Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Химическое строение и биологические свойства полисахаридов и их производных 8
1.1.1. Химическое строение и биологические свойства гепарина 9
1.1.2. Способы получения и биологические свойства гепариноидов... 17
1.1.3. Способы получения и биологическая активность производных полисахаридов хитина и хитозана 21
1.2. Ферментативный гидролиз полисахаридов 32
2. Разработка условий получения низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов и исследование их строения и свойств 38
2.1. Ферментативный гидролиз сульфата хитозана и гепарина 40
2.1.1. Характеристика исходных полисахаридов, ферментных препаратов и методов оценки протекания ферментативного гидролиза 40
2.1.2. Результаты скрининговых исследований ферментативного гидролиза сульфата хитозана 44
2.1.3. Ферментативный гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii 47
2.1.4. Ферментативный гидролиз гепарина ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii 58
2.1.5. Ферментативный гидролиз полисахаридов с использованием ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii 63
2.2. Сульфатирование низкомолекулярных образцов хитозана 74
2.3. Исследование антикоагулянтной активности препаратов сульфата хитозана и гепарина 89
3. Методический раздел 98
3.1. Исходные материалы и химические реагенты 98
3.2. Методы синтеза 98
3.3. Методы анализа 100
Выводы 103
Список литературы 105
Приложение 121
- Способы получения и биологическая активность производных полисахаридов хитина и хитозана
- Характеристика исходных полисахаридов, ферментных препаратов и методов оценки протекания ферментативного гидролиза
- Ферментативный гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii
- Исследование антикоагулянтной активности препаратов сульфата хитозана и гепарина
Введение к работе
Биополимеры - хитин, хитозан, а также некоторые их эфиры и соли широко применяются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности. Это связано с биологической активностью данных полимеров, их биосовместимостью и биоразрушаемостью, иммуномо-дулирующим, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, гемостатическим действием и низкой токсичностью. Особый интерес представляют сульфатированные производные хитозана (СХ) как наиболее близкие структурные аналоги природного антикоагулянта крови гепарина (Г), дефицит и высокая стоимость которого стимулирует поиск и синтез его заменителей.
В последнее время большое внимание уделяется исследованию и созданию лекарственных форм на основе низкомолекулярных гепаринов (молекулярная масса 3-6 кД) и других мукополисахаридов, поскольку такие препараты обладают лучшими фармакокинетическими свойствами и меньшей токсичностью.
Ферментативный гидролиз - это мягкий и эффективный способ снижения молекулярной массы полимеров. Для гидролиза гепарина обычно используют гепариназы, но высокая стоимость и отсутствие гепариназ на отечественном рынке обусловливают необходимость поиска других более доступных ферментов, пригодных для получения низкомолекулярных гепарина и гепари-ноидов. Такими ферментами могут быть папаин и лизоцим, а также ферментные препараты целловиридин и Streptomyces kurssanovii, которые с успехом используются для снижения молекулярной массы хитина и хитозана. Принципиальная возможность ферментативного гидролиза сульфата хитозана и гепарина указанными ферментами обусловлена отсутствием у них узкой субстратной специфичности.
В разработке проблемы создания низкомолекулярных форм гепарина ведущее положение занимают американские (R. Linhardt, U. Desai), итальянские (В. Casu, G. Torn), французские (A. Frydman) и японские (S. Hirano) уче-
ные. Российскими учеными В. Макаровым (ГНЦ РАМН), А. Гамзазаде (ИНЭ-ОС РАН) внесен существенный вклад в исследования, направленные на создание эффективных заменителей гепарина. Данная диссертация является продолжением проведенных ранее на кафедре ТХВ МГТУ совместно с ГНЦ исследований и первой из работ, посвященной получению низкомолекулярных форм сульфата хитозана.
Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры технологии химических волокон МГТУ и лаборатории Центра "Биоинженерия" РАН при финансовой поддержке РФФИ (код проекта 02-04-49850), ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения" и грантом молодых ученых МГТУ.
Целью работы являлось исследование возможности получения низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина, а также изучение строения и биологических свойств полученных препаратов. Для достижения поставленной цели было необходимо:
-изучить возможность получения низкомолекулярных сульфатов хитозана и гепарина с использованием метода ферментативного гидролиза неспецифическими доступными ферментами и ферментными препаратами;
-осуществить выбор наиболее эффективного ферментного препарата и оптимальных условий его действия в нативном и иммобилизованном состоянии;
-провести сульфатирование низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами;
-охарактеризовать биологическую активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина, полученных различными методами.
