно, так и через внутриклеточные редокс-зависимые сигналпередающие системы (Бра М. и др., 2005).
Основной механизм гибели кардиомиоцитов в периоде острой ишемии -некроз (из-за энергодефицита), в то время как в реперфузионном периоде превалирует энергозатратный процесс апоптотической гибели (при ресинтезе АТФ) (Kroemer G., 2002; Gottlieb R. A. et al., 1994; Ho F. Y. et al., 2006). Это связано с тем, что восстановление кровотока приводит к повышению энергетического потенциала кардиомиоцитов, вследствие чего некоторые клетки получают возможность претерпевать апоптоз вместо некроза, что более выгодно с точки зрения минимизации повреждения для органа в целом.
Таким образом, уровень АТФ и целостность мембраны являются решающими факторами, переключающими программы клеточной смерти. При повреждении мембраны и (или) низком уровне АТФ клетки погибают путем некроза, в противном случае вероятен апоптоз (Leist М. et al., 1997).
Существует предположение, что при повреждающем воздействии на клетку запускаются одновременно как механизмы некротической и апоптотической гибели, так и защитные процессы (системы антиоксидантной защиты и поддержание ионного гомеостаза, мобилизация гликолиза и т.д.) (Узденский А. Б., 2010). Тогда механизм, по которому будет осуществляться дальнейшая гибель клетки, будет определяться не только силой (выраженностью) повреждающего воздействия, но и физиологическим и биохимическим состоянием клеток (Fink S. L. et al., 2005).
В качестве фармакологических модуляторов в данном случае могут выступать препараты метаболической терапии, антагонисты кальция, Р-блокаторы и антиоксиданты.
Возможность использования липосомальных препаратов при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда
Развитие науки и технологий на сегодняшний день позволяет не только осуществлять поиск и создание новых лекарственных средств, но и совершенствовать уже используемые лекарственные препараты. Одним из таких подходов является создание транспортной системы, позволяющей осуществлять направленный транспорт лекарственного вещества к поврежденным органам и клеткам (Юлиш Е. И. и др., 2008; Afergan Е. et al., 2010; Yih Т. С, 2006). В качестве такой системы наиболее часто используют липосомы (Torchilin V. Р., 2005; Bowey К. et al., 2012).
Липосомы (от греч. lipos - жир и soma - тело) - это сферические полые частицы, оболочка которых состоит из молекул тех же природных фосфолипидов, что и клеточные мембраны. Пустующее пространство внутри липосом может быть заполнено любыми веществами, без ограничения их свойств и химической природы (Torchilin V. Р., 2005). Сами липосомы нетоксичны, биодеградируемы, способны активно реагировать с мембранами клеток и за счет этого оказывать в их отношении протективный эффект. В ряде исследований был доказан мембранопротекторный эффект липосомальных фосфолипидов (Зубаренко А. В., 1992; Третьякова О. С. и др., 2011).
Однако несмотря на многочисленные исследования, до сих пор остается до конца невыясненным вопрос о взаимодействии липосом с клетками, характер которого может принимать различные формы. Это может быть адсорбция липосом на клеточной поверхности, поглощение клеткой (эндоцитоз) с внутриклеточной доставкой содержимого липосом, слияние с клеточной мембраной и обмен фосфолипидами (Ипатова О. М., 2005). Одним из основных факторов, определяющих характер взаимодействия липосом с клетками, является размер липосом. Липосомы малого размера (25—40 нм) способны проникать через поры клеточной мембраны, тогда как для крупных размеров частиц (более 100 нм) это является невозможным (Каплун А. П. и др., 1999).
Липосомальная форма лекарственных препаратов обладает целым рядом преимуществ перед свободными формами лекарств, среди которых наиболее значимыми являются:
адресная доставка лекарственного вещества, ассоциированного с липосомои, к участкам, нуждающимся в фармакологической коррекции.
Основой для осуществления направленной доставки липосомальной формы лекарственного вещества является соотношение размеров липосом и диаметра пор капилляров. Поскольку размер липосом больше диаметра пор капилляров, их объем распределения ограничен компартментом введения. Однако при различных патологических состояниях поры могут расширяться, что создает условия для выхода липосом за их пределы (Dvir Т. et al., 2011).
С одной стороны, это обеспечивает пассивный направленный транспорт лекарственного вещества, ассоциированного с липосомои, с другой - позволяет снизить токсичность препарата, заключенного в состав липосомы. Таким образом, направленная доставка липосомальной формы лекарственного вещества может реализоваться за счет целенаправленного подбора размеров наночастиц (Bowey К. et al., 2012);
повышение биодоступности лекарственного препарата при включении его в состав липосом.
