Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства и применение 10
1.1.1. Строение и физико-химические свойства 10
1.1.2. Области применения хитозана 13
1.1.2.1. Применение хитозана и его производных в медицине 13
1.1.2.2. Доставка лекарственных средств 15
1.1.2.3. Применение хитозана в косметике 15
1.1.2.4. Применение хитозана в пищевой промышленности 16
1.1.2.5. Очистка сточных вод 16
1.2. Получение хитина и хитозана из различных источников 16
1.2.1. Выделение хитозана из ракообразных и моллюсков 18
1.2.2. Получение хитина и хитозана из грибов 21
1.2.3. Получение хитина и хитозана из других источников... 23
1.3. Способы деполимеризации хитозана 23
1.3.1. Химические способы деполимеризации 23
1.3.1.1 Кислотный гидролиз 23
1.3.1.2. Окислительная деполимеризация 25
1.3.1.2.1. Перекись водорода 25
1.3.1.2.2. Азотистая кислота 27
1.3.2. Ферментативные способы деполимеризации хитозана .28
1.4. Активность хитозана и его производных 29
1.4.1. Антибактериальная активность 30
1.4.2. Фунгицидная активность хитозана и его производных. 33
1.4.3. Противовирусная активность хитозана 36
2. Экспериментальная часть 38
2.1. Материалы и методы 38
2.1.1. Исходные материалы 38
2.1.2. Определение молекулярной массы 38
2.1.3. Культуры для противомикробных тестов 39
2.1.4.0пределение фунгицидной активности 39
2.1.5. Прорастание конидий F. oxysporum 40
2.1.6. Измерение поверхностного натяжения растворов 40
2.1.7. Динамическое рассеяние света 40
2.1.8. Определение пенообразующей способности растворов .41
2.1.9. Измерение вязкости растворов 42
2.1.10. Спектрофотометрические измерения 42
2.2. Выделение хитина и получение хитозана 43
2.3. Получение ]Ч-[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] хитозана 43
2.4. Получение ^[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил)сукциноил] хитина 44
2.5. Титрование N-[2(3)-( додец-2'-ен-1'-ил)сукциноил]хитина 44
2.6. Кватернизация хитозана 44
3. Результаты и их обсуждение 46
3.1. Выделение хитина из различных источников и получение хитозана 46
3.1.1. Измельчение 47
3.1.2. Депротеинизация 48
3.1.3. Деминерализация 49
3.1.4. Обесцвечивание 53
3.1.5. Деацетилирование 54
3.2. Синтез гидрофобномодифицированных хитозанов и изучение их свойств 59
3.2.1. Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом 59
3.2.2. Анализ полученных соединений 61
3.2.3. Изучение реологических свойств растворов N-[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] хитозана 66
3.2.4. Поверхностно-активные свойства растворов N-[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] хитозана 69
3.2.5. Изучение пенообразующих свойств №[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] хитозана в водных растворах 70
3.2.6. Изучение ассоциации №[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил]хитозана в водных растворах 73
3.3. Деполимеризация хитозана и К-[2(3)-(додец-2,-ен-1,-ил) сукциноил] хитозана 74
3.4. Кватернизация хитозана, олигохитозана и ^[2(3)-(додец-2,-ен-1,-ил) сукциноил] хитозана 79
3.4.1. История проблемы 79
3.4.2. Метод смешанных ангидридов 84
3.4.3. Карбодиимидный метод 85
3.4.4. Использование 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина в методе смешанных ангидридов 86
3.4.5. Получение и изучение строения кватернизованных хитозанов 88
3.4.5.1. Кватернизация хитозана 88
3.4.5.2. Кватернизация 1М-[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил]хитозана 95
3.5. Биологическая активность хитозана и ]Ч-[2(3)-додец-2'- ен-1'-ил) сукциноил]хитозана 102
3.5.1. Описание тестируемых микроорганизмов 104
3.5.2. Результаты определения микробиологической активности 108
3.5.2.1. Фунгистатическая активность низкомолекулярного хитозана 108
3.5.2.2. Фунгицидная и антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана и его производных 119
3.5.2.3. Бактерицидная активность низкомолекулярного хитозана и его Ы-[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] производного 122
Выводы 126
Литература 128
- Строение и физико-химические свойства
- Ферментативные способы деполимеризации хитозана
- Определение пенообразующей способности растворов
- Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хитозан - нетоксичный, биодеградируемый полимер. Несмотря на то, что хитозан привлекает внимание ученых уже сравнительно давно, свойства этого уникального полимера до конца не изучены.
