Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 6
1.1. Хитозан и его свойства 6
1.2. Иммобилизация биологически активных веществ 16
1.3. Аналоги хитозана 29
1.4. Сополимеры, комплексы 43
2. Экспериментальная часть 54
2.1. Деструкция хитозана 54
2.2. Определение молекулярной массы гомологов хитозана 58
2.3. Получение наночастиц хитозана 62
2.4. Синтез производных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов 63
2.5. Получение гидразида изоникотиновой кислоты 64
2.6. Синтез 1-изоникотинил-2-глюкозилгидразонадигидрата 64
2.7. Получение наночастиц комплексов хитозана с производными 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов 64
2.8. Получение наночастиц комплексов хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты 64
2.9. Получение наночастиц комплексов хитозана с1-изоникотинил-2 глюкозилгидразона дигидратом 65
2.10. Получение наночастиц солей хитозана с карбоновыми кислотами 65
3. Обсуждение результатов 77
3.1. Деструкция высокомолекулярных хитозанов 77
3.2. Получение наночастиц низкомолекулярного хитозана
3.3. Синтез производных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов 87
3.4. Синтез 1-изоникотинил-2-глюкозилгидразонадигидрата 92
3.5. Получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами 94
Выводы 113
Список литературы 114
- Хитозан и его свойства
- Сополимеры, комплексы
- Деструкция высокомолекулярных хитозанов
- Получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами
Введение к работе
з
Актуальность темы. В настоящее время значительное внимание многих исследователей приковано к проблеме выделения и химической модификации природных полимеров. Среди большого многообразия биополимеров особое место занимает хитозан. Уникальность хитозана обусловлена широким спектром проявляемых им свойств, среди которых следует особо выделить такие как биологическая активность, биосовместимость и нетоксичность. Это позволяет его использовать в химии, фармации, медицине, поэтому исследования, связанные с химией такого биополимера, как хитозан, является важной задачей полимерной химии. Учитывая его биологическую активность, биосовместимость и нетоксичность основным стратегическим направлением его использования является фармация и медицина, которая предъявляет определенные требования по величине молекулярной массы полимера. Задача получения низкомолекулярного хитозана, изучения механизма деструкции и управление процессом с целью синтеза продукта с необходимыми свойствами является актуальной как с теоретической, так и практической точек зрения.
Помимо этого, наличие в макромолекулах хитозана реакционноспособных групп обуславливает его способность к комплексообразованию, позволяющая осуществлять иммобилизацию биологически активных веществ. Учитывая его биосовместимость и нетоксичность возможно получение новых гидрофильных лекарственных форм на основе известных препаратов и веществ потенциально биологически активных с пролонгированным действием, что указывает на актуальность проведенных исследований.
Цель работы - синтез наночастиц хитозана с различной молекулярной массой и исследование их способности к комплексообразованию с биологически активными веществами для создания гидрофильных лекарственных форм.
4 Научная новизна.
Изучена окислительная деструкция высокомолекулярного хитозана пероксидом водорода и получены его полимергомологи в широком диапазоне значений молекулярных масс. Установлена зависимость степени полимеризации хитозана от концентрации окислителя, температуры и продолжительности процесса. Найдено, что эффективным стоппером деструкции является водный раствор аммиака, не приводящий к понижению степени деацетилирования хитозана, как это происходит при использовании формалина.
Определены условия получения наночастиц низкомолекулярных хитозанов.с узким распределением по размерам. Показано, что размер частиц зависит от величины молекулярной массы хитозана, его концентрации и концентрации триполифосфата натрия, рН среды.
Впервые синтезирован и идентифицирован ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.
Получена водорастворимая форма известного противотуберкулезного препарата гидразона изоникотиновой кислоты - 1-изоникотинил-2-D-глюкозилгидразона дигидрата.
Показано, что низкомолекулярные гомологи хитозана образуют комплексы с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным, а также рядом производных пиридазина, на основе которых получены наноразмерные частицы с узким распределением по размерам.
Установлены закономерности образования наноразмерных частиц солей низкомолекулярного хитозана глутаминовой и янтарной кислот.
Практическая значимость работы.
Синтезированны полимерные комплексы хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным. Исследования в бакте-риостатической лаборатории Белгородского областного противотуберкулез-
5 ного диспансера ппоказали, что они перспективны для их применения в медицинской практике.
Получен ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.
Личный вклад автора. Автор лично выполнил большинство этапов работ, включая постановку задач, проведение эксперимента, анализ и обсуждение результатов. Автор защищает:
Усовершенствованный способ получения низкомолекулярных полимергомо-логов хитозана
Синтез наночастиц на основе хитозана с различной молекулярной массой Способы получения ряда 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов и 1-изоникотинил-2 -D-глюкозилгидразона дигидрата
Получение комплексов наночастиц хитозана с низкомолекулярными биологически активными веществами
Апробация работы. Результаты работы докладавались на V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2010» (Москва, 2010г.), 7-ой Санкт-Петербургской конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011 г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ: 4 патента, 1 статья, 2 тезисов докладов конференций различных уровней. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (189 наименований). Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 14 таблицы, 25 рисунков.
Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.
