Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Хитозан и его производные в процессах иммобилизации ферментов 9
1.2 Взаимодействие глутарового альдегида с аминосодержащими полимерами 34
2. Методическая часть 59
2.1 Объекты исследования 59
2.2 Реактивы 59
2.3 Методы исследования 61
3. Основные результаты и их обсуждение 67
3.1 Закономерности процесса сшивки хитозана ГА 67
3.1.1 Влияние рН на равновесие в растворах хитозана и глутарового альдегида 67
3.1.2 Квантовохимическое моделирование реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с глутаровым альдегидом 79
3.1.3 Изучение кинетики взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом 87
3.1.4 Обсуждение механизма взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом 97
3.1.5 Изучение свойств гелей хитозана, сшитого глутаровым альдегидом 102
3.1.6 Изучение процесса сшивки хитозана глутаровым альдегидом в присутствии белка 107
3.2 Получение ферментсодержащих полимерных материалов на основе хитозана с использованием реакции сшивки ГА 112
3.2.1 Получение микрокапсул на основе хитозана, сшитого ГА 112
3.2.2 Иммобилизация ферментов на тканевом носителе с использованием гелеобразующих систем на основе хитозана 114
3.2.2.1 Изучение иммобилизации органофосфатгидролазы на волокнистом материале с использованием полимерных композиций на основе хитозана 117
3.2.2.2 Использование гелеобразующих систем на основе хитозана и сульфата хитозана для получения волокнистого биокатализатора, содержащего трипсин 128
3.2.3. Использование гелеобразования в системе хитозан-ГА для модификации фермента при получении пленок на основе полигидроксибутирата 139
Выводы 142
Литература 143
- Хитозан и его производные в процессах иммобилизации ферментов
- Влияние рН на равновесие в растворах хитозана и глутарового альдегида
- Обсуждение механизма взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом
- Использование гелеобразования в системе хитозан-ГА для модификации фермента при получении пленок на основе полигидроксибутирата
Введение к работе
Актуальность темы. Разработка биологически активных полимерных систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых материалов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, экологии и других областях. Полисахарид хитозан обладает комплексом уникальных свойств, таких как биосовместимость, гидрофильность, биологическая и сорбционная активность, биоразлагаемость. Растворимость хитозана в разбавленных водных растворах кислот, наряду с волокно- и пленкообразующей способностью и наличием реакционно-способных аминогрупп облегчает модификацию этого полимера и переработку его в полимерные изделия.
Модификация бифункциональными сшивающими реагентами, наиболее распространенным из которых является глутаровый альдегид (ГА), позволяет получить на основе хитозана пленки, микрокапсулы, гранулы, волокна, нерастворимые в воде, но обладающие высокой влагоудерживающей способностью гидрогели и композиционные материалы и зафиксировать в их структуре лекарственные соединения, ферменты и другие белки. Несмотря на то, что ГА широко используется в различных областях, и в особенности в биохимии, не сформировалось единого мнения о механизме реакции ГА с белками, а тем более с хитозаном. Изучение закономерностей взаимодействия хитозана с ГА позволит определить перспективы использования этой системы для получения новых материалов для биотехнологии и медицины, а также выбрать оптимальные условия их получения.
Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры аналитической, физической и коллоидной химии МГТУ в рамках госбюджетной темы № 06-635-42 единого заказ-наряда Федерального агенства по образованию и гранта молодых ученых МГТУ, а также в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006гг.» (Комплексный проект ЖС-КП.4/002),
Целью работы являлось установление закономерностей и формирование представлений о механизме взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом, и разработка на этой основе различных ферментсодержащих полимерных систем.
Для достижения поставленной цели необходимо было изучить влияние рН на свойства растворов хитозана и ГА, провести квантовохимическое моделирование реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с различными формами ГА, изучить кинетику реакции сшивки хитозана ГА и кинетику гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, исследовать свойства образующихся гелей, а также разработать метод получения на основе гелеобразующих систем ферментсодержащих полимерных материалов.
Научная новизна полученных результатов. В диссертационной работе впервые показано, что особенности реакции с ГА в растворах хитозана связаны с наличием равновесных форм ГА, соотношение между которыми может меняться в зависимости от рН, а также высокой степенью протонирования аминогрупп хитозана, снижающей их реакционную способность в реакции с карбонильными группами.
