Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Методы и средства анализа концентрации белка в моче 10
1.1. Биологический объект исследования - белок в моче 10
1.2. Методы определения белка в моче 13
1.3. Основы метода взаимодействия комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия с белком 25
1.4. Обоснование актуальности создания нового отечественного набора реагентов 28
1.5. Физические основы функционирования биохимических фотометров 29
1.6. Обоснование актуальности разработки анализатора концентрации общего белка в моче 35
1.7. Общие выводы. Цели и задачи работы 39
Глава II. Исследование характеристик набора реагентов, разработка методики определения концентрации общего белка в моче с его применением и сравнительный анализ с наборами реагентов сторонних производителей 41
2.1. Материалы, оборудование и методы 42
2.2. Исследование аналитических характеристик реагента 46
2.3. Исследование эксплуатационных характеристик реагента 53
2.4. Разработка методики выполнения анализа концентрации общего белка в моче с применением набора реагентов 64
2.5. Сравнительные исследования созданного набора реагента и наборов реагентов сторонних производителей 66
2.6. Исследование модифицированных образцов реагента 73
2.7. Общие выводы 80
Глава III. Разработка и подготовка к серийному производству специализированного фотометра для анализа концентрации общего белка в моче 81
3.1. Определение оптической схемы фотометра и выбор базовых комплектующих элементов 81
3.2. Разработка блок-схемы фотометра 121
3.3. Определение компоновки фотометра 123
3.4. Разработка алгоритма функционирования фотометра и его пользовательского интерфейса 131
3.5. Общие выводы 142
Глава IV. Испытания, применение и внедрение фотометра с набором реагентов в лечебные учреждения 143
4.1. Разработка технической документации и проведение испытаний фотометра с набором реагентов 144
4.2. Применение фотометра с набором реагентов в лечебных учреждениях 149
4.3. Общие выводы 159
Заключение 160
Библиографический список 163
Приложения 174
- Основы метода взаимодействия комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия с белком
- Исследование аналитических характеристик реагента
- Разработка блок-схемы фотометра
- Применение фотометра с набором реагентов в лечебных учреждениях
Введение к работе
Заболевания почек - одни из самых распространенных недугов современного человека [1], Ухудшающаяся экологическая обстановка в крупных городах, где проживает большая часть населения развитых стран, неправильное питание, вода низкого качества, нездоровый образ жизни и каждодневные стрессовые нагрузки - все это способствует быстрому росту числа людей, подверженных болезням мочевыделительной системы. К ним относятся сахарный диабет [2, 3], различные нефротические синдромы [1], которые в значительной степени влияют на состояние всего организма в целом [3-5].
По официальным данным отдела медицинской статистики и информатики МЗ и СР РФ на 01.01.2003 г. насчитывалось по обращаемости 2182408 больных 1 и 2 типом сахарного диабета. Фактическое же количество больных только сахарным диабетом в России в 3-4 раза выше, исходя из данных эпидемиологических обследований, проводимых в различных регионах страны.
Более 70% людей, имеющих болезни почек, не догадываются об этом. Зачастую, врачи способны поставить диагноз и назначить необходимое лечение тогда, когда заболевание приобретает тяжелую форму [2].
Существует несколько причин, из-за которых выявление патологии почек на ранних стадиях существенно усложнено, а зачастую невозможно.
Во-первых, многие популярные аналитические методы, как, например, метод с применением сульфосалициловой кислоты для преципитации белка в моче (ССК-метод), используемые сегодня в отечественной медицине, не позволяют выявлять малое содержание биологических веществ, являющихся надежными показателями работоспособности почек, например, таких как белок в моче. Эти методы также не позволяют корректно отслеживать изменение содержания этих биологических веществ в организме пациента.
Во-вторых, в подавляющем большинстве клинико-диагностических лабораторий (КДЛ), занимающихся исследованием мочи - основного результата деятельности почек, не используется современное высокопроизводительное и точное аналитическое оборудование [6].
В-третьих, крайне тяжелое экономическое положение отечественного здравоохранения не позволяет кардинально изменить сложившуюся ситуацию теми аналитическими средствами (оборудованием и методами), которыми обладает в настоящий момент.
