Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общие закономерности действия питьевых минеральных вод на организм человека и его микробные биоценозы (обзор литературы) 12
1.1. Микробиоценозы человеческого организма, их значение в норме и патологии 12
1.2. Общие закономерности действия на организм человека питьевых минеральных вод 44
1.3. Механизм действия компонентов минеральных вод 50
1.4. Литературные данные о наличии и спектре антимикробной активности минеральных вод 76
1.5. Методические подходы к оценке антимикробной активности минеральных вод 88
Глава 2. Материалы и методы исследований 94
Глава 3. Экспериментальное изучение антимикробной активности минеральной воды «Усть-Качкинская» 112
3.1. Влияние минеральной воды «Усть-Качкинская» на выживаемость бактериальных и грибковых культур 112
3.2. Влияние минеральной воды «Усть-Качкинская» на скорость размножения бактериальных и грибковых культур 114
3.3.Влияние MB «Усть-Качкинская» на выраженность микробных факторов вирулентности 123
Глава 4. Влияние минеральной воды «Усть-Качкинская» на лекарственную устойчивость микробных культур 128
4.1. Дискодиффузионный чашечный метод изучения лекарственной устойчивости микробных культур 129
4.2. Метод серийных разведений в изучении лекарственной устойчивости микробных культур 138
Глава 5. Изучение антимикробных эффектов аутохтоннои микрофлоры минеральной воды «Усть Качкинская» 141
Глава 6. Изучение эффективности использования питьевой минеральной воды «Усть-Качкинская» в бальнеотерапевтической практике курорта «Усть Качка» 148
6.1. Результаты применения минеральной воды «Усть-Качкинская» при синдроме кишечного дисбактериоза 148
6.2. Клинико-лабораторная оценка результатов применения минеральной воды «Усть-Качкинская» в лечении бактериального вагиноза 153
6.3. Оценка эффективности использования минеральной воды «Усть-Качкинская» в лечении хронического тонзиллита и фарингита 164
Заключение 172
Выводы 186
Практические рекомендации 188
Список литературы 193
- Микробиоценозы человеческого организма, их значение в норме и патологии
- Методические подходы к оценке антимикробной активности минеральных вод
- Дискодиффузионный чашечный метод изучения лекарственной устойчивости микробных культур
- Оценка эффективности использования минеральной воды «Усть-Качкинская» в лечении хронического тонзиллита и фарингита
Микробиоценозы человеческого организма, их значение в норме и патологии
Жизнь на Земле невозможна без строгого функционирования единой биологической системы: макроорганизм + населяющая его микрофлора. Сегодня хорошо известно, что видовые и биологические характеристики ау-тофлоры чрезвычайно важны для здоровья людей, поскольку обеспечивают состояние колонизационной резистентности их организма. Различные органы и ткани человеческого организма, контактирующие с окружающей средой (кожа, слизистые желудочно-кишечного тракта, верхних дыхательных путей, половых органов), вместе с присущей им микрофлорой представляют собой единую экологическую систему - микробиоценоз. С современных позиций нормальную микрофлору человека рассматривают как совокупность микробиоценозов.
Являясь обитателем биосферы Земли, человек постоянно вступает в контакт с множеством микроорганизмов, часть которых формирует его собственную микрофлору. Характер микроокружения человека сложился эволюционно и приобрел устойчивость применительно к анатомо-физиологическим, биохимическим и иным особенностям вида и каждого конкретного организма [173]. В настоящее время нормальную микрофлору определяют как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих конкретный биотоп в организме человека [283]. При этом в каждом микробиоценозе различают [197] 2 основные группы микроорганизмов:
- микрофлора характерная для данного вида (постоянная, индиген-ная, аутохтонная, облигатная, резидентная);
- микрофлора случайная (временная, транзиторная, аллохтонная, факультативная).