Показано, что увеличение реакционной способности ГА в реакции с аминогруппами хитозана, наблюдаемое с ростом рН, связано с увеличением подвижности протона при соседнем с карбонильной группой атоме углерода, играющего ключевую роль в реакции альдольной конденсации, предшествующей образованию его а,(3-ненасыщенных производных.
На основании анализа значений тепловых эффектов реакции взаимодействия глюкозамина и триглюкозамина с различными формами ГА, полученных методом квантовохимического моделирования, установлено, что наиболее вероятным является взаимодействие депротонированных аминогрупп с сопряженными с С=С-связью карбонильными группами олигомернои формы ГА.
Предложен механизм взаимодействия хитозана с ГА, заключающийся в образовании альдиминнои связи, инициирующей рост олигомернои цепи на хитозане, и последующей межмолекулярной сшивке путем кротоновой конденсации олигомерных цепей модифицированного хитозана или (в зависимости от рН) взаимодействия с аминогруппами макромолекул немодифицированного хитозана.
Установлена взаимосвязь состава ферментсодержащих
гелеобразующих систем на основе хитозана или его сульфатированного производного, степени связывания белка и каталитических характеристик иммобилизованных в полимерных материалах различной физической формы ферментов трипсина и органофосфатгидролазы.
Практическая значимость. Показана возможность использования реакции сшивки хитозана и его производных для получения ферментсодержащих полимерных систем разной физической формы (гидрогелей, пленок микрокапсул, волокнистых биокатализаторов). Разработан метод иммобилизации органофосфатгидролазы путем гелеобразования белоксодержащей композиции на основе сульфата хитозана и ГА, позволяющий сохранить до 70% активности фермента. Разработка «Волокнистый биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксинов» получила Золотую медаль на Всероссийской выставке научно - технического творчества молодежи (Москва, ВВЦ, 2005г).
Исследование процесса сшивки хитозана ГА показало присутствие в образцах сшитого хитозана продуктов кротоновой конденсации ГА, содержащих карбонильные группы и С=С-связи, что заставляет рекомендовать исключить использование реакции с ГА для разработки материалов, контактирующих с живыми тканями.
Публикации Основные результаты диссертации изложены в 12 печатных работах, в том числе, 1 патенте, 4 статьях в научных журналах, 8 -в сборниках статей и материалах конференций.
Апробация работы Результаты работы были представлены на: VII и VIII Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана » (СПб-Репино, 2003; Казань, 2006), XII Internetional Workshop on bioencapsulation (Spain, Vitoria, 2004), Всероссийских научно-технических конференциях «Современные технологии и оборудование текстильной промышленности (Москва, 2004 и 2005), Международной научно-практической конференции «Современные энергосберегающие тепловые технологии» (Москва, 2005), XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2006),
III Всероссийской научной конференции «Физико-химия процессов переработки полимеров» (Иваново, 2006), V Международной конференции «Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов» ( Москва, 2006).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 117 наименований. Работа содержит 17 таблиц и 52 рисунка.
Хитозан и его производные в процессах иммобилизации ферментов
Хорошей предпосылкой для создания на основе хитозана биопрепаратов медицинского назначения явилось уникальное сочетание его биофункциональных и сорбционных свойств [3]. Основным принципом предварительного выбора хитозана в качестве компонента или носителя при разработке медицинских изделий и препаратов стали свойственные ему бактериостатическая активность [4] и подверженность ферментативной деструкции, т.е. биодеградабельность.
Химическое строение хитозана (2) и, прежде всего, наличие аминогрупп, позволяет использовать хитозан для иммобилизации ферментов и других белков путем ковалентного присоединения с использованием бифункциональных соединений или за счет электростатических связей между протонированными аминогруппами и отрицательно заряженными группами белка [5]. Хитозан обладает хорошими пленко- и даже волокнообразующими свойствами [6], поэтому на его основе можно получать изделия медицинского назначения и хемосорбенты различной физической формы: пленки, волокна, микрокапсулы, гранулы и включать в их структуру биологически активные соединения [6-8]. Следует отметить, что число публикаций, посвященных получению на основе хитозана различных, в особенности капсулированных, форм белков за последние десять лет приближается к тысяче, поэтому в настоящей главе мы ограничимся рассмотрением ряда работ, наиболее полно иллюстрирующих, каким образом и какие особенности строения и свойств хитозана, структуры и свойств материалов на его основе позволяют эффективно использовать этот полисахарид для иммобилизации белков.