Поиском решения проблемы диагностики почечных патологий активно занимаются исследователи во многих развитых странах, таких как Япония, США, Великобритания, Франция, Германия, Швеция, Южная Корея. Сегодня разработано и внедряется в зарубежную медицинскую практику большое количество новых, более современных методов диагностики про-теинурии - основного показателя нарушения работы почек, и мочевыдели-тельной системы в целом.
Для российского здравоохранения актуальным становится вопрос выбора приемлемого метода анализа белка в моче, а также выбора оборудования, удовлетворяющего условиям реализации этого метода.
Данная работа посвящена решнию задач создания доступного по цене оборудования и набора реагентов, разработки методических указаний, с помощью которых любая КДЛ могла бы наиболее эффективно на сегодняшний день выполнять необходимое количество анализов содержания общего белка в моче (ОБМ).
Структура работы следующая:
В главе 1 представлен исторический обзор методов определения белка в моче, дана их классификация. Согласно сформулированным требованиям к современному методу анализа ОБМ наиболее оптимальным является метод, основанный на взаимодействии комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия с молекулами белка (ПГК-метод). В главе представлены основы этого метода и на основе анализа существующих реагентов с красителем пирогаллоловым красным (ПГК-реагентов) обоснована актуальность создания и внедрения в лабораторную практику нового набора реагентов. Далее рассмотрены физические основы функционирования биохимических анализаторов, на основе проведенного сравнения существующих фотометров и сформулированных требований обоснована актуальность разработки и внедрения в клиническую лабораторную практику специализированного фотометра для количественного анализа ОБМ. На основании общих выводов поставлена задача на разработку специализированного фотометра с набором реагентов для выполнения анализов ОБМ.
В главе 2 изложены результаты исследований характеристик созданного набора реагентов с целью дальнейшей разработки специализированного фотометра для анализа содержания ОБМ с его применением. Представлены методические аспекты определения концентрации ОБМ с применением исследованного набора реагентов. В завершении главы представлены результаты сравнительных исследований его характеристик и характеристик наборов реагентов других производителей, позволяющие заключить, что рассматриваемый набор реагентов не уступает по качеству импортным аналогам.
В главе 3 изложено решение задачи разработки и подготовки к серийному производству специализированного биохимического фотометра для выполнения количественных анализов концентрации ОБМ с применением исследованного набора реагентов, в том числе представлено решение задачи разработки и оптимизации измерительной части (оптической ячейки) фотометра, описан процесс выбора и конструирования основных узлов прибора при соответствующих ограничениях к ним, основанных на требованиях, изложенных в главе 1. Представлена блок-схема работы фотометра. Описаны его программные средства.
В главе 4 представлены результаты технических и медицинских испытаний фотометра и набора реагентов, проведенных соответствующими государственными испытательными учреждениями РФ. Приведены результаты сравнительных исследований применимости разработанной системы для вы- полнения анализа ОБМ в клинической практике, выявившие его значительные преимущества над повсеместно используемыми методами и оборудованием для выполнения данного вида анализа.
В заключении сделан вывод, о том, что поставленные задачи в данной работе выполнены, что подтверждают положительные заключения, полученные при испытаниях в сторонних организациях (соответствующие документы представлены в Приложениях к данной работе).
Данная работа защищает следующие положения:
Математическая модель определения концентрации белка в биопробе фотометрическим методом с помощью двухволновой методики анализа, позволяющая численно выбрать оптимальные параметры свето диодов, используемых в качестве источников излучения, и оценить возможные погрешности при фотометрировании.
Разработка фотометра, обладающего существенно низкой стоимостью в сравнении с существующими прототипами благодаря использованию в нем свето диодов с параметрами, выбранными с учетом результатов математического моделирования и экспериментальных данных; а также обладающего значительной производительностью за счет оптимизации конструкции и алгоритма работы для анализа с помощью созданного и исследованного набора реагентов.
Результаты исследований и технология производства набора реагентов, с улучшенными потребительскими характеристиками в сравнении с импортными аналогами, и обладающего более низкой стоимостью.
