Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Методы иммобилизации белковых веществ на полимерахносителях для получения эффективных терапевтических систем 8
1.2. Получение и свойства полимерных покрытий, содержащих иммобилизованные антимикробные вещества или ферменты, для хирургиии терапии 22
1.3. Полиэлектролитные комплексы с участием белков 41
2. Методический раздел 52
3. Основные результаты и их обсуждение 58
3.1. Исследование взаимодействия между протеолитическим ферментом протеазой С, альгинатом натрия и антимикробным поликатиономв водных растворах 58
3.2. Изучение взаимосвязи состава и свойств формовочных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биологически активные вещества и модифицирующие добавки 85
3.3. Исследование влияния состава формовочных композиций на свойства поливинилспиртовых пленочных материалов, содержащих совместно иммобилизованные протеазу антимикробный поликатион и модифицирующие добавки 93
Выводы 126
Литература 129
Приложения 144
- Получение и свойства полимерных покрытий, содержащих иммобилизованные антимикробные вещества или ферменты, для хирургиии терапии
- Полиэлектролитные комплексы с участием белков
- Изучение взаимосвязи состава и свойств формовочных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биологически активные вещества и модифицирующие добавки
- Исследование влияния состава формовочных композиций на свойства поливинилспиртовых пленочных материалов, содержащих совместно иммобилизованные протеазу антимикробный поликатион и модифицирующие добавки
Введение к работе
Стремительно растущий уровень медицинских технологий является движущей силой развития смежных отраслей науки и техники, в частности химии биополимеров. Успех многих хирургических операций, особенно заканчивающихся дерматопластикой, во многом зависит от послеоперационного ухода за раной, т.е. от качества перевязочных средств, функции которых в настоящее время значительно расширились и заключаются не только в защите раны от внешних воздействий. В связи с этим задача создания раневых покрытий, обладающих комбинированным лечебным действием, одним из наиболее перспективных типов которых являются покрытия на основе синтетических и натуральных полимеров, содержащие иммобилизованные ферменты и антимикробные или иные лекарственные вещества, уже на протяжении многих лет остается актуальной. Целесообразность создания покрытий с таким комплексом свойств является патогенетически обоснованной, т.к. в первой фазе раневого процесса необходимо подавление воспаления и очищение раны от некротических масс. Преимущества иммобилизованных форм ферментов над нативными известны, наиболее важные из них — повышение стабильности и уменьшение иммунологической и аллергической реакций организма за счет понижения способности модифицированного фермента стимулировать образование антител и реагировать с ними [1].
Сложность одновременной иммобилизации фермента и биологически активного вещества другой химической природы, в частности антимикробного, заключается в том, что она может привести к инактивации протеазы. В этой связи большой интерес представляет изучение возможности использования мягких способов иммобилизации, к числу которых относятся комплексообразование с полиэлектролитами. Исследование закономерностей формирования структуры и взаимосвязи состава, структуры и свойств
полимерных композиций, содержащих фермент и биологически активное вещество другого типа, позволит разработать способы получения полимерных материалов с комплексным биологическим действием и расширить арсенал имеющихся перевязочных средств.
Цель работы заключалась в разработке научных принципов создания пленочных материалов с протеолитическим и антимикробным действием^ а также в изучении физико-химических и медико-биологических свойств созданных раневых покрытий.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
изучить процесс комплексообразования между протеолитическим ферментом протеазой С и полиэлектролитами (альгинатом натрия и солями полигексаметштенгуанидина) в водной среде;
исследовать влияние степени ионизации и молекулярной массы полимерного антимикробного вещества, а также состава полимерной композиции на активность, стабильность и рН-оптимум протеолитического фермента;
изучить влияние введения добавок биологически активных и модифицирующих веществ на реологические свойства формовочных композиций;
изучить влияние состава формовочных растворов на свойства поливинилепиртовых пленок, содержащих протеазу С, полимерное антимикробное вещество и модифицирующие добавки: кинетику десорбции антимикробного вещества, кинетику инактивации иммобилизованной протеазы С, устойчивость к стерилизации и физико-химические свойства;
изучить медико-биологические свойства материалов с комплексной биологической активностью.
