Содержание к диссертации
Введение
1. Теоретические основания использования акупунктуры в комплексной адьювантной терапии злокачественных новообразований 14
1.1. Применение акупунктуры в онкологии 14
1.2. Иммунотропные эффекты акупунктуры 16
1.3. Причины нарушений рефлекторной деятельности при канцерогенезе .18
1.4. Значение нэйроэндокринной оси в механизме противоопухолевой иммунорезистентности 23
1.5. Стресс и опухолевый рост, стресслимитирующее действие акупунктуры 30
1.5.1. Акупунктурная модуляция стресслимитирующих механизмов нервной системы 33
1.5.2. Эндогенная опиоидная система (ЭОС) 36
1.6. Нарушения тканевых и клеточных защитных систем при канцерогенезе 40
1.7. Нарушения биоритмов и электрофизиологических процессов организма при канцерогенезе 44
2. Иммунотерапия неопластических заболеваний 46
2.1. Основные звенья противоопухолевой иммунорезистентности 46
2.2. Причины ускользания опухоли из-под иммуного надзора 50
2.3. Фитотерапия в коррекции недостаточности противоопухолевого иммунитета 51
2.4. Фитотерапия в комплексной терапии злокачественных новообразований 53
2.5. Противоопухолевая и иммуномодулирующая активность мурамилпептидов 57
Результаты исследования 72
1. Экспериментальная иглорефлексотерапия опухолей 72
1.1. Изучение общего и местного действия иглорефлексотерапии паранихиальных точек на опухолевый процесс на модели меланомы В16 72
1.2. Исследование роли эндогенной опиоидной системы в механизме противопухолевого действия акупунктуры паранихиальных точек 76
1.3. Противоопухолевая активность комбинации акупунктуры и циклофосфамида 80
2. Экспериментальная фитотерапия опухолей 83
3. В-Адамантилгликозид-МДП в иммунотерапии опухолей 86
3.1. Экспериментальная терапия лимфомы EL-4 88
3.2. Экспериментальная иммунотерапия меланомы В-16 91
3.3. Экспериментальная иммунотерапия карциномы легких Льюиса 96
Обсуждение 98
Выводы 113
Список литературы 115
- Причины нарушений рефлекторной деятельности при канцерогенезе
- Противоопухолевая и иммуномодулирующая активность мурамилпептидов
- Исследование роли эндогенной опиоидной системы в механизме противопухолевого действия акупунктуры паранихиальных точек
- Экспериментальная иммунотерапия меланомы В-16
Причины нарушений рефлекторной деятельности при канцерогенезе
Нервная система является главным посредником эффектов рефлексотерапии. Поэтому рассматривая возможность использования ее при раке необходимо принимать во внимание состояние центрального и периферического отделов НС. При воздействии канцерогенных факторов на организм периферические информационные и регуляторные механизмы нарушаются гораздо раньше и более значительно, чем центральные (Лебединская СИ., 1958). В условиях злокачественного роста элементы афферентного звена первыми реагируют на возникновение и развитие патологического процесса. Наиболее информативными в оценке афферентации оказались электрофизиологические исследования, в которых удалось установить резкое уменьшение амплитуды и частоты афферентных сигналов, следующих из очага злокачественного новообразования (Сиротин Б.З., 1968). Опыты по регистрации биоэлектрической активности в афферентных волокнах желудка, удаленного по поводу рака, показали, что в одной трети случаев обнаруживалась низкая активность афферентной импульсации, а в остальных препаратах она полностью отсутствовала. Более того, отсутствие нейрональной активности наблюдалось при отведении от нервов, расположенных не только вблизи локализации опухоли, но и вдали от нее (Сиротин Б.З., 1968). При исследованиях больных раком желудка отмечалась функциональная десимпатизация тканей. Реакция на адреналин у таких больных была извращена: вместо гипертензивного действия, имеющего место при введении адреналина здоровым людям, наблюдался гипотензивный эффект. По мнению В. С. Шевелевой, нарушение тонуса САС является показателем «фактора риска», свидетельствующего о возможности возникновения злокачественных опухолей (Шевелева B.C., 1974). Д.П. Билибин с соавт. в своей монографии приходит к выводу, что: «...во внутренних органах заложен и при определенных состояниях (начальной стадии патологических процессов) активно проявляется физиологический механизм блокирования висцеральной афферентации» и далее: «...