Для лечения ран в настоящее время применяется широкий спектр полимерных раневых покрытий, в частности, пленочные покрытия, губки, пены, гидроколлоидные и гидрогелевые покрытия [8]. Для их получения используются различные синтетические, искусственные и природные полимеры: поливиниловый спирт [9], коллаген [8], желатин [10], целлюлоза и альгинаты [11, 12], хитозан и карбоксиметилхитин [13-15]. Для ускорения лечения ран в 1-й фазе раневого процесса в составе покрытий используют протеазы.
Наиболее простым способом получения пленочного раневого покрытия на основе хитозана является формование пленок из совместных растворов белка и хитозана в растворе уксусной кислоты. Слабокислотные растворы хитозана имеют рН 3,0-4,0, что часто совпадает с оптимумом стабильности некоторых белков. В работе [16] показана эффективность использования раневого покрытия на основе хитозана, полученного путем формования через щелевую фильеру пленок из смешанного раствора хитозана и плацентарного белка а-фетопротеина в 1%-ном растворе уксусной кислоты. Однако в работе [17] показано, что такие пленки водорастворимы, и в модельных условиях во внешний раствор белок переходит уже в течение 30 минут. Кроме того, в таких условиях в хитозановые пленки нельзя включать ферменты, которые нестабильны в кислой среде. Статья [15] посвящена изучению некоторых закономерностей иммобилизации ферментов, обладающих протеолитической активностью, - террилитина (ТЕР) и коллагеназы панкреаса краба (КЛК) в пленках и губках производного хитина - его карбоксиметилового эфира (КМХТ) (3).
Отмечается, что преимуществом КМХТ как полимерного носителя лекарственных препаратов является растворимость в воде практически во всем интервале рН, что позволяет варьировать рН формовочных композиций от 4,0 до 8,5, а также наличие в его макромолекулах широкого набора функциональных групп (гидроксильные, амино- и карбоксильные). Кроме того, гидролизуемость КМХТ лизоцимом определяет возможность его биодеградации в ходе метаболических процессов в организме.
Для получения формовочных ферментсодержащих композиций к водному раствору КМХТ с заданным значением рН при перемешивании приливали водный раствор фермента. Пленки КМХТ формовали путем испарения растворителя из 3-10%-ных ферментсодержащих водных растворов полимера после предварительного обезвоздушивания. Губки получали лиофильным высушиванием замороженных формовочных композиций.
Определение уровня физико-механических свойств пленок из КМХТ, проведенное по деформационно-прочностным кривым, позволило заключить, что все пленки обладают прочностью, достаточной для их практического применения (23-54 МПа). Однако эластичность пленок, полученных в отсутствие пластификатора, недостаточна. Улучшение этого показателя достигали пластификацией пленок глицерином, который в количестве 10-20% от массы КМХТ вводили в его ферментсодержащий раствор. Повышение эластичности сопровождалось некоторым снижением прочностных свойств. Исследование влияния рН формовочного раствора КМХТ на активность иммобилизованных КЛК и ТЕР показало, что оптимум активности иммобилизованной КЛК (рН0ПТ) находится в интервале рН 7,0-7,5 при рНоПТ нативной КЛК 7,8; оптимум активности иммобилизованного ТЕР приходится на интервал рН 6-7, в то время какрН-оптимум нативного фермента составляет 7,6.
Изоэлектрическая точка (рі) КЖ составляет 2,5, а ТЕР - 4,6. Поскольку рНопт рІ в обоих случаях, макромолекулы ферментов в выбранных условиях заряжены отрицательно. Это создает возможность иммобилизации этих ферментов за счет возникновения ионных связей с макромолекулами полимера-носителя. Однако, как ни странно, авторы отмечают, что при рН0ПТ ионных связей между макромолекулами ферментов и носителем не образуется, и КЛК и ТЕР оказываются включенными физически в структуру пленок и губок КМХТ, и считают, что подтверждением этого является отсутствие влияния степени замещения по СООН-группам, изменяющейся от 0,7 до 1,3, на активность иммобилизованного ТЕР. На наш взгляд, для такого вывода необходимо было проведение специальных исследований.