При выполнении экспериментальной части работы были использованы химические методы анализа, спектрофотометрия, нефелометрический метод, метод потенциометрического титрования, реологический метод, электронная сканирующая микроскопия и медико-биологические исследования.
Научная новизна, В работе впервые:
сформулированы представления о закономерностях интерполимерной реакции в многокомпонентных водных растворах, содержащих биологически активные вещества различного строения, как реакции замещения, при протекании которой состав и свойства образующихся комплексов, содержащих протеазу С, определяется степенью ионизации полимерного поликатиона, его молекулярной массой и соотношением компонентов;
установлено влияние введения фермента, антимикробных веществ и сшивающего реагента на структуру растворов поливинилового спирта и, как следствие, их вязкость и энергию активации вязкого течения, обусловленные особенностями конформации как индивидуальных компонентов, так и их комплексов и химическими реакциями, протекающими в системе;
показана возможность регулирования показателей активности и стабильности иммобилизованной в поливинилепиртовой пленке протеазы С и кинетики десорбции антимикробного вещества за счет изменения состава формовочных композиций и структуры пленки;
установлен колебательный характер кинетических кривых паропропускания через пленки, содержащие иммобилизованные биологически активные вещества, свидетельствующий о наличии в структуре пленки внутренних напряжений.
Практическая значимость: показаны пути регулирования биологических (протеолитической и антимикробной активности) и физико-механических
(степени набухания, паро проницаемости) свойств поливинил спиртовых пленочных материалов с пролонгированным действием. Полученные данные о способах получения и свойствах полимерных композиций, содержащих протеазу С и полиэлектролиты, являются основой для создания полимерных пленочных материалов медицинского назначения с заданным комплексом биологических свойств.
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 13 работ. Объем и структура диссертации: диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 128 ссылок. Работа содержит 14 таблиц и 39 рисунков.
Получение и свойства полимерных покрытий, содержащих иммобилизованные антимикробные вещества или ферменты, для хирургиии терапии
В связи с развитием медицинских технологий возрастает необходимость наличия широкого ассортимента перевязочных средств, обладающих различными видами биологической активности и позволяющих осуществить управление раневым процессом дифференцированно. Их разработка осуществляется как за счет введения в покрытие биологически активных препаратов, так и выбора природы покрытия, активно влияющего на процесс заживления ран и обеспечивающего дозированное и пролонгированное выделение лекарственных веществ в рану.
Достоинствами полимерных покрытий, содержащих иммобилизованные биологически активные вещества, являются устойчивость лекарственных форм при хранении, стабильность препарата в покрытиях, пролонгирование его действия, уменьшение токсического действия на ткани, котпролируемое дозированное выделение антимикробных веществ и ферментов, создание местной терапевтической концентрации препарата, сокращение расхода последних за счет уменьшения суммарной дозы.Исключительно важное значение имеет физическая форма полимерного покрытия. Удобной формой покрытия является гидрофильная пленка, которая плотно соединяется со стенками раны [37]? в результате чего биологически активные вещества десорбируются в раневое отделяемое, оказывая необходимое терапевтическое действие. Однако при этом очень важно, чтобы пленка обладала низкой адгезией во избежание травмирования раны во время перевязок.