Научная новизна работы
Установлены закономерности ферментативного гидролиза сульфатированных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина неспецифиче-
ским ферментным комплексом (ФК) из Streptomyces kurssanovii, в том числе в иммобилизованном состоянии, главными из которых являются следующие:
ферментативный гидролиз полисахаридов наиболее эффективным ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii протекает преимущественно по эндомеханизму;
сульфат хитозана как более специфический субстрат, содержащий ио-ногенные группы основного и кислотного типа, гидролизуется с большей скоростью, чем гепарин, содержащий лишь кислотные группы;
иммобилизованный ферментный комплекс по эффективности не уступает нативному, что может быть связано с фиксацией на носителе в предложенных условиях наиболее активных компонентов ферментного комплекса и минимальным изменением конформации активного центра.
При исследовании сульфатирования низкомолекулярных хитозанов показано, что низкомолекулярный хитозан, полученный ферментативным гидролизом, протекающим, главным образом, в аморфных областях, обладает наиболее упорядоченной надмолекулярной структурой и наименьшей реакционной способностью.
Впервые показана общая для гепарина и сульфата хитозана закономерность преимущественного проявления анти Ха активности с понижением молекулярной массы препаратов.
Практическая значимость работы
Предложены условия и разработан лабораторный регламент получения низкомолекулярных препаратов гепарина с молекулярной массой 3-6 кД с использованием доступного и дешевого ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii. Полученные препараты проявляют выраженную анти Ха активность, и имеют соотношение анти Ха и антитромбиновой активности на уровне коммерческих образцов низкомолекулярного гепарина. Наработаны образцы низкомолекулярного гепарина и сульфата хитозана, необходимые для проведения исследований в тестах in vivo, в том числе в композициях и в виде микрокапсулированных форм.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 22 рисунка, библиографию из 145 наименований.
Способы получения и биологическая активность производных полисахаридов хитина и хитозана
Хитин - природный полисахарид, структурный аналог целлюлозы. Он входит в состав панцирей морских ракообразных (крабов, креветок, криля), содержится в скелетах насекомых, клеточных стенках грибов, некоторых водорослях и т. п. По ряду физико-химических свойств он сходен с целлюлозой, однако наличие в молекуле ацетамидных групп придаёт этому полиаминоса-хариду особые и очень ценные в практическом отношении свойства [65].
Хитин характеризуется биологической активностью, радиационной устойчивостью, способностью к волокно - и плёнкообразованию, что обусловливает его широкое применение. Макромолекулы хитина представляют собой длинные неразветвлённые цепи, построенные из остатков N-a4eTroi-D-глюкозамина, соединённых р-1,4 гликозидной связью. Макромолекулы хитина построены аналогично целлюлозе, но отличаются от неё тем, что у С-2 атома вместо гидроксильной имеется ацетамидная группа [66]. Химическое строение макромолекулы хитина.
Наиболее доступные источники хитина - отходы переработки гидробио-нтов и продукты микробиологического производства. В сырье хитин содержится в виде комплексов с другими веществами - белками, липидами, красителями и т. д. Средний молекулярный вес хитина составляет 500-1000 кД. В природном полимере небольшая часть N-ацетилглюкозных звеньев дезацетилирована до глюкозаминных. Полностью дезацетилированный продукт - поли[(1-4)-2-амино-2-дезокси-Р-0-глюкоза] называется хитозаном. Обычно полного дезацетилирования достигнуть не удаётся, и в состав макро-молекул хитозана входит небольшое количество N-ацетилглюкозаминных звеньев.
Хитозан получают дезацетилированием хитина действием 45-50% раствора гидроксида натрия при повышенной температуре. При этом протекает гидролитическая деструкция, поэтому значение молекулярной массы хитозана ниже, чем хитина. У разных образцов хитозана она колеблется в пределах 100-700 кД. Хитин и хитозан состоят из кристаллических и аморфных областей, содержание которых зависит от природного сырья. Наиболее высокая степень кристалличности (55-60%) характерна для хитина краба [67]. Хитин встречается в 3 полиморфных модификациях: а, Р и у. Наиболее распространена а-модификация, в которой цепи полимера антипараллельны и плотно упакованы. Параметры кристаллической решетки ос-хитина: а=0.476, в=1.030, с=1.885 нм. Хитин и хитозан способны сорбировать значительное количество воды (2-5 молекулы на 1 мономерное звено), которая находится в аморфных областях полимеров [68,69]. Хитозан легко растворяется в водных растворах как минеральных, так и органических кислот. Лучшими растворителями для хитозана являются растворы муравьиной кислоты [70].