В этой же работе было проведено исследование влияния молекулярной массы производного хитозана на активность иммобилизованных ферментов. КЖ и ТЕР были иммобилизованы в пленках, полученных на основе низко- (60 кДа) и высокомолекулярного (6000 кДа) КМХТ. Было показано, что относительная активность ТЕР, иммобилизованного с помощью низко- и высокомолекулярного КМХТ составляет 95 и 80% от активности нативного фермента, а КЛК - 80 и 50% соответственно. Снижение активности иммобилизованных ферментов с возрастанием молекулярной массы полимера-носителя связано, по мнению авторов, с меньшей доступностью для субстрата макромолекул ферментов, иммобилизованных на более объемных и протяженных макромолекулах КМХТ в случае высокомолекулярного полимера. Кроме того, отверждение пленки, сопровождающееся концентрированием формовочных растворов, может привести к перестройке поликомплексов, образуемых макромолекулами КМХТ и ферментов, более прочному связыванию ферментов с носителем, и, соответственно, снижению их активности. Это объяснение представляется более убедительным. Кроме того, авторы говорят об образовании полиэлектролитных комплексов, что предполагает ионные взаимодействия, наличие которых авторы отрицали ранее. В работе [15] не содержится сведений о кинетике выделения ферментов из пленок и губок, однако учитывая, что никаких реагентов, снижающих растворимость КМХТ, не использовалось, существенного пролонгирования действия ферментов при таком методе иммобилизации не могло быть достигнуто.
При создании эффективных материалов для пролонгированной энзимотерапии проводятся исследования взаимосвязи состава многокомпонентных полимерных композиций и свойств полученных на их основе полимерных систем с разным типом биологической активности. Так, в работе [18] были изучены закономерности взаимодействия производных хитозана (его карбоксиметилового эфира, сульфата хитозана и карбоксиметилхитина) с весьма часто используемой в качестве белкового компонента панкреатической протеиназой трипсином и антимикробным веществом пефлоксацином.
Влияние рН на равновесие в растворах хитозана и глутарового альдегида
Растворимость хитозана в водных растворах определяется степенью протонирования его аминогрупп. Для растворения хитозана обычно используют водные растворы одноосновных кислот, причем наиболее часто - 1-5%-ные растворы уксусной кислоты (для приготовления раствора большей концентрации необходимо увеличивать и концентрацию раствора уксусной кислоты). Кроме того, растворимость хитозана зависит от его молекулярной массы.
Для определения рН-пределов растворимости хитозана разной молекулярной массы эквиконцентрированные (2%-ные) растворы хитозана в 2%-ной уксусной кислоте были турбодиметрически оттитрованы 0,1М раствором NaOH с определением рН точки помутнения. Результаты титрования показали, что область рН-стабильности растворов хитозана увеличивается с уменьшением его молекулярной массы (рисунок 6) и может достигать 6,8 для полимера с молекулярной
Традиционные представления объясняют рН-зависимость реакции сшивки белков ГА снижением реакционной способности протонированных аминогрупп в реакции с карбонильными группами. При этом было показано, что в кислых средах реакция практически не идет, а сшивка наблюдается при рН, больших изоэлектрической точки белка (рН р1), когда аминогруппы белка депротонированы. рН растворов хитозана, используемых для получения микрокапсул, пленок и волокон, составляет 3,5-4,0, тем не менее сшивка хитозана ГА протекает с высокой скоростью, что позволяет предположить наличие в растворах хитозана в уксусной кислоте депротонированных аминогрупп. Существующее в растворах хитозана равновесие между протонированной и депротонированной формами аминогрупп может быть записано в виде схемы (17):
Очевидно, что при уменьшении концентрации ионов водорода равновесие будет смещаться влево, поэтому с повышением рН количество аминогрупп в депротонированной форме увеличивается.