Результаты испытаний и внедрения разработанного оборудования для выполнения количественных анализов концентрации ОБМ в лабораторную практику отечественного здравоохранения.
Основы метода взаимодействия комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия с белком
История развития метода подробно изложена в нашем обзоре [119]. ПГК-метод определения концентрации ОБМ основан на фотометрическом принципе измерения ОП окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии молекул белка с молекулами соединения ПГК-красителя и молибдата натрия. Интенсивность окраски комплекса в диапазоне длин волн 580 - 620 нм пропорциональна концентрации ОБМ.
В 1986 г. N. Watanabe описал метод определения ОБМ, основанный на применении соединения ПГК-красителя и молибдата натрия [95]. Спектры поглощения молекул реагента и его комплекса с белковыми молекулами показаны на рис. 1-1. Спектр раствора ПГК-красителя (1) имеет максимум поглощения в области 470 нм. При увеличении длины волны света поглощение уменьшается так, что на длине волны 600 нм значение ОП реагента в 7 раз меньше, чем в максимуме полосы поглощения.
Если к пробе, содержащей молекулы белка, добавить ПГК-реагент, то молекулы белка образуют комплекс с молекулами красителя, и максимум спектра поглощения комплекса возникает на участке больших длин волн видимого спектра (в области 600 нм), как представлено на рис. 1-1 (2). При концентрациях от 0 до 2-3 г/л белка количество молекул, образовавших комплекс белок-краситель, пропорционально концентрации молекул белка. Чем выше концентрация молекул белка, тем выше ОП пробы на участке длин волн 580-620 нм. С ростом концентрации белка зависимость соответствующих ей значений ОП пробы принимает нелинейный характер и, начиная с некоторого значения (обычно с 2-3 г/л), становится постоянной. Эффект насыщения является следствием того, что все молекулы красителя связались с молекулами белка и новые комплексы краситель-белок не образуются, а значит величина ОП пробы не изменяется.
Для получения корректного значения прироста ОП пробы в зависимости от концентрации белка в ней, необходимо измерять ОП пробы относительно ОП реагента, поскольку реагент имеет достаточно сильное поглощение (порядка 0,3 Б [197, 198]) на участке длин волн 580-620 нм. Спектр поглощения комплекса краситель-белок имеет резкий спад в области длин волн 650-700 нм. Это позволяет использовать двухволновой метод фотометрирования: основная длина волны - 600 нм, вспомогательная -длина волны в области 650-700 нм.
ПГК-реагент превосходит другие реагенты с красителями рядом уникальных особенностей. Высокая чувствительность реагента и высокие значения ОП при поглощении света комплексами краситель-белок позволяют использовать для проведения биохимической реакции малые объемы исследуемого белкового образца (от 8-20 мкл). При использовании пятидесятикратного разведения образца мочи в реагенте (при соотношении образца и реагента 1:50) линейный диапазон измерения достигает 2,5-3 г/л, и при этом практически полностью исключается влияние ее состава (клеток крови, солей, бактерий и др.) на результат измерения концентрации белка. А при соотношении образца мочи и реагента 1:10 чувствительность метода позволяет определять концентрацию ОБМ в области от 0,02 до 0,10 г/л (микропротеи-нурия).
ПГК-краситель взаимодействует с молибдатом натрия при рН 1,5-3,5, при этом смещение максимума поглощения практически не наблюдается (рис, 1-1). Взаимодействие комплекса краситель-молибдат натрия с белковыми молекулами происходит в кислой среде [95]. Оптимальная область кислотности - рН 2,5-3,4. Буферная емкость реагента должна обеспечивать указанное условие проведения реакции таким образом, чтобы на ее результат не влияло значение рН исследуемого образца мочи.
Особенностью исходного ПГК-красителя является его ограниченная растворимость в воде и сильная зависимость спектра поглощения от кислотности раствора [199]. В щелочной среде может появиться голубое окрашивание, аналогичное комплексу с белком, что может повлиять на правильность конечного результата анализа. Отмечено, что в щелочной среде растворы красителя неустойчивы [199]. Поэтому очень важен контроль кислотности растворов при изготовлении реагента. Более подробное исследование оптических, цветометрических и кислотно-основных характеристик ПГК-красителя проведено Ивановым и Мамедовой [199].