Было установлено, что чем меньше размер наночастиц, тем более выражен их оптимизирующий эффект на фармакокинетику лекарственного вещества и эффективность проникновения его в органы и ткани (Thassu D., 2007). Описанное селективное накопление фармакологического агента в поврежденных участках позволяет значительно снизить терапевтически активную дозу лекарственного вещества с возможностью нивелирования побочных эффектов (Barenholz Y., 2012; Bowey К. et al., 2012; Gregoriadis G., 1989; Lasic D. D. et al., 1995; Lammers T. et al., 2010; Song H. et al., 2006).
В связи с очевидными преимуществами липосомальной формы лекарственных препаратов перед свободными формами лекарств, спектр исследований липосомальных форм лекарственных веществ постоянно расширяется.
В последнее время большое количество публикаций посвящено использованию липосом при ишемических повреждениях органов (Мухамадияров Р. А. и др., 2006; Радионов И. А., 2008).
Однако в литературе представлены лишь единичные работы, посвященные изучению влияния липосомальной формы лекарственных веществ на ишемизированный и реперфузируемый миокард (Мухамадияров Р. А. и др., 2012; Zhang Н. et al., 2012; Ruiz-Esparza G. U. et al., 2013).
Тем не менее результаты этих исследований свидетельствуют о способности липосом снижать степень выраженности ишемических и реперфузионных повреждений миокарда (Мухамадияров Р. А. и др., 2012; Mukhamadiyarov R. A. et al., 2012; Третьякова О. С. и др., 2011).
Малочисленность подобного рода исследований на фоне неизменно возрастающей значимости проблемы защиты ишемизированного и репер-фузируемого миокарда определяет необходимость проведения дальнейших исследований в данном направлении.
Таким образом, вопрос адекватной защиты ишемизированного и реперфузируемого миокарда на сегодняшний день остается открытым. Одним из способов повышения резистентности миокарда к ишемическим и реперфу-зионным воздействиям является использование экзогенных антиоксидантов (например, производных 3-оксипиридина). Однако, несмотря на привлекательность идеи антиоксидантной защиты реперфузируемого миокарда, существует ряд проблем. В частности, до сих пор дискутируется вопрос подбора безопасных и эффективных доз антиоксидантов, поскольку препараты данного класса способны проявлять прооксидантный эффект при превышении их определенной пороговой концентрации. Решением данной проблемы может явиться использование антиоксидантов в составе липосом. Известно, что включение фармакологических агентов в состав липосом позволяет снижать эффективную дозу лекарственных веществ с нивелированием побочных эффектов. Таким образом, включение производных 3-оксипиридина в состав липосом можно рассматривать как перспективный подход к коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда. Однако необходимы исследования, направленные на изучение механизмов реализации протективного эффекта липосомальной формы эмоксипина (как классического представителя группы 3-оксипиридинов) в отношении ишемизированного и реперфузируемого миокарда и определение на основании полученных результатов возможности использования данной формы антиоксиданта для коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда.
Степень повреждения миокарда при реперфузии в условиях кардиопротекции 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формой эмоксипина
Согласно современным представлениям, что существуют две основные формы гибели клеток - апоптоз и некроз. Под апоптозом понимают активную, требующую затрат энергии форму гибели клеток, которая является результатом реализации ее генетической программы или ответом на внешние сигналы. При апоптозе клетка сжимается, а внутриклеточные белки не выбрасываются в окружающую среду. Некроз представляет собой нерегулируемый патологический процесс, при котором клетка увеличивается в объеме, ее внешняя мембрана разрывается с высвобождением внутриклеточных белков во внешнюю среду.
Морфологически апоптоз характеризуется конденсацией ядра с образованием «апоптозных телец». При апоптотической гибели клетки наблюдаются разрывы ДНК с образованием сначала крупных, затем мелких фрагментов, а при некрозе отмечается ее неупорядоченная деградация (Ярилин А. А., 2001).
Известно, что при некротическом поражении часть кардиальных ферментов поступает из поврежденных клеток миокарда в кровь, причем гиперферментемия обычно тесно коррелирует с выраженностью некротического поражения. В связи с этим для оценки степени ишемического и реперфузионного повреждения миокарда используют определение миокардиальных маркеров цитолиза клеток -ЛДГ и КФК МБ.
В настоящем исследовании степень повреждения кардиомиоцитов оценивали по уровню вышеуказанных ферментативных маркеров в оттекающем от сердца перфузате. Для дополнительной оценки степени повреждения кардиомиоцитов использовали морфологическую оценку их состояния с помощью TUNEL-анализа, позволяющего выявлять в ядрах клеток наличие фрагментированной ДНК.