Иммобилизация протеолитических ферментов в структуре плёнок из биосовместимых полимеров в процессе формования является одним из наиболее эффективных способов получения материалов медицинского назначе ния [38]. Этот способ иммобилизации имеет ряд преимуществ перед другими способами получения таких материалов. Он прост по исполнению, не требует химического модифицирования полимера-носителя; плёнки, в структуру которых ферменты включаются в процессе формования, могут быть получены по непрерывной технологической схеме на оборудовании, применяющемся для формования обычных плёнок, В структуру полимерного материала при необходимости может быть введено большое количество фермента. Совместно с протеолитическим ферментом может быть иммобилизовано биологически активное вещество другого типа. Варьирование состава фермент-содержащей формовочной композиции и условий формования позволяет регулировать структуру полимерного материала и свойства иммобилизованного фермента. Необходимо, однако, учитывать, что в процессе приготовления формовочного раствора и формования плёнок возможна инактивация ферментов. Степень инактивации при прочих равных условиях (тип плёнкообразующего полимера, растворителя и так далее) должна существенно зависеть от структуры макромолекулы фермента, строения его активного центра, а также степени очистки фермента.Г1ВС - один из наиболее распространенных синтетических водорастворимых полимеров, имеющий широкое применение в медицине, В работе [39] с целью разработки дренирующего покрытия на раны с оптимальными свой ствами исследована кристаллическая структура сеток ПВС в набухшем и дегидратированном состоянии в зависимости от химического состава полимера и условий сшивки. Установлено наличие надмолекулярных структур во вторичных гидрогелях ПВС в зависимости от плотности сшивки полимера, его химического состава и условий синтеза. Исследованы токсические свойства пленок на основе ПВС, предназначенных для лечения ран и ожогов, включающие один из антисептиков: йод, диоксидин, катапол. Пленки получали из растворов пленкообразующего ПВС, содержащих антисептик, сухим спосо- бом. Изучено влияние состава сополимеров винилового спирта с винилпир-ролидоном и винилформалем на образование комплексов с иодом и характеристики пленок, полученных на их основе. Показана возможность варьирования содержания бактерицидного комплекса иода при изменении природы звеньев сомономера. Исследована динамика выхода антисептиков из пленок в модельных условиях и установлен эффект их пролонгированного действия. Медико-биологические исследования в опытах на животных показали эффективность пленок при закрытии ожоговых, микробно-загрязненных и гнойно-некротических ран- Установлено, что сшитый ПВС стабилен при хранении, незначительное изменение его физико-химических свойств под действием у-лучей позволяет без ухудшения эксплуатационных характеристик стерилизовать изделия из него у-облучением (доза 20-25 кГр).
В работе [40] из композиций на основе ПВС, содержащих различные компоненты (желатин, протеолитический фермент папаин, коллаген и натриевую соль карбоксим етил целлюлозы), методом полива получали пленки. Компоненты вводили в 8%-ные водные растворы ПВС в количестве 10% от массы полимера. Экспериментально установлено, что при введении наполнителей в ПВС происходит упрочнение материала независимо от природы наполнителя и температуры формования образцов. Однако пленки, сформованные при низкой температуре, обладают более низкими прочностными и деформационными характеристиками. Введение наполнителей приводит к увеличению прочности материала, но в меньшей степени, чем при формовании пленок при температуре 20 С. Повышение прочности, по мнению авторов [40], связано с образованием межмолекулярных связей между молекулами ПВС и наполнителя.Исследование процессов набухания пленок ПВС с различными наполнителями показало, что для материалов, полученных при температуре 20 С, степень набухания незначительно отличается от таковой для пленок из чисто го ПВС. Степень набухания пленок, сформованных при низкой температуре, значительно больше, чем чистого ПВС, Такое модифицирование приводит к структурированию полимера, при котором он из растворимого состояния переходит в нерастворимое. При этом формируется пространственная сетка, частота которой определяется составом композиции и видом наполнителя. Наибольшая степень набухания характерна для образцов, содержащих в своем составе соединения белковой природы (желатин, папаин, коллаген). Введение этих компонентов увеличивает степень набухания материалов на 20 -25% по сравнению с чистым ПВС.
В работе [41] формованием из водного раствора получена пленка из ПВС» содержащая террилитин (перевязочный материал "Терриплен"). При изучении влияния состава раствора, условий формования на свойства иммобилизованного террилитина, установлено, что протеолитическая активность фермента незначительно снижается при стерилизации плёнки у - лучами и практически не изменяется при последующем хранении в течение двух лет. Медико-биологические испытания Терриплена показали его эффективность при лечении гнойных ран (сроки очищения и заживления уменьшились в 2 раза при значительном сокращении расхода фермента на курс лечения). Однако в некоторых случаях наблюдалось вторичное нагноение ран под плёнкой.Описан метод иммобилизации фермента в полимерной матрице, основанный на циклическо-криолитическом воздействии на систему полимер (ПВС) - биологически активное вещество [42]. Показано, что степень иммобилизации и свойства материала молено регулировать изменением темпера-турно-временного режима. Пленочные материалы, полученные таким способом, обладали биологической активностью с сохранением высокого каталитического эффекта и расширением температурного диапазона их действия.