Биополимеры - хитин, хитозан, а также некоторые их эфиры и соли (сульфохитин, сульфохитозан, карбоксиметилхитин и др.) уже нашли широкое практическое применение и возможности их использования в народном хозяйстве и медицине расширяются. Это связано с биологическими свойствами данных биополимеров, их биосовместимостью и биоразрушаемостью, имму-номоделирующим, адъювантным, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, гемостатическим действием и при этом низкой токсичностью.
В последнее время появилось огромное количество публикаций и патентов по использованию хитозана и его модификаций в качестве ранозажив-ляющих средств. Так, комплексный препарат "Полимед", состоящий из хитозана и низкомолекулярных антисептиков, предназначен для лечения ран, ожогов, псориаза, экзем. В модельных экспериментах на мышах и крысах установлено, что при наружном применении "Полимед" обладает ранозаживляю-щей и противоожоговой активностью [71]. Мазь "Автохит" содержит полный набор аминокислот, производные ДНК, хитозан, антисептики и другие компоненты. Отмечается ее положительный эффект при ожоговых поражениях, язвах, герпесе и других заболеваниях [71].
Одним из быстроразвивающихся направлений применения хитозана является производство на его основе пищевых биологически активных добавок (БАД). Известны такие хитозансодержащие добавки как "Хитан", "Детокс-Хит", "ХитоКор" и многие другие. БАД "Хитан" обладает способностью не только снижать массу тела больных, страдающих ожирением, но и оказывает влияние на липидные показатели и уровень сахара в крови, что дает возможность применения препарата людям с сердечно-сосудистыми заболеваниями и сахарным диабетом [72]. Биологическая добавка "Хитозан Альга плюс", созданная на основе мелкодисперсного порошка крабового хитозана и бурых морских водорослей, повышает неспецифическую резистентность организма к действию неблагоприятных факторов среды, при этом обладает противоязвенным и противоопухолевым действием [73].
Характеристика исходных полисахаридов, ферментных препаратов и методов оценки протекания ферментативного гидролиза
Использованные в работе в качестве исходных образцы гепарина и сульфата хитозана (табл.2.1) представляют собой порошкообразные продукты, полученные распылительным высушиванием их водных растворов. Образцы СХ, синтезированные по разработанному на кафедре ТХВ способу [85], различаются по молекулярной массе и содержанию серы, антикоагулянтная активность их составляет 50-70 Ед/мг, а токсичность 2-3 г/кг [85]. Коммерческие образцы гепарина различаются по источнику их получения и уровню активности (см. раздел 2.3).
Ферменты папаин и лизоцим представляют собой сухие порошки белого цвета. Папаин (3.4.22.2) фермент, относящийся к классу растительных про-теиназ, содержит в молекуле один остаток цистеина, обладающий высокой реакционной способностью. Молекулярная масса папаина 20,7 кД. Характерной чертой структуры папаина является наличие "кармана", идущего от поверхности в глубь молекулы, по стенкам которой группируются гидрофобные группы [104]. Активный центр фермента располагается внутри этого кармана, куда проникает субстрат и где протекает ферментативная реакция. Считается, что существенное значение для проведения каталитического акта имеет гидрофобное окружение, в котором оказываются реагирующие вещества. Папаин обладает широкой специфичностью и его активность составляет порядка 12000 Ед/г (Merck).
Лизоцим (3.2.1.17)- гликозидная гидролаза из куриного яйца, гидроли-зующая 1,4-р-М-ацетилглюкозаминилолигосахариды с расщеплением глико-зидных связей между 4 и 5 остатками Сахаров с нередуцирующего конца. Молекулярная масса лизоцима 14,6 кД, активность 10 Ед/г (Реанал, Венгрия).