Влияние изучаемых препаратов на динамику показателей активности ферментов-маркеров повреждения миокарда отражено в Таблице 2. Исходно уровни определяемых индикаторов цитолиза клеток миокарда между исследуемыми группами статистически не различались (р 0,05). После тотальной 30-минутной нормотермической ишемии и последующего возобновления коронарной циркуляции в сердцах группы ФР отмечалось выраженное повреждение сарколеммы кардиомиоцитов. Доказательством тому служило значительное увеличение активности ЛДГ (в 6 раз) и КФК МБ (в 7 раз) по отношению к исходным значениям (р 0,01).
Параллельное исследование микропрепаратов миокарда этой группы, окрашенных методом TUNEL, подтвердило выраженное повреждение клеток. Так, на микрофотоснимках миокарда группы ФР во всех полях зрения структура кардиомиоцитов не визуализировалась, отмечалась фрагментация клеток и деградация их ядер (Рисунок 6А). Миокард выглядел разводокненным за счет выраженной дискомплексации миофибрилл и значительного расширения межклеточных пространств. По-видимому, тотальная нормотермическая 30-минутная ишемия и последующая реперфузия оказали значительное повреждающее действие на миокард, не позволявшее визуализировать гистологическую структуру миокарда с помощью TUNEL-метода.
В то же время гипоперфузия ЭМЛ, ЭМЛ1 и ЭМС обеспечивала существенное снижение повреждающих влияний ишемии и реперфузии на кардиомиоциты. Об этом свидетельствовали более низкие показатели активности ферментов-маркеров повреждения миокарда в этих группах по сравнению с ФР (р 0,01) (Таблица 2).
В группе ЭМЛ уровень миокардиальных маркеров в реперфузионный период был достоверно ниже (р 0,01), чем в группе ФР, однако достоверно выше (р 0,05), чем в группе ЭМС. Так, в группе ЭМЛ в реперфузионный период уровень КФК МБ составил 693,0 (680,0-700,0) МЕ/л, в то время как в группе ЭМС данный показатель оказался 409,0 (390,0-451,0) МЕ/л. Аналогичная тенденция отмечалась и в отношении ЛДГ, уровень которого в группе ЭМЛ был выше в 1,2 раза по сравнению с ЭМС (р 0,05).
При снижении концентрации эмоксипина в составе липосом (ЭМЛ1) наблюдалось статистически достоверное (р 0,05) снижение реперфузионного выброса ЛДГ и КФК МБ по сравнению с группами ЭМЛ и ЭМС (Таблица 2).
Так, активность ЛДГ в группе ЭМЛ1 составила 809,0 (759,0-851,0) МЕ/л, в то время как в группе ЭМЛ этот показатель оказался в 1,4 раза выше (1145,0 (983,5-1200,0) МЕ/л), (р 0,01). Аналогичная тенденция в этих группах наблюдалась и в отношении КФК МБ (этот показатель в группе ЭМЛ был выше в 2,4 раза по сравнению с ЭМЛ1, (р 0,01)). Кроме того, в группе ЭМЛ1 наблюдался более низкий реперфузионный выброс КФК МБ и ЛДГ по сравнению с группой ЭМС (р 0,01 для КФК МБ и р 0,05 для ЛДГ).
Результаты TUNEL-анализа миокарда групп ЭМЛ, ЭМЛ1 и ЭМС также свидетельствовали о меньшей степени повреждения кардиомиоцитов этих групп по сравнению с группой ФР. На микропрепаратах групп ЭМЛ и ЭМС наблюдались как признаки некроза, так и признаки апоптотической гибели кардиомиоцитов. Однако между этими группами были выявлены существенные различия в количестве и структуре ядер TUNEL-позитивных клеток. Так, в группе ЭМС по сравнению с ЭМЛ апоптотически измененные кардиомиоциты преобладали над клетками, подвергшимися некротической гибели (Рисунок 6В, С).