Полиэлектролитные комплексы с участием белков
Значительный научный и практический интерес представляют взаимодействия ПЭ с белками, поскольку указанные взаимодействия играют чрезвычайно важную роль как в природных, так и в биотехнологических системах. Например связывание белков с нуклеиновыми кислотами позволило сделать существенный шаг в генном регулировании, а в технологических процессах белок - ПЭ взаимодействия могут быть использованы для выделения белков, иммобилизации ферментов и доставки лекарственных препаратов в организме [86],Неионные интерполимерные взаимодействия, например гидрофобные или водородные связи, могут существенно повышать устойчивость комплексов линейных ПЭ. Благодаря неионным взаимодействиям образование поликомплексов глобулярных белков с полианионами и поликатионами может происходить даже при таких значениях рН, при которых знаки заряда белковых глобул и цепей ПЭ совпадают [87].
Имеются многочисленные литературные данные, свидетельствующие о влиянии синтетических ПЭ на свойства индивидуальных белков. Изучение механизма взаимодействия линейных ПЭ и белков является весьма трудной задачей, что, в первую очередь, обусловлено сложной структурой белков с неоднородным распределением заряженных групп в макромолекуле. Вместе с тем, можно считать установленным, что в образование комплексов ПЭ с белками определяющий вклад вносят кооперативные электростатические взаимодействия, в которые вовлекаются ионогенные группы, находящиеся на поверхности белковых глобул. Впервые закономерности и количественные характеристики подобных взаимодействий были установлены на примере линейных ПЭ [88]. Подходы, развитые при исследовании реакций между противоположно заряженными водорастворимыми линейными синтетическими ПЭ, были успешно применены и для изучения взаимодействия между синте тическим ПЭ и белком [87].
Изучение комплекс ообразования с участием различных белков и синтетических ПЭ позволило установить, что в системе бычий сывороточный альбумин — полидиметилдиаллиламмоний хлорид в зависимости от таких параметров, как рН, ионная сила и стехиометрия комплексы могут иметь форму интраполимерсвязанных белков, растворимых агрегатов и коацерватов или преципитатов [86].
Методом капиллярного электрофореза и динамического светорассеяния [86] изучена структура и дана характеристика комплекса, образованного по-листиролсульфонатом натрия и бычьим сывороточным альбумином или р-лактоглобулином, рассчитана плотность связывания белков с ПЭ. В данном случае под плотностью связывания подразумевается количество белковых макромолекул, связанных с элементарным звеном полимера. Как известно [86], при связывании белков с ПЭ может наблюдаться кооперативность. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с полистиролсульфона-том натрия антикооперативно, а р-лактоглобулина - кооперативно, что проявляется более ярко при увеличении ионной силы и рН раствора. Эти отличия, по мнению авторов, могут быть обусловлены различным балансом между электростатическим отталкиванием и гидрофобным взаимодействием при изменении рН и ионной силы раствора. Бычий сывороточный альбумин более гидрофобен, чем р-лактоглобулин, и его гидрофобность повышается с увеличением рН, в то время как гидрофобность р-лактоглобулина относительно постоянна в исследуемой области рН. Отмечается» что причина разницы в кооперативном связывании бычьего сывороточного альбумина и р-лактоглобулина неясна.
Был также установлен факт снижения связывающей способности бычьего сывороточного альбумина при увеличении длины цепи полистиролсуль-фоната натрия, в то время как для р-лактоглобулина наблюдалась обратная зависимость. Авторы объясняют наблюдаемые закономерности тем, что более длинная полимерная цепь имеет большее количество смежных (близко расположенных) связывающих мест, что приводит к усилению кооператив-ных эффектов. Таким образом, с увеличением длины цепи ПЭ возрастает плотность связывания для кооперативной системы ([J-лактоглобулин — поли-стиролсульфонат натрия) и снижается для антикооперативной (бычий сывороточный альбумин — полистиролсульфонат натрия).