Количество индигенных видов в любом биоценозе всегда относительно невелико, зато численно они представлены наиболее обильно [283]. Формирование качественного и количественного состава микробных микробиоценозов начинается с момента рождения и происходит за счет сложных синергических и антагонистических отношений между отдельными его составляющими, а также под влиянием физиологических факторов человеческого организма и контролирующим воздействием его иммунной системы. В процессе эволюции аутохтонные виды микроорганизмов превращались во все более взаимосвязанное целое. В настоящее время показано существование сложной и разветвленной системы кооперации между популяциями резидентных видов микроорганизмов [329]. Недостаток или избыток какого-либо субстрата или метаболита является сигналом для активации или ускоренной гибели соответствующего звена в микробиоценозе. При этом одновременно происходит разделение функций между отдельными группами микроорганизмов. Так, аэробные микроорганизмы, снижая в процессе жизнедеятельности парциальное давление кислорода, создают благоприятные условия для существования облигатно анаэробной флоры. Большинство аутохтонных видов микроорганизмов использует метаболиты других симбионтов. Подобная интеграция позволяет микробным биоценозам выступать как единое целое, согласованно работающее в интересах всего сообщества и организма хозяина. В результате возникают микробные сообщества сложного состава (в толстом кишечнике - до 500 видов, в полости рта - более 200 видов), которым свойственны общие закономерности и, в то же время, индивидуальная неповторимость у каждого отдельно взятого человека [90, 265, 273]. Микроорганизмы, составляющие нормофлору, находятся в разнообразных взаимоотношениях с организмом хозяина и между собой (мутуализм, комменсализм, паразитизм, нейтралитет, конкуренция, синергизм, синтрофия и др.) [121]. Микробиоценозы различных органов и полостей человека находятся в состоянии динамического равновесия с изменяющимися условиями внешней среды и являются весьма чувствительной индикаторной системой, которая реагирует количественными и качественными изменениями на различные физиологические и патологические сдвиги в состоянии организма. Изменение численности того или иного вида микроорганизмов в соответствующем биотопе или появление не свойственных данному месту обитания бактерий служит сигналом для адаптивных или необратимых изменений в соответствующем звене микроэкологической системы [284, 335].
Микробиоценозы как медико-биологическое понятие подразумевают эволюционно сложившиеся качественные и количественные соотношения микроорганизмов в пределах каждой конкретной экологической ниши. Представленность микроорганизмов в биоценозах и стабильность видового состава зависят от иммунного и физиологического статуса организма хозяина, а также от взаимоотношений между микроорганизмами в пределах микробного сообщества. Равновесие в биоценозах может быть нарушено изменением как микрофлоры, так и резистентности макроорганизма. При этом качественные и количественные отклонения показателей биоценоза ведут к дисбиозу [9, 83].
К наиболее значимым с физиологической и клинической точек зрения относятся биоценоз толстого кишечника и (для женского организма) вагинальный микробиоценоз, а также комплекс микроорганизмов, населяющих полость рта и верхние дыхательные пути.
Физиологический статус человеческого организма теснейшим образом связан с микрофлорой, обитающей в толстом кишечнике. Постоянство и сбалансированность микрофлоры кишечника определенным образом влияют на гомеостаз организма и его функциональное состояние.
С позиций экологии микробный биоценоз кишечника следует считать многокомпонентной биологической системой, являющейся совокупностью микроорганизмов с определенными количественными и качественными взаимоотношениями, сложившимися в процессе онтогенеза [173, 284].
Формирование кишечного микробиоценоза начинается в полости рта. Через рот из внешней среды поступает большое количество микроорганизмов, большинство из которых не задерживается надолго. Из-за постоянного омывания слизистой оболочки полости рта слюной огромное количество бактерий (до 1 млрд клеток в сутки) смывается с ее поверхности и проглатывается [346].
В состав микрофлоры толстого кишечника входят микроорганизмы, относящиеся к аэробам, факультативным анаэробам и облигатным анаэробам, причем количество анаэробов (10 - 10 " КОЕ/г) существенно превышает концентрацию аэробов (10 -10 КОЕ/г). Особо следует подчеркнуть, что современная микробиологическая техника не позволяет культивировать до 50% облигатно анаэробных бактерий, обитающих в организме человека [283], поэтому об истинном соотношении концентраций аэробы/анаэробы в кишечном микробиоценозе можно только догадываться. Эта совокупность микробов является самой многообразной (по данным разных авторов, здесь обитает от 400 до 500 видов) и самой многочисленной (общая концентра-ция микробов достигает 10 " КОЕ/г [31, 39] среди микробных экосистем человеческого организма. Это обилие микрофлоры объясняется, прежде всего, поступлением в толстый кишечник многокомпонентных органических веществ - трудноперевариваемых остатков пищи. Формированию сложного многокомпонентного микробиоценоза способствуют и другие благоприятные условия: постоянная температура, высокая влажность, сравнительно стабильный уровень рН. В микрофлоре толстого кишечника различают главную, сопутствующую и остаточную флору [174].