Для гидролиза сульфата хитозана и гепарина использовали не только индивидуальные ферменты, но и препараты, состоящие из комплекса ферментов, действующих параллельно или последовательно в соответствии со своей субстратной специфичностью, в частности, промышленный ферментный препарат целловиридин Г20Х и ферментный хитинолитический комплекс (ФК) из Streptomyces kurssanovii. Целловиридин Г20Х (Бердский завод биологических препаратов) содержит целлюлазы, ксиланазы, р-глюканазы и геммицеллюла-зы. Представляет собой порошок бежевого цвета с целлюлолитической активностью 2000 Ед/г. ФК из S. kurssanovii, использованный в виде фильтрата культуральной жидкости с концентрацией по белку 330 мкг/мл (удельная активность - 0,58 Ед/мл), содержит, как минимум, четыре хитиназы (42,40,26 и 20 кД), хитозаназу, N-ацетилглюкозаминидазу и протеазу [107]. Известно, что О-гликозид - гидролазы (3.2.1.) катализируют гидролитическое расщепление О-гликозидной связи по смешанному механизму. Детальное изучение основных закономерностей гидролиза хитозана этим ферментным комплексом [108] позволило предположить, что возможность гидролиза хитозана хитинолити-ческим комплексом может быть связана как с отсутствием узкой субстратной специфичности хитиназ, так и с присутствием в исходном хитозане остаточных N-ацетильных групп. Гепарин, сульфат хитозана, как и хитозан, не являются специфическими субстратами для данного ферментного комплекса, однако наличие в сульфате хитозана свободных и небольшого количества ацети-лированных аминогрупп может приводить к образованию продуктивного фермент - субстратного комплекса с хитозаназой, а возможно и с хитиназой. Очевидно, что в случае гепарина гидролиз будет более затруднен, так как в отличие от сульфата хитозана, в гепарине присутствуют остатки идуроновых и глюкуроновых кислот. Однако в нем также имеется небольшое количество ацелированных и свободных аминогрупп, следовательно, отдельные участки в цепи макромолекул могут быть доступными для ферментов.
Наряду с гидролизом нативным ферментом был проведен гидролиз ферментным комплексом в иммобилизованном состоянии. Иммобилизацию ферментного комплекса проводили по реакции азосочетания с аминоариль-ным производным силохрома по методике [132].
Методики проведения гидролиза, выделения и анализа продуктов, описаны в разделе 3, однако, здесь представляется целесообразным привести обоснование выбора отдельных методов, поскольку низкомолекулярные полимеры экспериментально трудно выделяются из растворов традиционными методами осаждения и фракционирования, например, дробным переосаждением. Кроме того, использование нативных ферментов и ферментных комплексов для проведения гидролиза полисахаридов осложнено необходимостью отделения их от гидролизатов.
Среди современных методов разделения сложных по составу смесей, в том числе водно-солевых растворов полимеров и полимергомологов, - диализ, ультрафильтрация, гельпроникающая хроматография - последний, на наш взгляд, наиболее успешно конкурирует с другими. Широкий набор гелей с различной пористостью в сочетании с УФ-фотометрией и кондуктометрией в качестве методов контроля за концентрацией компонентов в элюате обеспечивают быстрое и качественное разделение компонентов, молекулярные массы которых различаются в широких пределах. Учитывая, что в случае использования неиммобилизованных ферментов, реакционная смесь - гидролизаты -содержат соли буферных смесей, низкомолекулярные и олигомерные продукты гидролиза полисахаридов, и очевидно, крупные интерполимерные комплексы полисахаридов с белками ферментных препаратов, целесообразность использования именно гельпроникающей хроматографии очевидна.
Ферментативный гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii
Известно, что каталитическая активность ферментов очень чувствительна к воздействию различных факторов, и максимальную активность они проявляют в определенном температурном интервале и в среде с определенной кислотностью. Представленные нарис. 2.7 зависимости характеристической вязкости гидролизованных сульфатов хитозана от рН среды (кривая 1) и температуры процесса (кривая 2) подтверждают это.
Наличие в сульфате хитозана ионогенных групп различной природы и, главным образом, высокое содержание сильнокислых сульфатных групп обусловливает его растворимость при любых значениях рН. В щелочных и нейтральных средах сульфат хитозана представляет собой полианион, а в кислых его макромолекулы содержат как анионные -S03 , так и катионные -№1з+ группы, которые могут взаимно нейтрализоваться и образовывать внутренние соли. Формирование внутренних солей в области рН 5-6 приводит к образованию более компактного макромолекулярного клубка и минимальному значению вязкости разбавленных растворов сульфата хитозана.