В работе [89] исследована способность к взаимодействию отрицательно заряженных глобулярных белков (бычьего сывороточного альбумина, ингибитора трипсина сои) с линейными синтетическими поликатионами (бромидом поли-Ы-этил-4- винилпиридиния, хлоридом поли-N, N-диметиламмония) с образованием отрицательно заряженных водорастворимых комплексов. Отмечено, что белки выступают в роли лиофилизирующих компонентов. Показано, что комплексы формируются при условии, что количество отрицательных зарядов белка превышает общее число положительных зарядов поликатионов в растворе. Найдено, что в составе комплексов на одну цепь поликатиона приходится такое количество белковых глобул, которое обеспечивает их растворимость, но не большее. Методом тушения флуоресценции изучена конкурентная реакция, сопровождающаяся переходом глобулы белка от одного комплекса к другому. Показано, что скорость реакции велика даже в разбавленном водном растворе и еще более увеличивается при добавлении соли.
Растворимые ПЭК интересны для исследователей по нескольким причинам. Во-первых, образование растворимых комплексов предшествует обширной агрегации происходящей в системе белок - ПЭ,, поэтому знание их структуры и особенностей образования - необходимое условие для понимания дальнейших процессов- Во-вторых, растворимые ПЭК могут быть изучены с использованием многих экспериментальных методов, включая турбиди метрию, флуоресцентную спектроскопию, динамическое и статическое светорассеяние, электрофоретическое светорассеяние и другие.Методом тушения флуоресценции и турбидиметрического титрования в работе [90] выявлены факторы, влияющие на диссоциацию и фазовые разделения в растворах комплексов, образованных флуоресцентно меченым поли-метакрилатным анионом и глобулярными белками - лизоцимом, химотрипси-ногеном и рибонуклеазой. Обнаружена общность в поведении таких комплексов и водорастворимых нестехиометричных ПЭК, состоящих из разноименно заряженных полиионов. Продемонстрирована возможность использования подходов} развитых при исследовании нестехиометричных ПЭК, для получения растворимых белок - ПЭК, претерпевающих фазовое разделение в заданных диапазонах рН и ионной силы растворов.
При изучении интерполимерных реакций (ИПР) белковых макромолекул а- или р-лактальбумина и лизоцима [91] было установлено, что смешение водных растворов белков приводит к усилению мутности и появлению осадка. Методом жидкостной хроматографии доказано образование комплексного соединения. Преобладающим продуктом данной реакции оказался осадок, однако в надосадочном слое было обнаружено небольшое количество и растворимого комплексного соединения. Авторы показали, что взаимодействие лизоцима с а- или Р-лактальбумином носит неспецифический электростатический характер.
Для констатации факта комплексообразования с участием протеаз используют и другие, не менее информативные, показатели, например, электрохимические характеристики. Так, в работе [92] установлено, что смешение растворов полиакриловой кислоты и а-хим отри псина в кислой среде сопровождается понижением рН раствора, что свидетельствует об образовании комплекса- Определена область рН (интервал рН от 3,0 до 5,0), в которой трипсин образует с полиметакриловой кислотой ПЭК, растворимость кото
Изучение взаимосвязи состава и свойств формовочных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биологически активные вещества и модифицирующие добавки
Формовочные композиции, пригодные для технологической переработки с целью получения медицинских покрытий, должны удовлетворять следующим требованиям: быть кинетически устойчивыми (по меньшей мере в течение суток) при температуре 25±5 С; не инакгивировать иммобилизованный фермент; содержать лекарственные компоненты в дозах, близких к терапевтически необходимым.
Как указывалось выше [39], одним из типов пленкообразующих полимеров, применяемых для этих целей, является поливиниловый спирт. В то же время, одной из трудностей при реализации технологического процесса получения ПВС пленочных материалов является структурирование формовочных композиций полимера, что объясняется несколькими причинами; большой концентрацией ПВС (примерно 11%), необходимой для получения пленки с удовлетворительными физико-механическими характеристиками; сильным межмолекулярным взаимодействием, обусловленным наличием полярных заместителей - гидроксильных групп; невысоким термодинамическим сродством растворителя (воды) к ПВС.