Основные представители кишечного микробиоценоза и средние показатели их концентраций приведены в таблице 1.
Методические подходы к оценке антимикробной активности минеральных вод
Единый регламентированный (или авторитетно рекомендованный и одобренный) подход к оценке антимикробной активности минеральных вод отсутствует. Вследствие этого в работах, затрагивающих данную тему, можно встретить исключительное разнообразие изучаемых показателей и используемых методик. Ряд исследователей оценивает в процессе бальнеотерапии динамику микробиологических показателей у пациентов с воспалительными заболеваниями бактериальной природы, на основании чего делается заключение об антимикробном эффекте применения минеральных вод. Однако в этих же работах, как правило, содержатся оговорки, что антимикробные эффекты применения минеральных вод в человеческом организме следует считать результирующей самых различных механизмов их влияния на макроорганизм, в котором персистируют микроорганизмы. Исходя из этого, конечные эффекты данного взаимодействия являются, в основном, результатом модулирующих влияний минеральных вод на неспецифические и специфические защитные реакции организма, что, впрочем, не умаляет роли антибактериальных эффектов данных курортных факторов, особенно при их местном применении [223, 115].
С микробиологической точки зрения корректнее считать проявлением антимикробной активности минеральной воды результаты экспериментов in vitro, где лишь только и возможна оценка непосредственного влияния на микроорганизмы.
Однако и этот подход характеризуется отсутствием унифицированности. Прежде всего, это относится к набору используемых объектов исследования - микробных тест-культур. Выбор каждого экспериментатора субъективен. Принципиально важным и обоснованным здесь следует считать стремление большинства авторов к использованию как грамположи-тельных, так и грамотрицательных бактериальных культур, а также (к сожалению, не всегда!) к расширению спектра используемых микроорганизмов (дрожжеподобиые грибки, простейшие). Все исследователи указывают на необходимость работы со стандартизованными взвесями свежих (суточных) тест-культур, однако даже процедуру стандартизации проводят различным образом (по стандартам мутности ГИСК или с помощью фото-электроколориметра).
В экспериментах, проводимых с минеральными водами, отсутствует единообразие и в выборе контроля. Чаще для этого используют водопроводную воду или физиологический раствор, реже - забуференный физиологический раствор или дистиллированную воду. Учитывая разнообразие химического состава водопроводной воды в различных регионах страны и его вариабельность, связанную с сезонными и погодными факторами, вряд ли можно считать такой контроль стабильным и универсальным. Не принимаемые авторами во внимание при проведении экспериментов различия в уровне осмотического давления между минеральной водой и контрольной средой (водопроводной или, тем более, дистиллированной водой) затрудняют объективную оценку результатов, а также, возможно, нивелируют различия между опытными и контрольными показателями. Действительно, проявления антимикробной активности у минеральной воды и параллельно возникающие в контроле нарушения в бактериальных клетках вследствие осмотического шока могут привести к отрицательным результатам эксперимента в целом. Принимая во внимание несомненное влияние уровня рН на жизнеспособность микроорганизмов, следует признать наиболее адекватным использование в качестве контроля забуференного (а при необходимости - максимально приближенного с помощью буфера до уровня рН исследуемой минеральной воды) изотонического раствора хлорида натрия.
В зависимости от методологической основы применяемые способы оценки антимикробной активности минеральных вод in vitro можно условно разделить накультуральные и нефелометрические. С помощью тех и других методов различные авторы изучают показатели, которые можно свести в несколько групп:
- показатели бактерицидной активности;
- показатели бактериостатической активности;
- показатели выживаемости;
- прочие показатели (выраженность факторов токсигенности, ферментативных свойств, пигментообразования и т}.п.).