наивно полагать, что блокирование висцеральной афферентации осуществляется только на уровне повреждаемого органа, без какого-либо участия вышележащих регуляционных структур» [1998]. В их число входят соответствующие сегменты спинного мозга, ядра блуждающих нервов, гипоталамус и корковые центры регуляции висцеральных афферентных потоков. Блокада спинального афферентного потока возможна на уровне ствола мозга, в ретикулярной формации, а также выше, в сером околоводопроводном веществе, ядрах таламуса. Результаты анализа амплитуды и частоты характеристик рефлекторного ответа в спинном мозге по отношению к локализации опухоли и ее размерам свидетельствуют об угнетении активности интернейронного аппарата спинного мозга, ухудшении воспроизведения промежуточными нейронами высокочастотного раздражения и снижении «пропускной» способности входных механизмов спинного мозга при развитии злокачественного процесса (Шевелева B.C., 1974). Ясно, что нарушения передачи информации, происходящие на уровне промежуточных нейронов спинного мозга, неизменно влекут за собой искажения деятельности сложных рефлекторных механизмов как самого спинного мозга, так и вышележащих нервных центров. По мере того, как исчерпываются компенсаторные возможности тех или иных нервно-рефлекторных механизмов, начинают развиваться патологические изменения, касающиеся и афферентного, и эфферентного звеньев. Понижение или исчезновение способности различных периферических нервных структур передавать и реализовывать информативные и командные сигналы приводит в конечном счете к возникновению синдрома денервации, слагающемуся из периферических механизмов, для которых наиболее характерным является автономия сосудодвигательных, трофосекреторных и других функций. В результате денервированная зона выбывает из-под тканевого контроля. Регенераторное омоложение клеточного состава вслед за канцерогенным воздействием на фоне автономии ткани усугубляет формирование раковой диспозиции, вызывая изменение структуры тканевого дифферона в сторону преобладания клоновых элементов.
Согласно положениям концепции злокачественной трансформации, канцерогенез протекает в три этапа (Долгих В.Т., 2001). Первоначально, на этапе инициации, под влиянием канцерогенного профиля происходит повреждение генома с накоплением и стабилизацией изменений ДНК, способствующих безудержной клеточной пролиферации. Второй этап опухолевого роста - промоция - характеризуется стимуляцией клеточного деления, вследствие чего образуется критическая масса инициированных клеток, происходит высвобождение их из-под тканевого контроля и образуется первичный опухолевый узел. При этом, согласно теории онкогена, происходит активация клеточных протоонкогенов, синтезируются онкобелки, которые повышают чувствительность клетки к факторам роста или выступают сами как факторы роста. На данный момент остается до конца невыясненным, является ли активация онкогенов причиной или следствием злокачественной трансформации. В литературе есть многочисленные данные о влиянии рефлексотерапии на экспрессию одного из онкогенов - онкогена c-fos, входящего в группу наиболее часто экспрессируемых при канцерогенезе онкогенов. C-fos закрепляет приходящую информацию в долговременной клеточной памяти. Инстилляция крысам в мочевой пузырь уксусной кислоты вызывает экспрессию c-fos в афферентных нейронах нижних сегментов спинного мозга (Chang C.J. et al., 1998). ЭА, проводимая в 8р-6(СаньИньЦзяо), снижала активность этих нейронов и подавляла экспрессию c-fos. На модели артрита у крыс было установлено, что ЭА снижает увеличенную экспрессию c-fos в спинальных нейронах (Ruan H.Z. et al., 1997). По другим данным ЭА-воздействие само вызывает экспрессию протоонкогена c-fos (Pan В. et al., 1997). Изучение нейронной активности с помощью метода вызванных потенциалов на моделях органных повреждений, спровоцированных ишемией или введением токсичных веществ, позволило установить универсальный неспецифический механизм защиты. При повреждении миокарда, эпителия желудка, матки и др. афферентная импульсация от поврежденной области прерывается. Этот феномен получил название функциональной деафферентации. Блокада афферентного потока ведет к снижению эфферентных импульсов вегетативной нервной системы. Т.