На рисунке 7 представлена кривая потенциометрического титрования 1%-го раствора хитозана с молекулярной массой 180 кДа в 0,1 М НС1 0,1 М раствором NaOH. На кривой титрования имеется два перегиба, соответствующих скачкам титрования соляной кислоты и протонированных аминогрупп хитозана - NHs-Протонированные аминогруппы титруются в широком диапазоне рН. Значение рКь при а=1 составляет 3,4, а при а=0 рКь=8,3.
Зависимость рК аминогрупп хитозана от степени их протонирования (рисунок 8), полученная на основании данных рисунка 7, позволяет оценить число депротонированных аминогрупп в растворах хитозана при любом заданном рН. рН 2%-го раствора хитозана в 2%-ной уксусной кислоте составляет 4,1. Степень протонирования аминогрупп при этом рН а=0,9, т.е. только 10% аминогрупп наиболее реакционноспособны в реакциях нуклеофильного присоединения. Увеличить число депротонированных аминогрупп в растворе хитозана возможно добавлением NaOH в количестве, не приводящем к осаждению полимера. Добавление 0,5 М раствора NaOH в раствор хитозана с ММ 180 кДа до рН=5,6 позволяет, сохранив гомогенность раствора (рисунок 6), увеличить до 47% число депротонированных аминогрупп (рисунок 8). То есть растворимость хитозана в водных растворах кислот позволяет в определенных пределах изменять число депротонированных аминогрупп.
Как показано в главе 1.2 литературного обзора, величина рН может влиять на равновесие между разными формами ГА в его водных растворах: линейным мономерным диальдегидом и его гидратами, циклическим полуацеталем (4) и его олигомерными формами, олигомерными продуктами альдольной и кротоновой конденсации (8, 9), а следовательно, и на реакционную способность ГА в его реакции с аминогруппами хитозана.
Несмотря на использование аналогичных методов (ЯМР-спектроскопия на !Н и С, УФ- и ИК-спектроскопия) и объектов исследования (в подавляющем большинстве работ - это коммерческие растворы ГА) мнения разных авторов о содержании тех или иных форм ГА даже в препаратах 25%-ных водных растворов ГА одной и той же фирмы расходятся.
Для формирования представлений о возможном механизме реакции ГА с аминогруппами хитозана методом ЯМР-спектроскопии были изучены растворы ГА фирмы Merck при рН 3,1, соответствующем рН коммерческого 25%-го водного раствора, рН 4,1, соответствующем рН 2%-го раствора хитозана в 2%-ном водном растворе уксусной кислоты, и рН 5,6, соответствующем максимальному значению рН, при котором сохраняется гомогенность указанного выше раствора хитозана. Образцы готовили путем 10-кратного разбавления коммерческого раствора ГА D20 с добавлением соответствующих количеств К2НР04 и NaH2P04.
На рисунках 9-14 приведены Н и 13С ЯМР-спектры свежеприготовленных растворов 25% ГА, снятые при 325К (52С). При этой температуре сигнал HOD наблюдается около 4.50 м.д. и не перекрывает сигналов ГА. При более низких температурах сигнал HOD проявляется в более слабом поле, например при 2 5 С около 4.80 м.д.
Сложный характер спектров объяснется присутствием в растворе приведенных на схеме основных форм ГА, которые рассмотрены в ряде работ, проанализированных в литературном обзоре [83-88].
Сигналы протонов альдегидных групп (формы А и В) наблюдаются при 9.6 м.д. (рисунок 9) и практически совпадают. Следует отметить что константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) с протонами соседней СН2-группы меньше 1 Гц, что является характерным для альдегидных производных [113]. Триплетный сигнал с КССВ 7.1 Гц протонов ОСНСН2 группы расположен при 2.56 м.д. В 13С ЯМР-спектрах (формы А и В) наблюдаются два сигнала в области 208-209 м.д.
Обсуждение механизма взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом
В результате кинетических исследований процесса сшивки хитозана глутаровым альдегидом в водном растворе уксусной кислоты установлено, что увеличение рН реакционной среды ускоряет реакцию сшивки, что проявляется в уменьшении времени гелеобразования и увеличении скорости роста вязкости раствора хитозана и модуля упругости образующихся гелей.