Проблема неполного определения различных типов белков в биологических жидкостях [94, 126,138,139,147, 151, 155], присущая всем методам с использованием красителей, практически полностью решается путем добавления в состав реагента различных детергентов; обычно применяется до-децилсульфат натрия [94].
К моменту начала работ по данной теме на российском рынке лабораторных реагентов существовали ПГК-наборы единственного отечественного производителя ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, Россия). Кроме этого КДЛ предлагались импортные ПГК-наборы компаний DiaSys (Германия), Biocon Diagnostik (Германия), Chema (Италия), Тесо Diagnostics (Италия), Sentinel СН (Италия), Quantimetrix (США) и некоторых других.
Несмотря на широкий выбор биохимических наборов, основанных на ПГК-методе определения ОБМ, актуальность создания нового 111 К-реагента обусловлена, в общем, следующими причинами. Из-за того, что разность в стоимости между дорогостоящими импортными наборами и очень дешевыми (практически всегда кустарно изготовленными в КДЛ) реагентами для ССК-метода, достаточно велика, выбор метода определения ОБМ в КДЛ зачастую остается за ССК-методом. Данный выбор обусловлен соображениями экономии денежных средств в условиях тяжелого финансового положения, в котором сейчас находится здравоохранение России. Высокая стоимость новых, более совершенных (импортных) методов определения ОБМ затрудняет их внедрение в лабораторную практику. Для популяризации ПГК-метода необходимо создание и внедрение в медицинскую практику недорогого (со стоимостью анализа, близкой к стоимости анализа, выполненного ССК-методом) и не уступающего по аналитическим характеристикам импортным аналогам ПГК-набора реагентов.
Исследование аналитических характеристик реагента
В диапазоне длин волн 300-700 нм в спектрах поглощения реагента наблюдаются три пика: 1. Основной пик, характеризующий концентрацию молекул красителя, способных к взаимодействию с молекулами белка, наблюдается в диапазоне длин волн 460-500 нм с максимумом поглощения при длине волны 480 нм. 2. Пик в диапазоне длин волн 340-430 нм с максимумом поглощения при длине волны 370 нм, соответствующий, соединению, возникающему при окислении красителя с течением времени хранения и неспособному к взаимодействию с белковыми молекулами. 3. Широкий и относительно низкий пик с максимумом длины волны 570 нм в диапазоне длин волн 520-600 нм.
Спектр поглощения, характерный для исследуемого реагента. Пик, наблюдаемый в диапазоне длин волн 520-600 нм, получен из исходных спектров с помощью линейной аппроксимации спектрального участка поглощения красителя в диапазоне 510-630 нм и более детально представлен на рис. 2-2. Хотя линейная аппроксимация описывает выделяемый пик достаточно приблизительно, она позволяет получить правильное представление о его форме, ширине и длине волны максимума. На рис. 2-3 представлены спектры поглощения для проб с различной концентрацией белка, полученные с помощью исследуемого реагента. Отмечено, что чем выше концентрация белка в образце, тем больше амплитуда пика с максимумом на длине волны 600 нм и тем менее величина ОП на длине волны 480 нм.
Для изучения аналитической чувствительности реагента оценена минимальная концентрация белка, которая может быть определена с использованием реагента на спектрофотометре СФ2000.
Экспериментально проведена оценка СКО измерений ОП холостой пробы. Для контроля предела допускаемого значения СКО случайной составляющей погрешности спектрофотометра проведены измерения ОП контрольного светофильтра со стабильной ОП (табл. 2-1).
Показано, что инструментальная часть значения КВ% порядка 0,28 и 0,75 на длинах волн 600и650нм соответственно (выше, чем в руководстве по эксплуатации прибора [203]). Вычислением разностей значений КВ% из таблиц для длин волн 600 и 650 нм получены значения КВ% порядка 0,13 и 0,33 соответственно, которыми оцениваются флуктуации (нестабильность) ОП холостой пробы. Полученные значения соответствуют ОП, равным 0,0003 Б - для 600 нм и 0,0002 Б - для 650 нм.