о., с поврежденной ткани временно снимается функциональная рабочая нагрузка, тем самым клетки предохраняются от дальнейших повреждений. Установлено несколько возможных механизмов функциональной денервации. Доказано, что ГАМК является медиатором пресинаптического торможения на внутриорганном уровне, структурной основой которого являются аксоаксональные синапсы (Ноздрачев А.Д. с соавт., 1980). Доказано наличие «щелевых», или электрических, контактов между немиелинизированными афферентными волокнами. Такая структура афферентов способствует быстрому охвату их процессом деполяризации и вследствие этого блокированию афферентного канала. Важная роль в этом отводится нейропептидным механизмам (Билибин Д.П. с соавт., 1998). Опиоидные пептиды пресинаптически угнетают высвобождение катехоламинов из терминалей, а также могут модифицировать постсинаптические рецепторы на клетках мишенях, снижая тем самым эффективность связывания медиатора с рецептором (Хендерсон Г., 1982). Повышение уровня катехоламинов приводит к накоплению опиоидных пептидов, которые ограничивают их действие. С данным механизмом связывают катехоламиновую ауторегуляцию и стресс-лимитирующее действие опиоидных пептидов на периферии. Мы предполагаем, что в случае стойкого закрепления реакции деафферентации посредством механизма c-fos эта реакция потеряла бы свое защитное свойство и могла бы спровоцировать потерю тканевого контроля. В таком случае, естественная для стресса защитная реакция деафферентации, становясь «привычной», потеряет свое защитное свойство, будет способствовать возникновению функциональной автономизации ткани. Состояние функциональной денервации обеспечивается, в основном, афферентной блокадой на различных уровнях с участием эндогенной опиоидной и ГАМК-эргической систем. С помощью АП мы имеем возможность модулировать состояние рефлекторных механизмов, снимать афферентный блок, восстанавливать центральный тканевой контроль и закреплять адекватный паттерн энергоинформационного обмена.
В развернутой фазе канцерогенеза, фазе промоции, изменения вегетативной нервной системы становятся более выраженными, появляются структурные нарушения. Так при химическом канцерогенезе, через 2 месяца после инъекции уретана, у мышей наблюдается достоверное снижение плотности адренэргической иннервации в легочной ткани (Ложкин И.Д. с соавт., 1993). Работами Л.К. Шарашидзе было установлено, что уже в течение первых нескольких суток после нанесения канцерогена ДМБА, еще до появления папиллом, у крыс и мышей отмечаются изменения в афферентных нейронах шейных и грудных симпатических ганглиев, а также в продолговатом мозге [1977]. По данным литературы, существует возможность восстановления целостности нервной ткани при помощи ЭА воздействия как в центральной (Yang W.O. et al, 1999), так и в периферической части нервной системы (Wei Y.E. et al., 1988). Один из механизмов при этом состоит в регулирующем действии ЭА на выработку астроцитами основного фактора роста фибробластов.
Противоопухолевая и иммуномодулирующая активность мурамилпептидов
МДП (М-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Б-изоглутамин) представляет собой гликопептид с молекулярной массой 492. Он является структурным элементом клеточной стенки некоторых бактерий (Corynebacterium parvum, Mycobacterium bovis, Streptococcus pyogenes, Clostridium botulinum и др.). Интенсивное изучение этого иммуномодулятора и его производных связано с открытием Lederer и соавторов того факта, что МДП представляет собой минимальную структуру, которая способна заменить микобактерию в полном адьюванте Фрейнда (Ellouz F. et al., 1974). Аналоги МДП присутствуют в организме животных и человека в малых количествах, являясь факторами сна, витаминами, обезболивающими и нейротропными медиаторами, иммуномодуляторами (Adam A. et al., 1984). МДП и его аналоги активировали лимфопролиферативный ответ как на Т-клеточные, так и на В-клеточные митогены (Akasaki М. et al., 1987), причем значительно сильнее было выражено влияние на В-лимфоциты (Манько В.М. с соавт., 1989). МДП увеличивал цитотоксичность естественных киллеров (Sharma S.D. et al., 1989).
Некоторые производные МДП уже нашли клиническое применение.