Минимальные значения характеристической вязкости и молекулярной массы гидролизатов СХ также достигаются в случае их получения при рН 6. Возможно, отсутствие заряда на макромолекуле сульфата хитозана в интервале рН 5-6 способствует образованию промежуточных фермент-субстратных комплексов и в целом протеканию гидролиза. Зависимость характеристической вязкости СХ от температуры проведения процесса гидролиза (рис. 2.7 кривая 2) также имеет выраженный экстремальный характер, и минимальная вязкость достигается в интервале 37-40 С, что соответствует температурному оптимуму действия большинства ферментов.
Таким образом, для ферментного комплекса из S. kurssanovii, проявляющего активность в широком диапазоне рН (4,0+-8,0) и температуры (25- -500С), наиболее оптимальными при гидролизе сульфата хитозана являются рН 5-6 и температура 37 С.
Исследование влияния продолжительности гидролиза показало, что наиболее резкое уменьшение характеристической вязкости и молекулярной массы сульфата хитозана происходит в течение первых 2 ч, хотя молекулярная масса продолжает падать вплоть до 24 часов гидролиза (рис. 2.8). Такой вид кривых характерен для ферментов, действующих по эндомеханизму, при котором размер макромолекулы уменьшается в кратное количество раз. Следует отметить, что довольно высокий выход низкомолекулярного сульфата хитозана после гидролиза (85-90 %) также подтверждает факт протекания гидролиза в основном по эндомеханизму. В нашем случае использования препарата, состоящего из комплекса ферментов, можно предположить, что сначала активны одни ферменты (эндохитиназы), а затем другие (экзохитиназы, протеазы). Не исключено также, что на более поздних стадиях процесса ферментный комплекс частично инактивируется. Из сравнения кривых 1 и 3 с кривой 2 на рис. 2.8 видно, что чем выше молекулярная масса исходного полисахарида и ниже степень его сульфатирования, тем более резко снижается его молекулярная масса.
Влияние степени сульфатирования на скорость гидролиза сульфата хитозана, очевидно объясняется тем, что этот показатель строения определяет содержание в макромолекулах полисахарида хитозановых фрагментов, наиболее подверженных гидролизу ферментным комплексом из S. kurssanovii. Изучение влияния концентрации исходного раствора СХ в диапазоне от 2,0 до 0,5 % на протекание процесса гидролиза показало, что при использовании более разбавленных растворов полимера происходит несущественное различие в снижении характеристической вязкости гидролизатов, и в качестве оптимальной нами выбрана концентрация 1,0%.
Результаты хроматографического разделения гидролизатов, полученных при различных соотношениях СХ и ФК (рис. 2.6 и табл. 2.3), наглядно свидетельствуют о зависимости молекулярно-массового распределения продуктов гидролиза сульфата хитозана от количества в реакционной смеси ферментного комплекса. С увеличением содержания ферментного комплекса в реакционной среде увеличивается и величина пика ФК, выходящего в свободном объеме, а максимумы поглощения на кривых элюции гидролизатов смещаются в сторону больших величин объема элюата, т.е. более низкомолекулярных продуктов. Так гидролиз СХ-1 с массовым соотношением СХ:ФК, равным 250:1, в течение 24 ч обеспечивает получение образцов со средневяз-костной молекулярной массой около 5 кД.
Идентичность химического строения исходного и гидролизованного сульфата хитозана подтверждена методом ИК-спектроскопии. В спектре 2 (рис. 2.9) гидролизованного сульфата хитозана имеются все полосы поглощения, присутствующие в спектре исходного СХ (спектр 1), в том числе характеристические полосы валентных колебаний SO2 групп (1250-1260 и 1040 см" 1) и валентных колебаний C-OS групп (810-825 см"1). В то же время отсутствие в спектре 2 полосы поглощения с максимумом при 1070-1075 см"1, характерной для ферментного комплекса (спектр 3), говорит о том что, выбранный способ выделения гидролизованных сульфатов хитозана обеспечивает их надежную очистку от ферментных препаратов.