Следовательно, при двухволновой методике измерения биопробы суммарная погрешность из-за флуктуации исследуемого раствора может составлять 0,001 Б. Для обеспечения необходимой точности определения концентрации белка необходимо, чтобы разность ОП, измеренная на двух данных длинах волн, соответствовала Д 0,005 Б. Определив фактор пересчета для двухволновой методики F2 (рис. 2-4), рассчитаем концентрацию иссле дуемого вещества, соответствующую данной разности AD — она приблизительно равна 0,01 г/л. Таким образом, теоретически определена чувствительность исследуемого реагента для указанного спектрофотометра.
Построены экспериментальные калибровочные графики для малых концентраций разведенного в воде альбумина: 0,00625; 0,00125; 0,0025; 0,0050; 0,0100 г/л при соотношении образец/реагент 30:1000 мкл (одноволно-вая и двухволновая методики). Указанные графики представлены на рис. 2-4. Результат математической обработки исходных значений представлен в табл. 2-3.
Доказано, что область линейности калибровочной характеристики при одноволновой методике измерения для соотношения образец/реагент 20:1000 мкл с относительным отклонением 5% от ее линейного тренда достигает своего предела при концентрации белка 2,5 г/л в образце (см. рис. 2-5). С помощью измеренных значений построен квадратичный тренд, описываемый уравнением квадратичной аппроксимации С = 0,3937 Дг+2,4088 AD. Для него определен 5%-й «доверительный» интервал. Линейный тренд для полученных точек также находился в указанном интервале и описывался уравнением С = 2,659 AD. Калибровочная зависимость для одноволновои методики, полученная для проб с соотношением образец/реагент 20:1000 мкл: 1 (жирная) - линейный тренд, 2 (тонкая) - квадратичный тренд, 3 (пунктирная) - границы 5%-го отклонения от квадратичного тренда («доверительный» интервал).
Пробы, приготовленные смешиванием реагента с белковыми растворами, обладают временной стабильностью ОП окрашенного комплекса, регистрируемой на длине волны 600 нм. С целью определения времени инкубации пробы и времени стабильности окрашенного комплекса при комнатной температуре +18...+25 С проведены кинетические измерения ОП проб с концентрациями белка 0,6; 1,0; 1,5; 2,0 и 2,5 г/л на длинах волн 600 и 650 нм (при соотношении образец/реагент 1:50). Определен диапазон наиболее критичных концентраций белка, которыми определяется общее время стабильности пробы - свыше 1,0 г/л (рис. 2-6). Отмечено, что у проб с концентрацией белка, превышающей 1,0 г/л, визуально наблюдаются агрегаты синего цвета. После смешивания реагента с образцом они образуются в течение 5-10 мин, а затем через 35-60 мин выпадают в осадок.
Разработка блок-схемы фотометра
Определяющими требования при выборе ФПУ для оптической ячейки являлись: Размер диафрагм оптической ячейки, а, следовательно, и сечение зондирующего луча, определялись диаметрами применяемых контрольных светофильтров из поверочного набора КСП-01 ТУ 4486-003-27480117-98 (ГМП «Март», г. Санкт-Петербург, Россия), не превышающими 5 мм. Использование фотодиодов с большей рабочей площадью могло привести к увеличению уровня «шума» за счет попадания паразитного излучения в неиспользуемую светочувствительную область ФПУ. Применение ФПУ с меньшей площадью фотодиода не позволило бы регистрировать весь световой поток, проходящий через пробирку с пробой, что означает ослабление рабочего сигнала и уменьшение чувствительности измерения.
В связи с необходимостью регистрации слабых рабочих сигналов, ФПУ должен иметь высокое выходное сопротивление. В случае, когда ОУ находится на значительном расстоянии от фотодиода, последний выполняет роль антенны для различных помех. Таким образом, и фотодиод, и ОУ должны иметь специальную экранировку, а также располагаться как можно ближе друг другу. Наилучшим решением служил бы планарный ФПУ, состоящий из фотодиода и первичного каскада ОУ, выполненных на одном кристалле и защищенных единым экранирующим корпусом - в данном случае элементы предельно близки друг к другу, а внешние помехи минимизированы.