В первую очередь хотелось бы отметить отечественный препарат ликопид. За рубежом, помимо глюкозаминил-МДП, внедрены в клиническую практику или находятся на завершающих этапах клинических испытаний препараты: Ромуртид, Мурабутид, CGP 19835А, МТП-ФЭ, ВЗО-МДП, ImmTher. Ромуртид оказался эффективным в коррекции побочных эффектов противораковой химио- и лучевой терапии, в частности в восстановлении числа тромбоцитов и лейкоцитов в периферической крови больных опухолями желудочно-кишечного тракта (Yano К. et al., 1995). Кроме того, Ромуртид существенно потенцировал функциональную активность периферических лейкоцитов и клеток бронхоальвеолярного лаважа у больных раком легкого (Hasegawa J. et al., 1995). Инкапсулированный в мультиламеллярные везикулы МТП-ФЭ находит применение в комплексном лечении остеосаркомы, существенно удлиняя период ремиссии заболевания после хирургического лечения (Kleinerman E.S. et al., 1995). Также показана его эффективность в лечении метастатической меланомы (Fidler I.J. et al., 1994). Липосомальный МТП-ФЭ используется и в ветеренарии, в частности в лечении гемангиосаркомы (Clifford С.А. et al., 2000) и меланомы у собак (MacEwen E.G. et al., 1999). ImmTher оказался эффективным средством профилактики и лечения легочных и печеночных метастазов колоректальных злокачественных опухолей. Очевидно, это связано с выявленной способностью препарата стимулировать экспрессию генов ИЛ-1а, ИЛ-1р\ ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, фактора хемотаксиса макрофагов, ФНО-а и активировать цитостатическую активность моноцитов/макрофагов (Worth L.L. et al., 1999). Скрининг на моделях in vitro и in vivo биологической активности новых гликозидных аналогов МДП выявил высокую иммунотропную активность Р-гликозидов МДП, которые в широком диапазоне доз в модельных тест-системах in vitro и in vivo превышали по иммуностимулирующему действию немодифицированный МДП (Калюжин О.В., 1996). В частности, продемонстрирована более высокая в сравнении с МДП способность Р-адамантилгликозид-МДП активировать спонтанную и стимулированную Т- и В-клеточными митогенами пролиферацию лимфоцитов. Р-адамантилгликозид-МДП содержит в своей структуре адамантановую группировку, идентичную кристаллической матрице алмаза. Трициклическая структура агликона Р-адамантилгликозид-МДП обладает максимальной гидрофобностью при минимальных размерах, что безусловно влияет на способность гликопептида взаимодействовать с биомембранами, а также в значительной степени определяет внутриклеточное движение вещества. В молекуле адамантана атомы углерода имеют такое же пространственное строение, как в кристаллической решетке алмаза. Углеводород адамантан не растворим в воде, но растворяется в липидном слое клеточных мембран (Багрий Е.И., 1989). Соприкасаясь с живой клеткой, он изменяет физическое состояние клеточных мембран, повышая их проницаемость. С этим связано использование адамантановых радикалов для улучшения проникновения лекарственных препаратов внутрь клетки и повышения их фармакологической активности. Оригинальное каркасное строение и биологические свойства позволили Н.Г.Арцимовичу и соавторам охарактеризовать препараты на основе адамантана как «лекарства XXI века» (Арцимович Н.Г. с соавт., 2000). Известно, что многие соединения, имеющие в своем составе адамантановые радикалы, проявляют высокую биологическую активность. Такие препараты, как мидантан, бромантан, кемантан, обладают одновременно противовирусной, противоопухолевой, иммунотропнои и детоксицирующеи активностью, а также широким спектром нейротопных эффектов. Адамантиламид-дипептид проявлял сравнимую с МДП способность увеличивать число клеток-предшественников гранулоцитов/макрофагов в костном мозге мышей, а в комбинации с субоптимальными концентрациями ИЛ-3 - стимулировать образование колоний этих гемопоэтических клеток in vitro (Vacek A. et al., 1999).
Следует заметить, что поиск новых производных мурамилпептидов способных эффективно реактивировать противоопухолевый иммунный ответ и изучение спектра чувствительных опухолей является перспективным направлением иммунореабилитации.
Исследование роли эндогенной опиоидной системы в механизме противопухолевого действия акупунктуры паранихиальных точек
Интегральное действие ИРТ обусловлено координацией механизмов, модулирующих одновременно антиноцицептивные и иммунологические реакции. Действие ИРТ на баланс антиноцицептивных систем может осуществляться несколькими путями. Пожалуй, наиболее изучено влияние ИРТ на эндогенную опиоидную систему (ЭОС).
Доказана возможность угнетения опухолевого роста под воздействием опиоидных лигандов (см. озор литературы - ЭОС). Эти данные стали основанием для исследования роли опиоидного механизма в противоопухолевом действии акупунктуры паранихиальных точек. С этой целью за 10 минут до лечения внутрибрюшинно вводили налоксон -неселективный блокатор опиоидных рецепторов. Доза препарата составила 10 мг/кг. В этой дозе препарат способен связывать три типа OP (ju-, S-, к-) из пяти известных и блокировать эти ОР во всех трех компартментах ЭОС. Мышей с карциномой Льюиса подразделили на 4 группы: контрольную, монотерапией налоксоном, монотерапией акупунктурой, сочетание введения налоксона и акупунктуры. В группе с комбинацией за 10 минут до проведения акупунутуры вводилось 10 мг/кг налоксона внутрибрюшинно.