Поэтому крайне важным являлось изучение структурно-механических свойств формовочных композиций, содержащих биологически активные вещества и модифицирующие добавки. Для получения биологически активных пленочных материалов использовали водно-спиртовые растворы ПВС, содержащие ПР, полимерное АМВ и модифицирующие добавки. На стадии приготовления раствора ПВС в него добавляли временный пластификатор -этиловый спирт, снижающий вязкость раствора полимера на стадии его приготовления [120]. Водно-спиртовой раствор ПВС хорошо совмещался с вод ными растворами биологически активных компонентов. Исследуемые формовочные композиции представляют собой сложные системы, которые содержат агрегаты сравнительно прочно связанных макромолекул ПВС, глобулярный белок, линейный антимикробный полимер с различной степенью асимметричности (соли ПГМГ). Композиция может также содержать жест-коцепной полисахарид и добавки сшивающего реагента. В большинстве случаев они однофазны, а при использовании ПГМГ(Ф) представляют собой кинетически устойчивые дисперсные системы, в которых дисперсной фазой являются гидратированиые частицы нерастворимого комплекса ПР и антимикробного полимера.
Введение в раствор ПВС полимеров, термодинамически совместимых с ним, разрушает структуру исходного раствора и приводит к образованию новой, что отражается на реологических характеристиках композиций. Как видно из даїшьіх, представленных в табл. 5, при введении в водно-спиртовой раствор ПВС добавок фермента происходило снижение начальной вязкости и энергии активации вязкого течения Еа.Введение соли ПГМГ в отсутствие фермента или одновременно фермента и полимерного антимикробного вещества в количестве 0,1% приводило к тому же результату. Этот эффект обусловлен, по-видимому, образованием в растворе смешанной структуры, включающей ПВС, белок и соль ПГМГ, с более слабым взаимодействием между ее элементами. Увеличение начальной вязкости раствора по сравнению с не содержащим добавок наблюдалось лишь при увеличении количества ПГМГ(Х) до 0Э5%. Аналогичный эффект антипластификации [120] при получении формовочного раствора на основе ПВС при введении альбумина наблюдали авторы [121]: при содержании альбумина в растворе не более 5% происходило снижение начальной вязкости по сравнению с исходной полимерной композицией, а при введении в нее 10% белка - повышение. По-видимому, наблюдаемый факт является следствием изменения структуры раствора, содержащего ПВС, фермент и соль ПГМГ, в результате возникновения новой системы водородных связей между макромолекулярными компонентами, уменьшения свободного объема и ограничения молекулярной подвижности. Этот вывод подтверждается данными, полученными при введении в этот раствор дополнительно АЛГ, что приводило к снижению начальной вязкости вследствие разрушения прежней структуры в результате ИПР между ПР, солью ПГМГ и АЛГ. При этом следует отметить, что во всех рассматриваемых случаях Еа вязкого течения уменьшалась по сравнению с раствором ПВС без добавок, что подтверждает предположение об изменении структуры формовочных композиций.
При введении в систему ПГМГ(Ф) начальная вязкость снижалась в большей степени, чем растворов, содержащих ПГМГ(Х) [122], что можно объяснить конформациоиными отличиями макромолекул АМВ, имеющих, как указывалось выше, различную степень ионизации. Слабо ионизированные макромолекулы ПГМГ(Ф) имеют компактную конформацию, а ПГМГ(Х) - значительно более высокую степень асимметрии. В присутствии обоих полимеров образуется новая структура раствора, характеризующаясяменьшей энергией активации вязкого течения. Различия в структуре композиций объясняются большей доступностью функциональных групп молекул ПГМГ(Х) из-за особенностей их конформации, приводящей к формированию новой системы межмолекулярных связей и уменьшению эффекта снижения вязкости. При этом комплексы с участием ШМГ(Ф) можно рассматривать как "вкрапления" в объеме формовочной композиции. Эта разница нивелируется с добавлением в систему АЛГ (табл. 5).