В ряде областей применение хитозана ограничено из-за его высокого молекулярного веса и, как следствие, низкой растворимости в воде и разбавленных кислотах, а также высокой вязкости растворов даже при низких концентрациях хитозана. Медицинское применение нашли хитозаны низкого молекулярного веса с высокой растворимостью и низкой вязкостью водных растворов при физиологических значениях рН. Микробиологическая активность хитозана была определена в отношении ряда микроорганизмов. Однако эти исследования показали, что биологическая активность хитозана сложным образом зависит от его молекулярного веса и степени ацетилиро-вания. Указанные факторы влияют не только на растворимость хитозана, но и на взаимодействие макромолекул хитозана с клеточной стенкой микроорганизмов. Амфифильные производные хитозана, которые находят применение в качестве загустителей, поверхностно-активных веществ и пенообразователей обладают пониженной растворимостью по сравнению с самим хитозаном. В связи с этим получение новых производных хитозана, обладающих повышенной растворимостью и биологической активностью, является актуальной научной и практической задачей.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение амфи-фильных производных высоко- (ВМ) и низкомолекулярного (НМ) хитозана, изучение их физико-химических и биологических свойств в сравнении с немодифицированным хитозаном. Для достижения данной цели нами были определены основные задачи:
1. проанализировать имеющиеся источники хитина и выбрать предпочтительные источники и параметры их обработки для получения хитозана;
согласно выбранным параметрам осуществить переработку биоотходов, содержащих хитин;
разработать методику получения амфифильных производных хитоза-на, обладающих повышенной растворимостыо, и изучить их основные физико-химические свойства;
разработать методику модификации хитозана и его амфифильных производных путем селективного введения бетаиноильных групп для увеличения растворимости при физиологических значениях рН;
разработать методику получения и получить серию низкомолекулярных хитозанов и их амфифильных производных для изучения влияния молекулярной массы и степени замещения на их свойства;
исследовать активность полученных соединений против ряда бактерий, дрожжей и грибов.
Научная новизна работы
Разработана оригинальная технология получения амфифильно-го производного хитозана - 1\Г-[2(3)-(додец-2-ен-1-ил)сукциноил]хитозана, обладающего повышенной растворимостыо, и изучены его физико-химические свойства;
Предложен новый метод кватернизации хитозана и его амфифильных производных с использованием 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина в качестве конденсирующего агента, который позволяет вводить бетаиноильные группы селективно по аминогруппам хитозана и получать производные хитозана растворимые при физиологических значениях рН;
Впервые обнаружено и подтверждено химическими и физико-химическими методами, что 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин способен взаимодействовать с аминогруппами хитозана с образованием К-(этоксикарбонил)хитозана;
4. Впервые получен ряд амфифильных производных низкомолекулярного хитозана и показана зависимость их физико-химических свойств и биологической активности от степени замещения.