Культуральные методики предполагают внесение микробных тест-культур в образцы минеральных вод и выбранного контроля с последующей инкубацией. Важную роль при этом играет уровень плотности микробных клеток. Многие исследователи указывают, что с повышением плотности микробов антимикробная активность минеральной воды снижается. Поэтому в ряде работ рекомендовано использовать невысокую ко-нечную плотность (порядка 10 КОЕ/мл). Опытные и контрольные емкости инкубируют, регулярно, производя высевы на плотные питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний (если оценивается выживаемость культуры).
Культуральные методики используются также для оценки различных свойств микробных культур, на которые могла оказать влияние минеральная вода: ферментативной активности, выработки факторов токсигенности, культуральных характеристик. Принципиальных изменений в методики это не вносит: различия касаются в основном состава питательных сред, используемых на конечных этапах эксперимента.
Нефелометрические методики основаны на инструментальном определении оптической плотности микробных взвесей или культур при помощи лабораторных приборов (фотоэлектроколориметров). В этом отношении нефелометрические методики предпочтительнее, поскольку получаемые данные (значения экстинкции в опытных и контрольных вариантах) носят цифровой характер, а потому их можно использовать для подсчета различных показателей или коэффициентов, облегчается проведение биометрического анализа. В то же время для нефелометрии приходится использовать взвеси микробных культур со значительно большей плотностью, что, как уже указывалось, приводит к занижению показателей антимикробной активности минеральных вод. Кроме того, используемые отечественными авторами методики по сути своей являются адаптацией методов, первоначально разработанных для изучения антимикробных свойств биологических жидкостей человеческого организма (сыворотки крови, ликвора, экссудатов и т.п.). Эти субстраты обладают значительно более высокой антимикробной активностью, нежели минеральные воды, поэтому при использовании таких методик невозможно получить точных и высоких показателей в отношении минеральных вод. Достоинствами этих методик следует считать достаточно легкую воспроизводимость и доступность.
Так, достаточно простая методика определения бактерицидной активности описана в работе О.В. Боровикова и A.M. Катханова [40]. Нефе-лометрическим методом (зеленый светофильтр, кювета 5 мм) определяется экстинкция смесей предварительно стандартизованных взвесей микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий) с исследуемой жидкостью или забуференным физиологическим раствором непосредственно после сведения компонентов и после инкубации в термостате в течение 30 мин при 37 С. Показатель бактерицидной активности (БЦА) предлагается рассчитывать по формуле, учитывающей начальную и конечную экстинкцию в опыте и в контроле. Отметим, что методика может быть использована и для определения фунгицидной активности минеральных вод (в частности, с использованием культур дрожжеподобных грибков рода Candida), хотя авторы и не сообщают об этом.
Еще один клинически значимый показатель антимикробной активности минеральных вод - это их способность вызывать не лизис, а задержку размножения микроорганизмов, то есть бактериостатическое действие. Описан метод определения бактериостатической активности [246] в модификации [40].
Дискодиффузионный чашечный метод изучения лекарственной устойчивости микробных культур
Данный метод использован в двух вариантах: стандартная постановка и метод «двойных дисков» (см.раздел 2.3.3.1).
Данные, полученные при использовании обоих вариантов диско-диффузионного метода, были абсолютно сопоставимы. Наглядность результатов, полученных методом «двойных дисков», была выше: на чашках наблюдали увеличение (удлинение) зоны угнетения роста вдоль полоски, смоченной MB. Однако технически методика «двойных дисков» являлась более сложной в постановке. Кроме того, в этом варианте влияние MB на культуры продолжалось в течение всего времени инкубации чашек, что отличало условия эксперимента от условий клинического применения MB (см. фото на стр.130). Поэтому в большинстве наблюдениях использовали классический вариант дискодиффузионного метода с предварительной обработкой взвесей микробных культур MB в течение 30 мин при 37 С.
Результаты исследований свидетельствовали о том, что контакт с MB в большинстве случаев достоверно повышает уровень чувствительности грамположительной бактериальной микрофлоры к антибактериальным препаратам. В табл. 11-13 приведены средние показатели, полученные при использовании дискодиффузионного метода, а также результаты их статистической обработки. Графическая интерпретация этих данных представлена на рис. 9-11.
Контакт с MB «Усть-Качкинская» в большинстве случаев также оказал достоверное влияние на уровень лекарственной резистентности гра-мотрицательной бактериальной микрофлоры по сравнению с контролем (табл. 14 - 15). Однако этот эффект прослеживался лишь в отношении культур исследуемых энтеробактерий: E.coli и Proteus vulgaris (рис. 12-13).