Морфологическая картина миокарда группы ЭМЛ1, окрашенного методом TUNEL, существенно не отличалась от группы ЭМС. На микропрепаратах этой группы регистрировались как признаки некроза, так и признаки апоптоза кардиомиоцитов (Рисунок 6D). При этом в группе ЭМЛ1 по сравнению с ЭМЛ кардиомиоциты, подвергшиеся апоптозу, также преобладали над клетками, подвергшимися некротической гибели (Рисунок 6В, D, Таблица 3). Полученные в ходе биохимического и морфологического анализа данные свидетельствуют о том, что 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина оказывают цитопротекторный эффект в условиях ишемии и реперфузии миокарда. Данный эффект подтверждается снижением реперфузионного выброса КФК-МБ и ЛДГ и результатами TUNEL-анализа. При этом меньшие концентрации липосомальной формы эмоксипина (0,1 мг/мл) обладали максимальным протективным эффектом. Кроме того, было отмечено, что при условии равных дозировок эмоксипин в свободной форме оказывал более выраженный эффект по сравнению с эмоксипином в составе липосом. Данный факт позволил предположить, что включение эмоксипина в состав липосом способствовало увеличению биодоступности антиоксиданта за счет его направленного транспорта к поврежденным в результате ишемии и реперфузии участкам миокарда. Это привело к увеличению концентрации эмоксипина в кардиомиоцитах, что, в свою очередь, могло создать условия для проявления им прооксидантного эффекта, подробно описанного в литературе для различных антиоксидантов (Сыренский А. В. и др., 2008; Ohshima Н. et al., 1998; Walke М. et al., 1998). Кроме того, наше предположение основывалось на известных литературных данных о дозозависимости проявляемых производными 3-оксипиридинов эффектов (Смирнов Л. Д. и др., 1989) и доказаной роли окислительного стресса в развитии апоптоза и некроза (Залесский В. Н. и др., 2006; Maulik N. et al, 2000; Ferrari R. et al., 1998).
Насосная функция миокарда крыс в условиях тотальной нормотермической ишемии и реперфузии после введения 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл липосомальной формы эмоксипина
Основная функция сердца - насосная, которая направлена на обеспечение тканей оптимальным для их метаболических потребностей количеством крови. При этом состояние насосной функции сердца зависит от состояния самого миокарда (уровня коронарного кровотока, степени метаболических нарушений и т.д.).
На следующем этапе нашего исследования изучали насосную функцию изолированного сердца в условиях кардиопротекции 0,1 мг/мл и 0,25 мг/мл эмоксипина в составе липосом.
Доишемические значения величины сердечного выброса во всех группах были близки по значению (р 0,05). 30-минутная нормотермическая ишемия и реперфузия оказали значительное негативное влияние на насосную функцию изолированных сердец. Так, в период реперфузии сердца группы ФР оказались не способны к выполнению насосной функции, что свидетельствует о тяжелой миокардиальной недостаточности (Таблица 9).
В то же время в группах ЭМЛ, ЭМС и ЭМЛ1 изолированные сердца демонстрировали частичное восстановление насосной функции, при этом между этими группами были выявлены значительные различия. На 15-й минуте реперфузии максимальный сердечный выброс был отмечен в группах ЭМЛ1 и ЭМС (4,0 (3,0-5,0) и 4,0 (3,0-4,0) мл соответственно (р 0,05). Сердечный выброс в группе ЭМЛ оказался достоверно ниже, чем в группах ЭМС и ЭМЛ1 (р 0,05).
На протяжении реперфузионного периода во всех исследуемых группах наблюдалось значительное угнетение насосной функции (Таблица 9). Так, к окончанию реперфузии (30-я минута) объем сердечного выброса в группах ЭМЛ и ЭМС достоверно не различался (р 0,05) и составил 1,0 (0-1,0) мл и 1,0 (1,0-2,0) мл соответственно. Максимальный объем сердечного выброса на момент окончания реперфузии демонстрировали сердца на фоне введения ЭМЛ1 (2,0 (2,0-3,0) мл).
Описанное снижение насосной функции изолированных сердец на протяжении всего периода реперфузии обусловлено усугублением реперфузионных повреждений миокарда за счет свободного кислорода, поступающего в миокард при реоксигенации. Усиление процессов перекисного окисления липидов приводит к нарушению процессов фосфорилирования, транспорта и утилизации АТФ, приводя в конечном счете к нарушениям процессов сокращения и расслабления миокарда.
Необходимо отметить тот факт, что максимальное снижение сердечного выброса на протяжении всего периода реперфузии отмечено в группе ЭМС (Таблица 9). Меньшее снижение насосной функции в группах ЭМЛ и ЭМЛ1, возможно, обусловлено сочетанным защитным эффектом липосомальных фосфолипидов и антиоксиданта.
Способность сердец к выполнению насосной функции косвенно свидетельствует о сохранности метаболических процессов в клетках, механизма транспорта ионов (прежде всего Са2+) через мембрану кардиомиоцитов и саркоплазматического ретикулума, процессов окислительного фосфорилирования. В конечном счете, это подтверждает лучшую функциональную и структурную сохранность мембран кардиомиоцитов и сократительного аппарата сердечной мышцы в целом.
Таким образом, гипоперфузия липосомальной формы эмоксипина в период ишемии обеспечивает частичное восстановление насосной функции миокарда в реперфузионный период. Максимальному восстановлению насосной функции изолированного сердца в период реперфузии способствует введение 0,1 мг/мл липосомальной формы эмоксипина (ЭМЛ1).