Практическая значимость работы
Показано, что среди ряда исследованных источников хитина предпочтительным источником для получения хитозана медицинского назначения является гладиус кальмара;
Разработана методика получения низкомолекулярного хитозана с высокими выходами и низкой полидисперсностью из производимого в больших количествах высокомолекулярного хитозана;
Получены амфифильные и кватернизованные производные хитозана, которые могут быть использованы в качестве носителей биологически активных веществ. Гидрофобные лекарственные средства могут быть солюбилизированы внутри агрегатов таких частиц, а противоположно заряженные (анионные) полиэлектролиты, такие как ДНК, могут образовывать комплексы с такими производными при физиологических значениях рН;
Показано, что полученные соединения обладают высокой биологической активностью по отношению к некоторым видам бактерий и грибов, особенно по отношению к Candida kruisei и Penicillium ver-moesenii.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Восьмой и Девятой Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Казань, 14-16 июня 2006 и Ставрополь, 13-17 октября 2008, VI съезде биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря 2006, Молодежной конференции "Молекулярный дизайн и синтез веществ с заданной физиологической активностью", 15 ноября 2006, МГУ; на молодежном конкурсе ИНЭОС РАН 2006. Работа была удостоена 1 премии имени академика П.П. Шорыгина на ежегодном конкурсе работ
молодых ученых в области хитина и хитозана Российского хитинового общества в 2007 году.
Личный вклад соискателя.
Экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Определение молекулярных масс и антибактериальной активности хитоза-нов проводили совместно с лабораторией инженерии ферментов проф. Варламова В.П. (Центр Биоинженерии РАН). Выделение хитозана из креветки южноатлантической {Cragnon cragnon), кальмара (Loligo vulgaris), каракатицы {Sepia officinalis), моллюсков {Mytilus galloprovincialis и Cerastroderma edule) проводили на базе Лаборатории патологии растений (Департамент морских наук и прикладной биологии, Университет г. Аликанте, Испания). Определение размера частиц кватернизованных хитозанов проводили на базе Лаборатории фармацевтического факультета института Луи Пастера, г. Страсбург, Франция.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых российских (3) и зарубежных журналах (3), 1 статья в сборнике трудов Российского хитинового общества, 2 тезисов докладов на научный конференциях.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 38 рисунков, библиографию из 153 наименований.
Строение и физико-химические свойства
Хитин - поли[р(1— 4)1ЧГ-ацетил-В-глюкозамин] - второй по распространенности в природе полисахарид после целлюлозы [1]. Хитин встречается в наружном покрове членистоногих (ракообразные, насекомые), скелете мор-ского зоопланктона, клеточной стенке грибов и дрожжей [2]. Хитин также присутствует в стенках цисты инфузории, клетках зеленых водорослей, иглах диатомовых, стеблях золотистых и волокнах гаптофитовых водорослей [3]. В живых организмах хитин образует микрофибриллярный порядок, что обеспечивает линейную конформацию молекул, закрепленную водородными связями. Эти фибриллы диаметром от 2,5 до 2,8 нм обычно входят в белковую матрицу [4]. Хитин присутствует в трех полиморфных модификациях с различной ориентацией хитиновых микрофибрилл: а, р, у. Наиболее распространена а-форма, в которой цепи полимера антипараллельны и плотно упакованы. Она присутствует в панцире ракообразных и моллюсков, кутикуле насекомых, клеточной стенке грибов. а-Хитин является наиболее распространенной формой хитина, в то время как две другие формы хитина встречаются в природе в небольших количествах. В р-форме цепочки параллельны и обладают более высокой растворимостью и набуханием за счет более слабых межмолекулярных водородных связей [5]. Гладиус кальмара содержит Р-хитин. у-Форма, представляющая собой систему чередующихся двух параллельных и одной антипаралельнои к ним цепочек, присутствует в коконах насекомых [6]. С помощью химической обработки р- формы хитина можно превратить её в а - форму. Таким же образом превращается у-форма в а-форму. Это становиться возможным при обработке данного вещества насыщенным раствором LiSCN. Оба эти превращения необратимы [6]. В кальмарах вида loligo встречаются все три формы хитина: а-хитин выстилает тонким слоем стенки пищевода и желудка, Р-хитин составляет большую часть гладиуса (скелетной мышцы кальмара), которому он придает прозрачность и эластичность, и у-хитин, который представлен тонкой кутикулой, покрывающей другие участки желудка [7].