Важно отметить, что MB оказывает положительное влияние на чувствительность к антимикотическим препаратам дрожжеподобных грибков Candida albicans (табл.16, рис. 14).
Как следует из данных, представленных в таблице 16, уровень чувствительности культур дрожжеподобных грибков после контакта с MB (опыт) достоверно выше, чем в контроле, а коэффициент «опыт/контроль» даже более высок, чем при изучении бактериальных культур.
Оценка эффективности использования минеральной воды «Усть-Качкинская» в лечении хронического тонзиллита и фарингита
Для оценки возможностей использования питьевой минеральной воды «Усть-Качкинская» в лечении хронического тонзиллита и фарингита было проведено исследование, где в группе наблюдения находилось 60 больных хроническим тонзиллитом в стадии компенсации (55) и декомпенсации (5) и хроническим фарингитом в катаральной, атрофической и гипертрофической формах. Возраст пациентов колебался от 16 до 50 лет. Большинство больных составляли женщины (48 человек). Длительность заболевания от 1 года до 10 лет отметили 43 человека, от 10 до 20 лет - 17 человек. Больные предъявляли жалобы на частые (до 2-х раз в год) ангины, протекающие с высокой температурой тела, общей слабостью, повышенной утомляемостью, снижением работоспособности, потливостью - 36 человек, откашливание «гнойных» пробок, образующихся в лакунах миндалин - 33 человека, першение в горле - 31 человек, скопление в глотке большого количества вязкого слизистого отделяемого - 11 человек, неприятный запах изо рта - 10 человек, ощущение инородного тела в горле - 4 человека, сухость в горле - 3 человека, болевые ощущения в области миндалин - 14 человек.
Фарингоскопическая картина: гиперемия и отечность слизистой оболочки глотки, что соответствует катаральному фарингиту, наблюдались у 47 человек; скопления лимфоидной ткани в виде ярко-красных зерен, возвышающихся над уровнем слизистой задней стенки ротоглотки (картина гранулезного фарингита) - у 9 человек, бледная истонченная слизистая, покрытая слизью, засыхающей в виде корок (субатрофическая форма фарингита) -у 3 человек. Небные миндалины - гиперемированные, чаще гипертрофированные (49 человек), спайки между небными дужками и миндалинами (42 человека), утолщения и гиперемия краев небных дужек (47 человек), регионарный шейный лимфаденит (22 человека).
Микробиологические исследования мазков с поверхности небных миндалин выявили следующий микробный пейзаж. Среди стафилококков преобладали коагулазонегативные виды: S.epidermidis, S.warneri, S.cochnii, S.saprophyticus и S.lugdimensis (45 человек), несколько реже встречались коагулазоположительные виды S.aureus, S.intermedius и S.huicus (у 35 человек). Среди представителей рода Streptococcus чаще отмечали присутствие таких видов, как Str.acidominimus (32) и Str. equinus (13); реже выделяли культуры, относящиеся к видам Str.parauberis (10), Str.oralis (5), Str.agalactiae, Str.pneumoniae и Str.mutans. У девяти пациентов обнаружены энтерококки. Дрожжеподобные грибки Candida albicans выделены у семи обследуемых.
Промывание лакун миндалин водой «Усть-Качкинская» производили ежедневно в течение 7 дней; пациентам было рекомендовано также проводить в это время полоскание горла водой «Усть-Качкинская» 3 раза в день после еды.
В результате проведенного санаторно-курортного лечения у большинства пациентов (56 человек) отмечено значительное или частичное улучшение ЛОР-статуса: исчезли или уменьшились першение в горле и ощущение инородного тела, прекратилось откашливание гнойных пробок. Изменилась и объективная картина: уменьшилась гиперемия и отечность небных миндалин и задней части слизистой оболочки глотки, отсутствовал гной в лакунах миндалин при нажатии на них шпателем. При повторных микробиологических исследованиях наблюдали снижение уровня колонизации миндалин бактериальной и грибковой микрофлорой на 1- 2 lg КОЕ (табл. 31). Ухудшение состояния отмечено у 4-х человек вследствие перенесенной в период бальнеотерапии острой респираторной вирусной инфекции.