На 7-й день эксперимента (табл. 6) в группе, получавшей налоксон в комплексе с ИРТ, наблюдалось достоверное угнетение опухолевого роста на 46%.
Далее эта тенденция стала более выраженной. К 10-му дню торможение роста опухоли в этой группе достигло 62% (табл.7) и сохранялось на этом уровне до 13-го дня эксперимента - ТРО 60% (табл.8). В группе с налоксоном отмечалось угнетение роста опухоли на 53% на 10-й день и на 52% на 13-й день опыта. В группе с монотерапией ИРТ на 7-й день эксперимента торможение роста опухоли было выражено слабо (4%). В дальнейшем отмечалось усиление противоопухолевого действия до 51% к 10-му дню (табл.7).
На 17-й день эксперимента противоопухолевое действие во всех 3-х группах было примерно одинаковым 34-35% (табл. 9). Таким образом, неселективный блокатор опиоидных рецепторов налоксон по показателю торможения опухолевого роста не только не блокировал противоопухолевого действия акупунктуры, но отчасти потенциировал его: на 9% на 10-й день и на 8% на 13 день эксперимента.
Отмечалась тенденция к увеличению средней продолжительности жизни (рис. 8) преимущественно в акупунктурной группе (9%). В группе, получавшей налоксон в сочетании с ИРТ, не отмечалось увеличения продолжительности жизни опытных мышей с LLC по сравнению с контрольными животными. Учитывая тот факт, что изменения по показателю УПЖ во всех группах были незначительны и носили недостоверный характер, то это различие не является основанием для утверждения о блокаде акупунктурного действия налоксонои. Результат этого эксперимента показал в первом приближении, что противоопухолевое действие АП связано с механизмом, отличным от лиганд-рецепторного взаимодествия с //-, S-, к- ОР эндогенной опиоидной системы.
Экспериментальная иммунотерапия меланомы В-16
Пероральное применение В-адамантилгликозид-МДП по 1 мг/кг 1 раз в 3 дня вызывало снижение скорости роста подкожного узла меланомы В-16. Так же, как и в модельной системе с использованием лимфомы EL-4, противоопухолевое действие было больше выражено на 7-й день после инокуляции опухоли (55% ) (табл.16), а через 14 (табл.17) и 21 суток (табл.18) от начала эксперимента эффект по угнетению опухолевого роста несколько снижался (соответственно 32 и 15%).
На начальном этапе опухолевого процесса торможение роста меланомы иммуномодулятором было выражено даже сильнее, чем действие циклофосфамида (25 мг/кг 1 раз в 3 дня) (табл. 16), хотя статистически это различие было недостоверно.
Комбинированное применение 13-адамантилгликозид-МДП и цитостатика вызывало наибольшее угнетение опухолевого роста, а также продлевало жизнь мышей-опухоленосителей более, чем в 2 раза (табл.17, 18; рис. 12). Монотерапия цитостатиком или иммуномодулятором увеличивала среднюю продолжительность жизни на 45 или 43% соответственно (рис. 12)
Что касается влияния адамантил-МДП на процесс метастазирования меланомы в легкие, то обнаружно значительное (33%) снижение числа макроскопических метастазов по сравнению с контролем на 28-й день эксперимента. Циклофосфамид подавлял метастазирование на 40%, тогда как сочетанное применение препаратов давало максимальный эффект (80%) (табл. 20).
Таким образом, обнаружена способность В-адамантилгликозид-МДП при пероральном применении угнетать опухолевый рост и метастазирование меланомы В-16, увеличивать продолжительность жизни мышей-опухоленосителей, а также потенциировать противопухолевые эффекты циклофосфамида.
В литературе имеются данные о снижении токсического действия противоопухолевых химиотерапевтических средств под влиянием иммуномодуляторов, в частности, мурамилпептидов. В связи с этим мы предполагаем, что существенное усиление производным МДП терапевтических эффектов циклсфосфамида в мышиных моделях меланомы и лимфомы обусловлено не только стимуляцией звеньев противоопухолевого ответа, но и снижением токсического влияния этого цитостатика на организм опухоленосителя, в том числе на системы кроветворения и иммуногенеза.