Одной из причин влияния рН на процесс сшивки, причем наиболее очевидной, является рост концентрации депротонированных аминогрупп. Однако тот факт, что при постоянном рН существенное влияние на скорость гелеобразования и прочность образующихся гелей оказывает концентрация ГА, причем в условиях его многократного избытка свидетельствует о том, что рост концентрации депротонированных аминогрупп не является единственной причиной наблюдаемых зависимостей.
Известно [90], что с увеличением рН сдвигается равновесие альдольной конденсации, ускоряется кротоновая конденсация, и происходит образование продуктов, содержащих ОС-связи, сопряженные с карбонильными группами.
Методом ЯМР на С и Н однозначно такие структуры не были обнаружены ни при рН 4,1, ни при рЫ 5,6. Учитывая установленный нами состав растворов ГА при различном рН (глава 3.1.1) и результаты теоретических расчетов теплот реакций взаимодействия модельных соединений с различными формами ГА (глава 3.1.2), можно предположить, что первой стадией процесса сшивки является образование оснований Шиффа в результате взаимодействия депротонированных аминогрупп хитозана с моно- или дигидратированной формой ГА (21):
Образование оснований Шиффа однозначно подтверждается результатами ИК-спектроскопии. Однако известно, что альдиминные связи в основаниях Шиффа неустойчивы и легко гидролизуются в водной, а тем более в кислой среде, что не происходит в продуктах взаимодействия хитозана и ГА. Было установлено, что модуль упругости сшитых гелей хитозана не изменяется в течение нескольких дней до тех пор, пока испарение растворителя не вызывает его рост.
Известно, что альдиминные связи могут быть стабилизированы явлением резонанса, если они находятся в сопряжении с С=С-связями, и это было подтверждено приведенными в главе 3.1.2 квантово-механическими расчетами: наиболее устойчивое основание Шиффа образуется в реакции взаимодействия глюкозамина с а,Р-ненасыщенными производными ГА. Учитывая уже отмечавшееся отсутствие значимых концентраций продуктов кротоновой конденсации ГА (во всяком случае, в начале реакции) можно предположить, что резонансные структуры, стабилизирующие продукт взаимодействия хитозана с ГА, возникают в последующих стадиях реакции сшивки хитозана. По-видимому, образование альдиминной связи активирует присоединенную молекулу ГА, и инициирует рост олигомерной цепи за счет избыточного содержания ГА в растворе (22).
В пользу этого свидетельствуют полосы поглощения альдегидных групп в ИК-спектрах продуктов взаимодействия хитозана и ГА, а также увеличение ее интенсивности с ростом концентрации ГА. Эта полоса появляется только в образцах хитозана, сшитого при более высоком значении рН (5,6).
Как показано с помощью ЯМР (глава 3.1.1), с увеличением рН возрастает подвижность протона, находящегося в а-положении к карбонильной группе и играющего ключевую роль в реакции альдольной конденсации [115]. Дальнейшие превращения с образованием уже сшитого продукта могут происходить путем конденсации аминогрупп хитозана с карбонильными группами (23) модифицированного хитозана: или путем альдольной и кротоновои конденсации олигомерных цепей модифицированного хитозана (24):
Результаты ИК-спектроскопии не исключают возможность получения как продукта (23), так и (24). Однако как увеличение числа альдегидных групп в образце сшитого при высокой концентрации ГА хитозана (спектр 4, рисунок 27), так и рост модуля упругости геля, полученного в аналогичных условиях (рисунок 26), свидетельствует о том, что при избытке ГА и рН 5,6 в реакционной смеси вероятнее образование соединения (24).
Следует отметить, что длина олигомерных цепей в модифицированном или сшитом хитозане может быть различной, поэтому химическое строение продуктов взаимодействия хитозана с ГА, в особенности полученных в разных условиях, может сильно различаться. С уменьшением рН длина олигомерных цепей и, соответственно, число карбонильных групп должны уменьшаться, что подтверждается результатами ИК-спектров хитозана, сшитого ГА при 4,1.