Введение тетрабората натрия, напротив, приводило к увеличению начальной вязкости формовочных композиций (табл. 6) вследствие образования хелатных соединений [123], а значит, уменьшения сегментальной подвижности ЛВС и свободного объема. Кроме того, в формовочных композициях, содержащих АЛГ, возможно образование интра- и интермолекулярных связей в результате взаимодействия полисахарида и тетрабората натрия [124], что также накладывает ограничения на кинетическую подвижность компонетов в системе.Как видно из данных, представленных на рис. 20, вид кривых течения зависит от характера соли ПГМГ, входящей в формовочную композицию. Для систем с ПГМГ(Ф) область неньютоновского течения достигается при более
Исследование влияния состава формовочных композиций на свойства поливинилспиртовых пленочных материалов, содержащих совместно иммобилизованные протеазу С, антимикробный поликатион и модифицирующие добавки
Как было показано в гл. 3.2, структура формовочных композиций заметно изменяется при изменении их состава. Поскольку при формовании пленки в принятых условиях отсутствуют большие напряжения сдвига, ее структура в значительной степени определяется структурой формовочной композиции. Следовало ожидать поэтому, что полимерные наполнители, оказывая воздействие на структуру, изменят и комплекс свойств полимерного материала.
Исследуемые в работе системы являются довольно сложными, они содержат, по меньшей мере, два гидрофильных полимера, что повышает роль диффузионного фактора в кинетических исследованиях. Известно, что полимерные компоненты изменяют свои объемы при контакте с водной средой и в результате возможных взаимодействий (в данном случае электростатических, образования водородных связей). Во время инкубации гидрофильной пленки в модельной водной среде в результате диффузии воды происходит интенсивная гидратация компонентов, пластификация матрицы и увеличение подвижности сегментов. От характера и уровня изменения структуры зависит степень проявления антимикробной и ферментативной активности. Другим фактором, определяющим активность, являются электростатические взаимодействия между матрицей, содержащей фермент и полиэлектролитные добавки, и субстратом.
Стабильность биологически активных пленок исследовали при малом гидромодуле (10-20), наиболее приближенном к условиям эксплуатации материалов, когда невозможна быстрая полная релаксация в системе, что и позволило выявить существенные отличия в кинетике десорбции БАВ и инактивации фермента в пленках разного состава. Как известно [ИЗ], в результате иммобилизации ферментов их активность в отношении различных субстратов может изменяться по-разному. Исследование активности в отношении казеина и нерастворимого коллагена показали, что протеолитическая и коллагенолитическая активности иммобилизованной ПР изменяются примерно одинаково и составляют 68-129% от на-тивной (табл. 8).Включение в полимерную матрицу наряду с ферментом и АМВ полисахарида позволило получить пленки, в которых фермент сохранял не только высокую активность, но и удовлетворительную стабильность в отношении тепловой инактивации и стерилизации (рис, 22, 23, табл. 9),Как следует из приведенных данных (табл. 9), относительная активность ПР в результате сойм мобилизации с ПГМГ(Х) и АЛГ находится в интервале 90-108 %э что связано как с особенностями модификации белка, так и с надмолекулярной структурой пленочного материала.
Использование в композиции ПГМГ(Х) позволяет сохранить более высокий уровень ОА и стабильности иммобилизованного фермента, чем в композиции с ПГМГ(Ф). Включение в состав пленок АЛГ повышает ОА фермента в обоих случаях, но снижает его стабильность в присутствии ПГМГ(Х)(рис.22,23).Невысокая начальная относительная активность пленок с 111МГ(Ф), связана, очевидно, с более плотной их структурой. Однако уже через 1-3 ч инкубации в физрастворе при 37 С пленки пластифицируются, и активность возрастает примерно на 25% и через 24 часа практически не снижается (рис.23 кривые 3,4).