Вышеперечисленным требованиям удовлетворяет серийно-выпускаемый ОРТІ01 (Texas Instruments, США), представляющей собой монолитный фотодиод с ОУ на одном кристалле. Выходное напряжение увеличивается линейно с увеличением интенсивности светового потока. ОУ разработан для однополярного и двуполярного питания, и идеально подходит для питания от элементов питания.
Из оптики известно, что любые выпуклые оптические поверхности обладают свойствами фокусировки. По этой причине пробирка с пробой представляет собой цилиндрическую линзу. При стендовых исследованиях экспериментально определено расстояние фокусировки прошедшего через пробирку светового пучка таким образом, чтобы сфокусированное пятно точно попадало в фоточувствительную область ФПУ. Это расстояние, равное , в дальнейшем использовалось при разработке конструкции измерительной ячейки.
В связи с требованием, что ширина диафрагм должна быть намного меньше диаметра используемой пробирки ( 10 мм), подобрана минимально возможная ширина, равная 1,5 мм. Ширины меньшего размера технологически сложны в изготовлении, а, следовательно, дороже по стоимости.
Высота диафрагм определялась диаметрами применяемых контрольных светофильтров из поверочного набора КСП-01 ТУ 4486-003-27480117-98., диаметр которых равняется 5 мм. Подобран размер, равный 3 мм.
В связи с требованиями минимизации стоимости и безотказности фотометра принято решение не использовать механические колеса, шаговые двигатели и другие двигающиеся элементы в конструкции фотометра. Перенаправление двух зондирующих лучей к блоку установки пробирки с пробой выполнено с помощью оптического ветвителя - светоделительного стекла, располагающегося по отношению к каждому из лучей под углом 45. Роль светоделителя выполняет стандартное предметное стекло толщиной 1 мм.
Известно, что яркость излучения СД возрастает с увеличением длины волны максимума излучения, а также согласно техническим данным производителя [210] с увеличением длины волны максимума излучения возрастает чувствительность у применяемого ФПУ ОРТІ 01 (см. рис. 3-3). Поэтому СД расположены таким образом, как показано на рис. 3-1. СД с основной длиной волны излучения 600 нм расположен на одной оси с пробиркой и ФПУ, как известно из оптики, световые потери от него из-за прохождения через стекло составляют 6%. В то время как потери излучения от СД со вспомогательной длиной волны 650 нм составляют 94%. СД подобраны таким образом, чтобы интенсивности излучения света от обоих, прошедшие через стекло, были относительно равнозначными.
Корректное расположение (юстировка) светоделительного стекла на оптической оси играет определяющую роль в перенаправлении зондирующего излучения в сторону пробирки с пробой. В связи с этим проведены расчеты максимально допустимых углов наклона и минимально допустимые размеры базы стекла.
Вышеперечисленным требованиям удовлетворяет серийно-выпускаемый эргономичный светло-серый корпус Comtec 200 F/H А0620117 (OKW GmbH, Германия), размеры которого составляют 200x150x63 мм3, а масса 0,250 кг. Материалом корпуса является химически устойчивый акри-лонитрил-бутадин-стириновый пластик. Корпус состоит из двух частей и при сборке спереди фиксируется специальными креплениями и на задней стенке закрепляется двумя винтами. На нижней стороне корпуса размещается батарейный отсек, рассчитанный на 4 элемента питания типа АА.
Применение фотометра с набором реагентов в лечебных учреждениях
Данный раздел посвящен оценке конкурентоспособности разработанного комплекса средств для анализа ОБМ, описанного в главах 2 и 3, по отношению к распространенным в отечественных КДЛ методам и оборудованию, используемому для выполнения анализа ОБМ. Для сравнения их аналитических и эксплуатационных качеств в условиях реальных КДЛ проведены сравнительные исследования ОБМ ПГК-методом на разработанном фотометре и ССК-методом на фотометре Chem-5 Plus на базе КДЛ Городской больницы № 40 г. Москва, и ССК-методом на фотометре КФК и с помощью методов «сухой химии» (тест-полосок) на анализаторе Uriscan Pro на базе КДЛ Московского областного научно-исследовательского клинического института им М.Ф. Владимирского (МОНИКИ).