Хитин не растворяется в большинстве растворителей. Хитин растворяется только в концентрированных растворах соляной, серной, фосфорной и муравьиной кислот, однако одновременно с этим протекают реакции гидролиза. Поэтому раствор хитина в концентрированной соляной кислоте содержит хитиновые цепи, которые короче первоначальных цепей. Гидролиз хитина концентрированными кислотами в жёстких условиях приводит к образованию D-глюкозамина [8]. В случае серной кислоты, кроме того, происходит реакция сульфатирования [9]. Обычные органические растворители не растворяют хитин, однако при добавлении к хитину смеси диметилформамида и тетраоксида диазота образуются слабо концентрированные растворы. Хитин можно растворить в гек-сафтор-2-пропаноле или в гексафторацетоне или в смеси хлорсодержащих спиртов с водными растворами минеральных кислот. В растворах некоторых солей хитин переходит в коллоидный раствор [10], причем скорость растворения р-хитина в таких средах выше, чем у а- хитина. Хитозан - поли[р-(1— 4)-2-амино-2-дезокси-В-глюкопираноза]- коллективное название частично или полностью деацетилированного хитина. Общепринято считать, что хитозан- это хитин со степенью ацетилирования ниже 40% [11]. Физико-химические свойства хитозана зависят от его степени ацетилирования, молекулярной массы, полидисперсности. Хитозан растворяется в разбавленных растворах таких неорганических кислот как хлористоводородная, бромистоводородная, иодистоводородная, азотная, а также в разбавленной хлорной кислоте. В концентрированных кислотах хитозан выпадает в осадок. Хитозан нерастворим в разбавленной серной, лимонной и винной кислотах. Вместе с тем, хитозан растворим в разбавленных растворах муравьиной, уксусной, молочной, яблочной кислот. Растворимость хитозана в водных растворах уменьшается с увеличением его молекулярного веса и степени ацетилирования. Молекулярное звено хитозана содержит одну амино и две гидроксильные группы, потенциально способных к взаимодействию с алифатическими и ароматическими ангидридами [12]. Аминогруппы хитозана имеют константу диссоциации сопряженной кислоты рКа=6,0-6,8. Таким образом, хитозан - биополимер относительно слабой основности рКа 6.5, нерастворимый в щелочных средах. Поликатионный характер хитозана обеспечивает его взаимодействие с отрицательно заряженными синтетическими или природными полимерами. Вследствие низкой основности аминогруппы в слабокислой среде, хитозан реагирует в основном по аминогруппам. При этом хитозан вступает в типичные для аминогруппы реакции, из которых N-ацилирование и образование оснований Шиффа являются наиболее важными. Важнейшим параметром, характеризующим хитин и его производное хитозан- является степень N-ацетилирования, т.е. содержание 2-ацетамидо-2-деокси-О-глюкопиронозидных структурных фрагментов. Это отношение сильно влияет на растворимость хитина и свойства растворов. Принято считать, что хитозан - это хитин, деацетилированый до такой степени, при ко
Ферментативные способы деполимеризации хитозана
Ферментативные методы деполимеризации хитозана нашли в настоящее время достаточно широкое практическое применение. В природе разрушение хитина возможно двумя способами. Один из них состоит в разрушении хитина под действием эндо- и экзохитиназ до хитобиозы с последующим превращением её в N-ацетилглюкозамин в присутствии N-ацетил-р глюкозамидазы и в глюкозамин с помощью ацетилглюкозаминдезацетила-зы. Второй способ состоит в превращении хитина в хитозан под действием хитиндеацетилазы, а затем хитозан под действием хитозаназы деградирует до димеров глюкозамина и далее до мономеров в присутствии хитобиазы [56]. Ферментативную деполимеризацию можно проводить, используя специфические (хитиназы, хитозаназы) или неспецифические ферменты [56]. Однако высокая стоимость и недостаточная доступность специфических ферментов затрудняют их промышленное применение. За последние 10-15 лет было обнаружено, что некоторые неспецифические коммерчески доступные ферменты также способны деполимеризовать хитозан.