Введение в состав формовочной композиции, содержащей ПР и ПГМГ(Х), тетрабората натрия иммобилизованного в структуру пленки, не приводит к стабилизации фермента (табл. 10). Характер кинетических кривых инактивации пленок как и в случае с пленками, не содержащимитетраборат натрия (рис. 24), свидетельствует о протекании в системе неравновесных процессов, что связано с возникновением сшивок между маіфомолекулами ПВС и возможностью разрушения межмолекулярных лабильных связей.ри использовании в качестве АМВ ГГГМГ(Ф) пленки практически не изменяют свою активность в течение суток, оставаясь на уровне 22-33% от нативной (рис. 23), что может свидетельствовать о различной структуре пленок и разном механизме проявления активности.Таким образом, в отличие от кинетики инактивации ферментов в полимерных композициях, кинетика инактивации пленок чаще всего не могла быть описана характерными для инактивации ферментов экспоненциальными уравнениями [125] вследствие сложности происходящих в системе процессов. Вид кинетических кривых на рис, 22-24 свидетельствует о неодно-значности протекающих процессов и их зависимости от состава пленки. Однако анализ общей картины позволяет сделать вывод, что при увеличении продолжительности контакта пленки с модельной средой в результате диффузии воды в гидрофильный образец увеличиваются сегментальная подвижность, свободный объем полимерной матрицы и, как следствие, диффузионная проницаемость пленки для субстрата и частиц комплекса, что и приводит к более полному проявлению активности.
Было изучено также влияние на свойства ферментеодержащих пленочных материалов совместного введения в формовочную композицию тетрабо-рата натрия и АЛГ- Как видно из представленных данных (табл. 10), относительная активность ПР, иммобилизованной совместно с АЛГ, тетраборатом натрия и ПГМГ(Х), остается на высоком уровне. При этом, однако, несколько снижается величина остаточной активности. В то же время при использовании в качестве АМВ ПГМГ(Ф) совместное введение в формовочный раствор АЛГ и буры хотя и приводит к снижению начальной активности, однако обеспечивает повышение остаточной активности фермента. Этот показатель зависит от количества вводимого АЛГ, С увеличением количества полисахарида ОА и остаточная активность увеличиваются (табл. 10).Важная информация, позволяющая оценить структуру и свойства разрабатываемых пленочных материалов может быть получена при изучении процесса набухания.
Известно, что структура пленок, полученных формованием из раствора по сухому способу, практически монолитна и характеризуется отсутствием микропористости. Однако наличие в составе формовочных композиций бе локсодержащих комплексов, обладающих поверхностно-активными свойствами, может привести к изменению структуры пленки, о чем свидетельствуют, в частности, приведенные выше данные реологических исследований и данные о зависимости ферментативной активности пленочных материалов от состава формовочной композиции.
Согласно данным, полученным при изучении процесса набухания ПВС пленок, содержащих БАВ (табл. 11) введение добавок приводит к таким структурным изменениям полимерной матрицы, которые облегчают диффузию молекул воды и степень набухания пленки. При этом степень набухания пленок, содержащих ГТГМГ(Х), значительно превосходит этот показатель пленок, в состав которых включен ПГМЦФ). Лишь введение полисахарида 101Очевидно, что наблюдаемый факт является свидетельством процесса формирования отличных друг от друга структур пленочных материалов, определяющее значение для которого имеет тип АМВ. Результаты исследований реологических характеристик (гл.3.2) дают основание полагать, что структура пленки с участием развернутых макромолекул ПГМГ(Х) должна характеризоваться более равномерным их распределением в ПВС матрице, приводящим к нарушению системы водородных связей, облегчению диффузии воды и увеличению степени набухания пленки по сравнению с пленкой, в составе которой находятся "вкрапления" ГТГМГ(Ф), в меньшей степени разрушающие систему связей в полимере.
При введении тетрабората натрия в раствор, содержащий ПР и ПГМГ(Х) (п,п. 5-7) вследствие образования межмолекулярных сшивок происходит некоторое снижение степени набухания. В то же время в пленках, полученных из формовочных композиций, содержащих одновременно с тет-раборатом натрия АЛГ (п. п. 8,9), очевидно, преобладают эффекты нарушения структуры, т.к. степень набухания таких пленок увеличивается. Это косвенно подтверждается данными по изучению реологических свойств (гл.3.2.): добавки тетрабората натрия в формовочную композицию, содержащую АЛГ, приводили