Помимо основной группы (группы наблюдения) пациентов с хроническим тонзиллитом и фарингитом, которым проводилось бальнеолечение с применением ПМВ, аналогичным образом была обследована группа сравнения из 30 человек, у которых аналогичным образом (промывания лакун миндалин + полоскания горла той же водой) проведен курс бальнеотерапии бромйодной водой курорта «Усть-Качка».
Комбинированное применение минеральной воды, независимо от химического состава, оказывало положительный клинический эффект: после курса лечения отмечалось исчезновение жалоб и оптимизация объективной картины (снижение гиперемии и отечности небных миндалин и задней части слизистой глотки, исчезновение гноя в лакунах миндалин). Это объясняется тем, что промывание миндалин обеспечивает механическую очистку лакун от экссудата и патогенных агентов, оказывает эффект массажа, стимулируя естественные процессы самоочищения слизистой и улучшая кровоснабжение. Использование минеральных вод повышало эффективность процедуры, добавляя к вышеуказанным механическим воздействиям влияние компонентов своего состава.
В то же время, если повторные микробиологические исследования при использовании ПМВ свидетельствовали о достоверном (pSt 0,01; pw 0,01) снижении уровня колонизации миндалин бактериальной и грибковой микрофлорой на 1- 2 lg КОЕ (табл.31) при сохранении видовой структуры микрофлоры, колонизирующей миндалины, практически наполовину (табл.33), после применения бромйодной MB результаты посевов были иными.
Различия во влиянии ГТМВ и БМВ на структуру микрофлоры небных миндалин будут обсуждаться далее. Пока же отметим, что сохранение стабильности микрофлоры миндалин считается важным для сохранения уровня колонизационной резистентности [284].
В детском саду «Огонек» курорта «Усть-Качка» промывание лакун миндалин MB «Усть-Качкинская» проведено 28 детям 5 -7 лет, больным хроническим тонзиллитом и фарингитом (группа наблюдения). Одновременно 20 детей того же возраста с аналогичными заболеваниями получили местное лечение изотоническим раствором хлористого натрия (группа сравнения). Промывания производили ежедневно в течение 7-10 дней в сочетании с полосканием горла той же жидкостью (ПМВ или физиологическим раствором) 3 раза в день после еды. Методика промывания описана в разделе 2.5.3.
Среди 28 детей первой группы преобладали мальчики - 22 (78,6%). Распределение по возрасту и группам здоровья было следующим: 5 лет - 10 человек (35,7%), 6 лет - 14 (50%), 7 лет- 4 (14,3%); 1-я группа здоровья - 0, 2-я - 22 (78,6%), 3-я - 6 (21,4%), 4-я - 0.
Распределение детей в группе сравнения по возрасту и группам здоровья не отличалось от основной.
У всех пациентов двукратно изучали микрофлору мазков с поверхности небных миндалин: при первом осмотре (до начала бальнеолечения) и после проведенного курса терапии.
Фарингоскопическая картина: в группе наблюдения гиперемия и отечность слизистой оболочки глотки (катаральный фарингит) наблюдались у 19 человек (67,8%), скопление лимфоидной ткани в виде ярко-красных зерен, возвышающихся над уровнем слизистой задней стенки ротоглотки (гранулезный фарингит) - у 6 (21,4%), небные миндалины гиперемирован-ные, чаще гипертрофированные - у 18 (64,3% ), гной в лакунах миндалин при надавливании на них шпателем - у 3 (10,7%), спайки между небными дужками и миндалинами - у 13 (46,4%), утолщение и гиперемия краев небных дужек — у 10 (35,7%). Регионарный подчелюстной лимфаденит отмечался у 24 детей (85,7%о).
В группе сравнения картину катарального фарингита наблюдали у 50% детей, гипертрофированные небные миндалины - у 90%), гной в лакунах миндалин - у 10%. Регионарный подчелюстной лимфаденит выявлен у 16 детей (80%).
Основной диагноз: хронический тонзиллит - 6 человек (12,5%), хронический фарингит - 42 (87,5%). Сопутствующий диагноз: гипертрофия небных миндалин - 33 человека (70%), группа длительно и часто болеющих детей - 9 (18,8%), респираторный аплергоз - 7 (14,6%о), хронический аде-ноидит - 3 (5%).