Использование неспецифических ферментов позволяет применять для деполимеризации хи-тозана менее дорогие и более доступные ферменты: протеазы [57], геми-целлюлазы [58-60], липазы [61] и пектиназы [62]. Так, например, Рахильд и др. [63] использовали для деполимеризации хи-тозана лизоцим. Хитозаны с различными степенями ацетилирования имеют четыре возможных положения ацетилированных (А) и деацетилированных (Д) фрагментов. Возможна связь между двумя N-ацетилированными фрагментами (А-А), ацетилированным и деацетилированным фрагментами (А-Д), деацетилированным и ацетилированным фрагментами (Д-А), двумя де-ацетилированными, фрагментами (Д-Д). Авторы обнаружили, что лизоцим всегда расщепляет гликозидную связь между двумя ацетилированными фрагментами [63]. В то время как бактериальная хитозаназа Bacillus.spp. расщепляет гликозидную связь исключительно между двумя деацетилиро-ванными фрагментами [64]. Изучению бактерицидной, фунгицидной и противовирусной активности хитозана и его производных посвящено множество работ. Тем не менее, ни одна из опубликованных в настоящее время работ не дает полное представ ление о том, каким образом активность хитозана зависит от его свойств. В настоящее время общепринято считать, что механизм взаимодействия высоко- и низкомолекулярного хитозана с поверхностью клеточной стенки различен. Большинство исследователей считают, что молекула высокомолекулярного хитозана связывается с отрицательно заряженными структурами клеточной поверхности (липидом А, тейхоевыми кислотами, полярными группами фосфолипидов), что приводит к усилению проницаемости и разрушению клеточной стенки и плазматической мембраны микроорганизмов [65-66].
Для низкомолекулярного хитозана предполагается следующий механизм: молекула хитозана проникает внутрь клетки и, электростатически связываясь с ДНК, ингибирует транскрипцию [65]. В данной главе мы рассмотрим некоторые работы посвященные исследованиям биологической активности хитозана Следует отметить, что большинство проведенных работ включало исследование хитозана или олигомеров хитозана только одной или нескольких молекулярных масс [67-70]. Корейские исследователи Но и др.[71] исследовали антибактериальную активность хитозана против четырех Грам-отрицательных (Escherihia coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus) и семи Грам-положительных {Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, B. cereus, Staphylococcus aureus, Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. bulgaricus) бактерий. При этом были взяты хитозаны (Mw=1671, 1106, 746, 470, 224 и 28 кДа) и олигомеры хитозана (Mw=22, 10, 7, 4, 2 и 1 кДа). Авторы показали, что хитозаны высокого молекулярного веса обладают большей антибактериальной активностью, чем олигомеры хитозана. Раствор хитозана (0,1 %) обладал большим бактерицидным эффектом для Грам (+), чем
Определение пенообразующей способности растворов
Пенообразующую способность и стабильность пены измеряли по следующей методике: 10 мл раствора образца (концентрация 0,25г/дл) в 0,15М ацетатном буфере (рН 4,5) помещали в мерный цилиндр объемом 25 см3 с притертой пробкой. Цилиндр интенсивно встряхивали 2 мин и ставили на стол. Отмечали объем пены и включали секундомер. Следили за изменением объема пены во времени, производя соответствующие записи в таблице. Измерения прекращали после полного разрушения всей образовавшейся пены. Повторным встряхиванием снова получали пену и измерения повто ряли. По полученным данным строили график изменения объема пены во времени, откладывая по оси абсцисс время, а по оси ординат - объем пены. Пенообразующую способность (Fa) рассчитывали по формуле: Fa(%) = 100Vo/Vs , где Vo - первоначальный объем пены, a Vs- объем раствора (мл). 2.1.9. Измерение вязкости растворов Приведенная вязкость Приведенную вязкость определяли, используя капиллярный вискозиметр Уббелоде (0=О.6мм). Измерения проводили в растворах 1% уксусной кислоте и 0Д5М ацетатном буфере (рН=4,5) при 25±0,5С . Каждый раствор был профильтрован через фильтр Millipore с диаметром пор 1мкм для удаления примесей. Динамическая вязкость Вискозиметр вращения Brookfield ЬУВУ-1+(шпиндель 0) был использован для определения динамической вязкости растворов полимеров высокой концентрации в зависимости от степени замещения и для изучения влияния концентрации на течение модифицированных полимеров. Для определения вязкости использовали раствор полимера в 1% (об./об.) уксусной кислоте. Все визкометрические измерения проводили при 25±0,5 С. Все растворы полимеров необходимых концентраций были приготовлены путем взвешивания лиофилизованного полимера и растворения навески. 2.1.10.