Исследование антикоагулянтной активности препаратов сульфата хитозана и гепарина
Как уже неоднократно отмечалось в последнее время в мировой практике для проведения антитромботической терапии предпочтение отдается низкомолекулярным гепаринам и гепариноидам. Свертывание крови многоступенчетый (каскадный) ферментный процесс, в котором участвуют белки-протеазы, нефер-ментные белки и конечный субстратный белок - фибриноген. Как и другие плазменные протеолитические системы, система свертывание крови может функционировать по двум механизмам (рис. 2.22): внутреннему (медленному), в котором наблюдается последова тельная активация факторов XII, XI, IX+VIII, X+V и II внешнему (быстрому), который запускается поступлением в кровь извне тканевого фактора. Активированный фактор X не только пе реводит протромбин (фактор II) в тромбин (фактор Па), но и уча ствует в активации других комплексов.
Оба этих пути сходятся на факторе X. Следует отметить, что важной особенностью этого многоступенчатого процесса является то, что в нем от момента запуска до конечного этапа происходит интенсивное наращивание числа последовательно активированных молекул. Так, например, одна молекула фактора ГХа активирует несколько десятков молекул фактора X, а одна молекула Ха - множество молекул фактора П. Поэтому этот процесс характеризуется тем, что один активированный фактор может вовлечь все большее и большее количество других факторов. Гепарин и сульфат хитозана являются антикоагулянтами прямого действия и предотвращают активацию свертывания крови как in vivo, так и in vitro. Анти-коагулянтная активность, проявляемая этими препаратами на разных стадиях процесса гемостаза, может быть охарактеризована в различных тестах с использованием модельных систем и компонентов крови. В данной работе оценку антикоагулянтой активности исходных и низкомолекулярных препаратов сульфата хитозана и гепарина проводили, определяя их антитромбиновую (alia) и антиХа (аХа) активности в тестах in vitro. Антитромбиновая активность препарата обусловлена его способностью ингибировать тромбин, путем образования комплекса с ним и с антитромбином .
Связи в комплексе имеют электростатическую природу и это обуславливает возможность перемещения компонентов вдоль молекулы гепарина. Увеличение молекулярной массы молекулы гепарина благоприятствует образованию таких тройных комплексов, в которых гепарин играет роль "мостика", где сближаются антитромбин и тромбин, и последний инактивируется. Поэтому антитромбиновая активность более выражена у нефракционированных гепаринов, содержащих высокомолекулярные фракции. Кроме того, участие гепарина проявляется и на более ранней стадии процесса гемостаза в ингибировании фактора Ха. Низкомолекулярный гепарин, с молекулярной массой менее 5 кД содержит специфическую пентасахаридную последовательность, необходимую для связывания с антитромбином, но такой длины молекулы не достаточно для связывания с тромбином, поэтому подобные фрагменты ингибируют только фактор Ха [137,138]. В экспериментах на животных показано, что анти Ха активность необходима, хотя недостаточна для предотвращения тромботического эффекта. Блокада тромбина большими молекулами гепарина тоже необходима [139,140]. Практика показывает, что не столь важным является абсолютное значение аХа и alia - активностей, сколько их соотношение, и у лучших коммерческих образцов низкомолекулярного гепарина оно находится на уровне 2-4. Для исследования alia и аХа активностей нами были отобраны образцы сульфата хитозана и гепарина с различными величинами молекулярной массы и степеней замещения по сульфатным группам. В табл. 2.17 приведены результаты исследования антикоагулянтной активности фракций низкомолекулярных сульфатов хитозана, полученного ферментативным гидролизом. Как видно из представленных данных, ферментативно деполимеризован-ные препараты сульфата хитозана с молекулярной массой 25-3,7 кД обладают преимущественно антитромбиновой активностью, и для них не обнаружена ожидаемая корреляция этих двух показателей. Лишь дальнейшее понижение молекулярной массы до 2,5 кД приводит к увеличению аХа активности. Коэффициенты корреляции изменения молекулярной массы и аХа и alia активностей свидетельствуют об отрицательной связи этих величин, причем более выраженной для аХа активности, так что в целом снижение молекулярной массы сульфатов хитозана в ходе ферментативного гидролиза приводит к увеличению соотношения активностей аХа:а11а. Вместе с тем необходимо отметить очень низкий сопоставимый с ошибкой определения уровень и аХа и alia активностей у низкомолекулярных препаратов сульфата хитозана, полученных методом ферментативного гидролиза. На наш взгляд, это может быть связано с протеканием в ходе гидролиза процесса десульфатирования и недостаточно высокой степенью сульфатирования полученных препаратов.