Структура данного раздела следующая: " В разделе 4.2.1 дано описание модификаций применяемых в КДЛ методов и краткое описание используемого оборудования, которое подтверждает практическую невозможность стандартизовать результаты ССК-метода[41,50,57,2И]. ? В разделе 4.2.2 представлены результаты применения разработанного комплекса средств, описанного в главах 2 и 3, и методов и оборудования, описанного в разд. 4.2.1, для выполнения анализов ОБМ. ? В разделе 4.2.3 на основе представленных результатов сформулированы выводы, выявляющие значительные преимущества разработанного фотометра с набором реагентов.
Выполнение количественных анализов ОБМ выполнялась следующим образом (на примере 100 образцов): 1. Подготовка проб к измерению. Из каждого образца мочи пипеткой отбирали по 20 мкл и вносили в измерительную пробирку, затем в каждую пробирку добавляли по 1 мл рабочего реагента, т.о. соотношение образец/реагент составило 1:50. Далее производили подготовку холостой пробы, которая вместо мочи содержала 20 мкл воды, и калибровочной пробы, которая содержала 20 мкл калибровочного раствора с концентрацией белка 1,0 г/л. Все опытные пробы инкубировались в течение 15 мин. По нашим подсчетам на пробоподготовку 100 образцов (с учетом времени инкубации всех проб) лаборант затратил на более 30 мин. 2. Измерение всех образцов на фотометре с внесением результатов в бланки анализов заняло у лаборанта 20 мин.
Определение ОБМ ССК-методом на кюветочном фотометре Chem-5 Plus (ERBA, Япония) в КДЛ ГБ №40 на примере 100 образцов выполнялись следующим образом: 1. Подготовка проб к измерению. Все образцы мочи разливались в центрифужные пробирки объемом 10 см (у лаборанта эта процедура занимала 10-20 мин). Образцы центрифугировались (для 100 образцов - 1 ч). В чистые пробирки закладывались специальные таблетки с ССК. В пробирки с таблетками вносились отцентрифугированные образцы объемом 3 мл (10-20 мин). Визуально (качественный анализ) контролировалось появление белых колец в пробах. Далее отбирались те образцы, в которых обнаруживалось кольцо, для измерения (5 мин). 2. Измерения проводились на биохимическом полуавтоматическом фотометре Transasia ERBA Chem-5 Plus каждой отобранной пробы (с растворенной таблеткой ССК) против холостой пробы (той же самой мочи без таблетки).
При выполнении анализов ОБМ данным способом КДЛ в среднем в день обнаруживает и измеряет концентрацию белка в 10-30 образцах мочи. На измерение 10 образцов обычно расходуется 20 мин.
Определение ОБМ ССК-методом на кюветочном фотометре КФК-2 (АОЗТ «ЗОМЗ», г. Загорск, Россия) в КДЛ МОНИКИ выполнялись следующим образом. В пробирки вносили 1,25 профильтрованной мочи, добавляли 3,75 мл 3% раствора ССК, перемешивали. Через 5 мин пробу фотометрировали на фотометре КФК-2 на длине волны 600 нм против холостой пробы в кювете. Холостой пробой являлась смесь, состоящая из 1,25 мл мочи и 3,75 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Концентрацию белка рассчитывали «в ручную» по калибровочному графику, для построения которого готовили разведения стандартного раствора альбумина с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 г/л в растворе хлорида натрия. Выполнение полуколичественных анализов ОБМ при помощи тест-полосок проводилось на анализаторе Uriscan Pro (YD Diagnostics, Южная Корея) согласно инструкции по применению тест-полосок [172] и руководству по эксплуатации анализатора.
Похожие диссертации на Разработка и внедрение в клиническую практику специализированного фотометра с набором реагентов для количественного анализа общего белка в моче