Спектрофотометрические измерения ИК спектры лиофилизованных образцов были сняты в таблетках КВг с использованием прибора Perkin-Elmer 1420. Спектры ПМР были сняты на приборе Bruker DRX-500 после растворения образцов хитозана в H20/D20 (4:1 об/об) при концентрации 0,02 %(вес./об.) при 293К с частичным подавлением сигналов протонов воды. При необходимости добавляли 1% дейтеросоляную кислоту. В нашей работе используемые биоотходы были предварительно измельчены до размера частиц от 1 до Змм, а затем были подвергнуты щелочному депротеинированию 0,5-1,5М раствором гидроокиси натрия при 80 С в течение двух часов. По окончании процесса щелочного депротеинирования отделяли супернатант и полностью промывали частицы депротеинирован-ного хитина. Для деминерилизации хитина мы использовали 0,5-1,5М соляную кислоту, которую вводили порциями в перемешиваемую водно-хитиновую смесь до полного прекращения выделения углекислого газа, а затем оставляли на 1-2 часа. Для снижения пенообразования добавляли незначительные количества бутилового спирта. Деацетилирование хитина проводили 50% NaOH при 90С, в течение трех часов. Полученый хитозан промывали водой и высушивали на воздухе. Хитозан (5г; 24 ммоль NH2 групп) при перемешивании растворяли в 1% (об./об.) водном растворе уксусной кислоты (150 мл) при 50 С, затем к раствору добавляли (150 мл) метанола и раствор ДДЯА (2,4-28,8 ммоль) в метаноле (50 мл). Полученную смесь перемешивали при 50С в течение 8 часов и оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем реакционную массу вливали в 2% раствор гидрокарбоната натрия (500 мл) и перемешивали в течение 1 часа. Получившийся гель отделяли и промывали избытком воды. Затем гель растворяли в 1% уксусной кислоте (150 мл) и осаждали 5% раствором гидрокарбоната натрия (100 мл).
Полученный гель тщательно промывали избытком воды, лиофизовали и помещали на хранение. 2.4. Получение ]Ч-[2(3)-(додец-2 -ен-Г-ил)сукциноил] хитина ДДС-Хитозан (около 0,6 г) растворяют в 1% уксусной кислоте, разбавляют метанолом и добавляют уксусный ангидрид (соотношение 1%АсОН:МеОН:Ас20 = 2:4:1 об./об.). Смесь выдерживают 3 час при комнатной температуре. Образовавшийся гель промывают 0,5М содовым раствором, водой и ОДМ соляной кислотой, затем отмывают водой до нейтрального значения рН. 2.5. Титрование N-[2(3)-( додец-2 -ен-1,-нл)сукцшюил]хіітііііа Полученный гель ДЦС-хитина помещают в 100 мл мерную колбу и добавляют измеренное количество ОДМ NaOH (Умаон л) до суммарного объема 100,0 мл. Через 1 час гель отфильтровывают, а фильтрат собирают. Гель промывают водой и сушат в вакууме при 60С над пятиокисыо фосфора, а затем взвешивают (ш, г). Фильтрат (25,0 мл) титруют ОДМ соляной кислотой (VHci л), используя фенолфталеин в качестве индикатора. Содержание карбоксильных групп (Т, моль/г) в сухом ДДС-хитине рассчитывают по формуле: Т = [ОД VNa0H- 4 х 0,1VHCI] I m
Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом
Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом. Получению гидрофобномодифнцированных хитозанов посвящен целый ряд научных работ [97-104]. Как правило, для получения гидрофобно- модифицированных производных хитозана используют реакцию ацилирова-ния ангидридами или хлорангидридами карбоновых кислот [109], или используют метод восстановительного алкилирования оснований Шиффа, которые являются предшественниками для получения N-алкилхитозана. Ими-ногруппы могут быть восстановлены до N-алкильных групп боргидридом или цианоборгидридом натрия [9]. Однако введение длинного алкильного заместителя в молекулу хитозана приводит к уменьшению его растворимости [105]. Увеличить растворимость гидрофобно-модифицированного хитозана можно его N,0- карбоксиметилированием или N-сукцинированием [106-108]. Присутствие карбоксильных групп частично компенсирует потерю растворимости, связанную с введением в молекулу хитозана гидрофобных алкильных или сукцинильных групп [109]. Одним из путей повышения растворимости является одновременное введение в молекулу хитозана вместе с гидрофобными группами фрагментов, увеличивающих растворимость хитозана, например карбоксильных групп. Так взаимодействие хитозана с (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом (ДЦЯА) предоставляет возможность получения таких амфифильных производных хитозана одновременным введением в молекулу хитозана длинных гидрофобных алкильных цепей и заряженных гидрофильных карбоксильных групп.
На рисунке 11 приведена схема получения М-[2(3)-додец-2 -ен-Г-ил) сукциноил]хитозана (ДДС-хитозана). Из рисунка 11 видно, что (2-додецен-1-ил)янтарный ангидрид имеет несимметричную структуру и обе его карбонильные группы могут реагировать с аминогруппой хитозана, образуя 2-изомер или 3-изомер. Вероятно, преимущественно образуется 3-изомер, т.к. образованию 2-изомера препятствуют пространственные затруднения, вызванные длинными алифатическими цепями(2-додецен-1-ил)янтарного ангидрида. К сожалению, определение соотношения этих изомеров с использованием методов ИК и ЯМР спектроскопии невозможно, т.к. в данных методах сигналы -СН, -СНг, -и СНз протонов 2- и 3-изомеров лежат очень близко друг к другу. К тому же, даже при использовании высокоточного метода ЯМР спектроскопии с напряженностью поля 600 МГц мы наблюдали сильное уширение сигналов на спектре, вследствие наличия ассоциативных процессов в водных растворах ДДС-хитозана. Реакцию взаимодействия хитозана с ДЦЯА проводили в водной, слабо кислой среде, содержащей метанол, при 50С. В этих условиях хитозан и ДДЯА полностью растворимы. После завершения реакции продукт реакции легко осаждается из реакционной смеси насыщенным раствором гидрокарбоната натрия. При этом образовавшийся ДДС-хитозан имеет вид сильно набухшего геля. CgHtg Рисі 1. Схема синтеза К-[2(3)-(додец-2 -ен-Г-ил) сукциноил] хитозана Следует отметить, что так же, как и реакция N- ацетилирования хитозана ангидридом уксусной кислоты [111], реакция хитозана с ДДЯА требует избытка ДДЯА, т.к. ангидрид частично гидролизуется во время реакции. Продукты гидролиза ДДЯА полностью растворимы в слабощелочном водном растворе и таким образом могут быть полностью отделены от ДДС-хитозана. 3.2.2. Анализ полученных соединений Содержание заместителя в ДДС-хитозане определяли тремя независимыми методами: элементным C/N анализом, титрованием карбоксильных групп и методом ПМР-спектроскопии. Для подтверждения структуры ДДС-хитозана использовали ИК-спектроскопию. Среди полос поглощения, характерных для хитозана (рис.12 а), в ИК-спектре ДДС-хитозана присутст
Похожие диссертации на Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность
