Введение к работе
Актуальность работы. Выделение и очистка белков аффинными методами, основанными на предварительном in vitro моделировании сложных биоспецифических взаимодействий с участием интересующего объекта, имеющих место в живой природе, играют ключевую роль к&к в решении фундаментальных, так и практических задач, например, при создании лекарственных препаратов. Активаторы плазминогена, а именно, стрепто-киназа (СК), урокиназа (УК)., про-урокиназа (про-УК), тканевый активатор плазминогена (ТАП) и стафшокиназа (САК), представляю! собой группу протеиназ, разрешенных для использования в медицинской практике в качестве тромболитических средств в терапии острых сердечко-сосудистых заболеваний. В настоящее время наиболее перспективными способами получения лекарственных препаратов на основе белков являются генно-инженерные методы. При этем важнейшей проблемой является разработка как аналитической, так и препаративной методологий обеспечения биотехнологических процессов. 1Ъамотно построенные методы позволяют сократить время и экономически затраты на разработку всего процесса в целом, включая стадию полученш аффинного сорбента.
Одним из самых современных и перелективных носителей, удовлетворяющих всем требованиям, выдвигаемык к разделительным стационарным фазам, являются макропористые монолитные сорбенты на основе сополимера глщидилметакрилата и этшенгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА), выполненные в форме цельных дисков. Морфологические свойства данных носителей, т.е. структура пороюго пространства, определяющая стерические и гидродинамические особенности осуществляемых на их основе межфазовых процессов, позволяют проводить биосепа-рационные процессы с использованием высоких скоростей потока подвижной фазы. Резкое сокращение времени разделения становится возможным из-за практически полного отсутствия диффузионных ограничение h "Шальному межфазовому переносу вещества. Именно это обстоятельст в0 =*чволяет не только эффективно разделять вещества разных классов, н< таю.= Нійцюдать практически неискаженную кинетику биоспецифически межд-)лекулхрных взаимодействий. Метод динамического разделени BemetB с использованием данных сред получил название высокоэффе тивног монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ).
важным этапом любого разделительного процесса, основанно) на оиоліической Комплемент<арности (аффинности), прежде всего, явл ется выбс наиболее эффективною лиганда. Традиционно, в качестве а финных л "андов используют макромолекулы белков, обладающих пр родньімісР1,;твомк выделяемому продукту (белку). Однако, несмотря н
высокую специфичность подобных лигандов, неустойчивость структуры белка, а также высокая стоимость таких аффинных партнеров лимитируют их применение. Поэтому быстрый и достоверный поиск более дешевых и стабильных синтетических лигандов - пептидов - является одной из важнейших задач при разработке методов анализа и выделения белков.
В соответствии со всем вышесказанным, поиск новых аффинных партнеров с целью использования их для эффективного скоростного выделения таких ценных генно-инженерных лекарственных препаратов, как активаторы плазминогена, а также разработка новых способов создания аффинных сорбентов являются, несомненно, актуальными проблемами.
Цель исследования. Целью данного исследования являлась разработка методов построения аффинных сепарационных систем с участием пептидных лигандов, обеспечивающих биоспецифическое связывание интересующих белков (активаторов плазминогена). При этом введение в структуру сорбента адсорбционных центров осуществлялось двумя способами, а именно, ковалентной иммобилизацией предварительно синтезированного пептида, а также оригинальным методом твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) непосредственно на поверхности макропористой монолитной стационарной фазы, используемой далее в аффинной хроматографии. В цели работы также входило сравнение свойств получаемых типов сорбентов, осуществляемое методом скоростной аффинной хроматографии. В конечном счете, данное исследование определило выбор наиболее эффективного аффинного лиганда для решения практической задачи -скоростного выделения активаторов плазминогена методом ВЭМДХ.
Для достижения заданной цели были поставлены и решались следующие задачи:
выбор пептидов, комплементарных к интересующим белкам, на основе анализа природных биологических взаимодействий с участием данных белков;
синтез выбранных пептидных лигандов традиционным твердофазным методом и их физико-химический анализ; получение аффинных сорбентов путем ковалентной иммобилизации биолигандов на поверхности ГМА-ЭДМА монолитных сорбентов;
разработка оригинального метода твердофазного пептидного синтеза на поверхности монолитных сорбентов и детальный анализ качества получаемых пептидных соединений; использование данного метода для получения сорбентов с пептидными лигандами, необходимыми для выделения активаторов плазминогена;
определение количественных параметров биокомплементарного взаимодействия активаторов плазминогена (СК, про-УК и ТАП) с различными лигандами с использованием метода скоростной аффинной ВЭМДХ;
сравнение характеристик аффинных пар, образованных с участием лигандов, синтезированных и иммобилизованных на поровой поверхности монолитного сорбента;
исследование процессов выделения ТАП, СК и про-УК из многокомпонентных смесей.
Научная новизна работы. Применение монолитных сорбентов для высокоэффективных сепарационных процессов является одним из современных и оригинальных научно-практических направлений. Достоинством макропористых монолитных ГМА-ЭДМА сред оказалась уникальная возможность их использования как стационарных фаз для аффинной ВЭМДХ, так и носителей для твердофазного синтеза пептидов. Это обстоятельство и определяет научную новизну работы, которая заключается в:
разработке оригинального метода построения аффинных сепарационных систем на основе макропористых сорбентов монолитного типа с использованием метода прямого твердофазного синтеза пептидов, выполняющих функцию биоспецифических лигандов; хроматографическом моделировании и количественном сравнении биологических взаимодействий на примере одного из механизмов фибринолиза;
разработке и оптимизации скоростного одностадийного метода выделения биологических продуктов (активаторов плазминогена) из многокомпонентных смесей.
Практическая значимость работы. В рамках работы проведена серия
важных для дальнейшего практического применения экспериментов, направленных на оптимизацию процессов аффинной сепарации. Разработанный метод получения аффинных сорбентов посредством прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности монолитных носителей позволяет сократить время, традиционно требуемое для этих целей. Это обстоятельство, в свою очередь, делает возможным быстрый количественный скрининг ряда пептидных лигандов с целью выбора наиболее эффективного для аффинного выделения того или иного продукта. Показана возможность прямого выделения активаторов плазминогена с использованием полученных аффинных сорбентов из клеточных супернатантов (генно-инженерный продукт) и модельных смесей белков методом ВЭМДХ.
Основные положения, выносимые на защиту.
Макропористые полиметакрилатные носители монолитного типа, имеющие оптимальную поровою структуру, могут быть использованы в качестве твердой фазы для синтеза пептидов; Дцсорбционно-активные матрицы, полученные путем прямого твердофазного синтеза пептидов на поверхности монолитных ГМА-ЭДМА носителей, могут успешно использоваться для скоростной аффинной хроматографии;
На примере одного из путей фибринолиза показано, что метод ВЭМДХ может быть применен для in-vitro моделирования различных этапов метаболических процессов, происходящих через образование биоспецифических комплексов природных комплементарных молекул;
Выбранные на основе анализа природных взаимодействий пептиды образуют биоспецифические комплексы с исследуемыми активаторами плазминогена;
Полученные аффинные матрицы могут быть использованы для прямого и эффективного выделения активаторов плазминогена из многокомпонентных смесей.
Работа выполнена в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (гранты DFG KR 1076/6-1 и ННО-РАН 436 RUS 113/555/0); при участии лаборатории №4 ИВС РАН и Института прикладной микробиологии Университета сельскохозяйственных наук Вены, а также при финансовой поддержке фирмы BIA Separations, d. о. о. (Любляна, Словения).
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и всероссийских симпозиумов: 2(f International Symposium on the Separation and Analysis of Proteins, Peptides and Polynucleotides (Любляна, Словения, 2000), 2Sh and 27h International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (Маастрихт, Нидерланды, 2001, и Ницца, Франция, 2003), 2nd and Jd International Symposium on Separation in the BioSciencies (Прага, Чехия, 2001, и Москва, Россия, 2003), 75й Meeting ofthe European Society for Animal Cell Technology (Гранада, Испания, 2003), Ґ International/28h European Peptide Symposium (Прага, Чехия, 2004), /' Monolith Summer School: Applications in Biochromatography, Bioconversion and Solid Phase Synthesis (Порто-Рош, Словения, 2004), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, Россия, 2003) и Всероссий-
ском симпозиуме "Хроматография ихроматографические приборы "(Москва, Россия, 2004).
Кроме того, результаты диссертационной работы также обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, 2003) и на научном семинаре «Монолитные сорбенты: Новейшая генерация носителей для биотехнологии и медицины», проводимом ФГУП «НПО«Микроген» (Москва, 2004). Работа представлялась на VII ежегодном конкурсе молодых ученых ИВС РАН (Санкт-Петербург, 2004), где заняла 1-е место.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, включающих 4 полнотекстовые статьи в журналах Journal of Chromatography (серии А и В), Journal of Biotechnology и Journal of Peptide Science, а также 10 тезисов устных и стендовых докладов. Одно краткое сообщение находится в печати
Структура работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка использованной литературы. Работа изложена на 154 страницах, включает 24 таблицы, 31 рисунок и библиографию из 178 источников.
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д. х. н. Тенниковой Т. Б., а также д. х. н. Власову Г. П. к. х. н. Платоновой Г. А., к. х. н. Королькову В. И., к. х. н. Гурьянову И. А., н. с. Дорош М. Ю. и н. с. Дитковской И. Б. (все из ИВС РАН), к. х. н. Новикову А. В. (ИАП РАН) за сотрудничество при выполнении работы. Автор благодарит также зарубежных партнеров господина А. Тарре, доктора G. Kretzmer и доктора С. Rasper (Ганновер, Германия), профессора A. Jungbauer (Вена, Австрия), а также компанию BIA Separations, d. о. о. в лице доктора А. Strancar и доктора A. Podgornik (Любляна, Словения).