Результаты квантово-механических расчетов, согласно которым присоединение глюкозамина к а,Р-ненасыщенным производным ГА по ОС-двойным связям с образованием аддуктов Михаэля является весьма вероятным процессом, а также обнаруженная полоса поглощения вторичного амина на ИК-спектрах сшитых образцов показывают также возможность образования при рН 5,6 и избытке ГА соединения (25):
Если приведенные выше рассуждения о механизме реакции верны, то использование диальдегида, не способного к реакции альдольной конденсации не должно приводить к получению стабильных продуктов, а сама эффективность процесса сшивки хитозана должна быть существенно меньше. В качестве такого диальдегида было использовано окисленное производное рибонуклеозида уридина (26):
Установлено, что гелеобразование в растворе хитозана в присутствии диальдегидного производного уридина происходит в 10 раз медленнее, чем в присутствии ГА: в 1,68% растворе хитозана (рН 5,6) в результате сшивки глутаровым альдегидом гель образуется за 6 минут, в то время как при эквимольном количестве окисленного уридина (1,0 моль/моль NH2) система перестает течь лишь через 60 минут. Гель, полученный сшивкой хитозана диальдегидом (26) при рН 4,1, разрушался с образованием прозрачного раствора уже через 3 часа после гелеобразования.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в отсутствие сопряженных с С=С-связями карбонильных групп основания Шиффа образуются значительно медленнее и гидролизуются в кислой среде, что является косвенным подтверждением предложенного механизма реакции хитозана с ГА, включающего протекающую одновременно с реакцией образования оснований Шиффа реакцию конденсации ГА с образованием его а,Р-ненасыщенных производных.
Использование гелеобразования в системе хитозан-ГА для модификации фермента при получении пленок на основе полигидроксибутирата
Биодеградируемые пленки на основе смеси поли-3-гидроксибутирата с поли-є-капролактоном, полученные из их совместного раствора в хлороформе, имеют систему взаимопроникающих пор, пронизывающих всю структуру материала и выходящих на поверхность [38]. Такая структура формируется самопроизвольно в результате фазового разделения в процессе испарения растворителя без экстракции одного из полимеров или добавления водной фазы и является предпосылкой для использования пленок при различных поражениях тканей, способствуя их восстановлению. Для придания таким пленкам протеолитической активности в их структуру могут быть включены ферменты. Однако высокопористая структура таких пленок не способна обеспечить хоть какое-нибудь пролонгирование их действия в водной среде.
С целью регулирования скорости выделения протеолитического фермента из плёночных покрытий хитозан и трипсин в формовочной композиции подшивали глутаровым альдегидом, который добавляли в эмульсию раствора хитозана, содержащего трипсин. Расчетное количество ГА вводили в формовочную композицию в процессе эмульгирования трипсинсодержащего раствора хитозана. В этом случае стадией, лимитирующей взаимодействие аминополисахарида и белка с глутаровым альдегидом, является коалесценция капель совместного раствора хитозана и фермента с каплями раствора ГА. Действительно, при перемешивании эмульсии происходит как коалесценция капель, содержащих хитозан и трипсин, с каплями раствора ГА, так и диспергирование на более мелкие капли. Соотношение скоростей этих процессов определяется вязкостью первичной эмульсии, которая, как было показано в предварительных опытах, для обеспечения коалесценции не должна превышать 10 мПа-с.
Для получения пленок эмульсию выдерживали в течение 30 минут с целью удаления пузырьков воздуха. Формование плёнок происходило в результате испарения растворителя из тонкого слоя обезвоздушенной формовочной композиции, сформированного ее распределением по подложке с помощью щелевой фильеры с регулируемым размером щели. Для анализа ферментативной активности из полученных пленок вырезали участки одинаковой площади, толщину которых измеряли микрометром с точностью ±2 мкм.
Фармакокинетические свойства полимерных покрытий (таблица 17) оценивали по скорости перехода активного трипсина в физиологический раствор в течение 6 часов (рисунок 52). Дальнейшее определение не проводили ввиду возможной инактивации выделившегося из пленок фермента.
Модификацию трипсина проводили в 2%-ном растворе хитозана. В эмульсию добавляли 10%-ный раствор ГА. После испарения растворителя пленки промывали в течение 10 минут дистиллированной водой.
Результаты, полученные в главе 3.2, свидетельствуют о том, что реакция сшивки хитозана и его производных ГА может быть использована для получения ферментсодержащих полимерных материалов различной физической формы, однако присутствие в образцах сшитого хитозана продуктов кротоновой конденсации ГА (глава 3.1) не позволяет рекомендовать ГА для разработки материалов, контактирующих с живыми тканями.