Хитозан и его свойства
Аминосодержащие биополимеры - гомо- и гетерогликаны, их различные аналоги и конъюгаты успешно используются в фармации и медицине. Расширение поисковых и практически внедряемых разработок характерно для утилизации хитозана, что объясняется сочетанием его ценных биохимических свойств с экономической доступностью. Химическая лабильность этого полимера позволяет, применяя относительно несложные технологические процессы, получать гомологи и аналоги с различными вариантами физико-химических и биологических свойств. Совместимость таких соединений с биосистемами, биоразлагаемость в организме с образованием безвредных низкомолекулярных соединений обеспечивают перспективность их практического использования. Установлена антибактериальная, противовирусная, и противовоспалительная активность хитозана и различных композиций на его основе при практическом отсутствии токсического действия на организм. Достоверно подтверждено иммуностимулирующее адъювантное адаптогенное гемоста-тическое и холестрическое действие данных гликанов. Установлена зависимость указанных свойств от степени полимеризации основных макроцепей концентрации первичных аминогрупп вида и содержания различных (ЬУНк-ционалов. Изучаются процессы биологического действия хитозана и его про Биологически активная композиция для медицинских и косметических целей, при лечении ожогов, в качестве пищевой добавки содержит хитозан-гель или хитозан-суспензию с размером наногранул не более 100 им и ионы благородных металлов в количестве не более 10% (хитозан-гель 98,5; Ag 115.) Приведены результаты клинических испытаний. Композиция стимулирует заживление ран, снижает кожные раздражения [1]. Предложено хитозан-содержащее средство для лечения инфицированных ран и ожогов, проявляющее антибактериальные свойства, трансформируя их клиническое течение, и ускоряет различные стадии заживления, включая развитие грануляционной ткани, фибриллогинез и эпителизацию [2].
Хитозан применяют для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Определена антибактериальная активность полимера по отношению ко всей микрофлоре, выделяемой из ульцерогенной зоны. Раствор хитозана (1%) с молекулярной массой (ММ) 320 кДа и степенью деацетилиро-вания (СД) 79.3% в 0.2% водном растворе HCl вводился как аппликация на язвенную поверхность. Использовалась также таблетированная форма. Аминог-люкан оказывает выраженное бактериостатическое действие на все исследованные микроорганизмы. Отмечены ускоренные сроки рубцевания язв и резкое снижение явления рецидива [3].
Гелевые формы хитозана использовались для лечения хронического периодонтита. Отмечено их положительное влияние на развитие воспалительных процессов в тканях периодонта, определена активность различных препаратов мелкодисперсного хитозана в гелевой форме с СД 90-95% и ММ 10-15 и 120 кДа. Гели аминоглюкана (4, 6, 8%) проявляют антибактериальное действие в отношении микроорганизмов, этиологически значимых при периодонтите; активность проявляется в течение 24 часов. Снижение концентрации полимера дезактивирует процесс.
Применение пасты из геля хитозана и оксида цинка стимулирует новообразование костной ткани [4]. Предложен способ лечения пародонтита с применением электрофореза хитозана. Использован 0.5% водный раствор гидрохлорида хитозана с ММ 200 кДа, СД 80% и степенью кристалличности 75% (рН 4.5). Электрофорез проводили с анода при плотности тока 0.3-0.5 мА/см . Предполагается образование полиэлектролитных комплексов между компонентами соединительной ткани и аминоглюканом, заполняющим межклеточное пространство, что ведет к нормализации циркуляции крови реабилитации функций пародонта [5]. Обсуждается возможность использования хитозана для восстановления функции сухожилия после его повреждения и оперативного вмешательства [6]. Ряд исследований посвящено вопросу изучения антибактериальной активности полимера в зависимости от ММ и СД. Аминоглюканы со значительной степенью полимеризации в виде 1% растворов в 0.2% соляной кислоте проявляют антимикробное действие в отношении многих микроорганизмов [7].
Изучена антибактериальная активность хитозана на двух раневых штаммах Е. coli и St. albus. Показано, что наибольшим антибактериальным эффектом обладает аминогликан с ММ=72 кДа в концентрации 20 мг/мл. Разработана технология приготовления лекарственных форм - гелей на метилцеллюлозе, содержащих хитозан в разных концентрациях. Наиболее эффективными по показателю времени полузаживления оказались гель, содержащий хитозан (ММ=72 кДа) в концентрации 2%, и гель, содержащий хитозан (ММ=10,7 кДа) в концентрации 0,1% [8 .
Проведена оценка биологической активности аминоглюканов на серии микроорганизмов грамотрицательного и грамположительного типов. Использовавшиеся хитозаны с ММ 4-27 кДа были получены ферментативным гидролизом из исходных полимеров с различной СД (крабовый и пчелиный хитозаны). Была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК). Под действием хитозана усиливается проницаемость наружной мембраны клеток до пределов их жизнеспособности. Установлено, что для полимеров с ММ 5-27 кДа разница действия на грамотрицательные и грамположительные бактерии практически отсутствует. При тестировании хитозанов с ММ 4 кДа и СД 55%, 73%, 78% и 86% установлена тенденция увеличения процента гибели клеток с увеличением СД полимера. Аминоглюкан с максимальной СД имеет более высокую концентрацию положительных зарядов на макроцепи, что приводит к образованию наиболее прочной связи с поверхностью клеточной стенки микроорганизмов. Дана оценка МИК для хитозанов с MLM 5-27 кДа и СД 85% в отношении к исследованной серии микроорганизмов [9]. Низкомолеку-лярные полисахариды полученные из панцирей крабов рекомендованы как эффективные препараты в борьбе с кандидозной инфекцией, развивающейся от чрезмерного употребления антибиотиков. Их использование целесообразно также в качестве вещества, способствующего адсорбции лекарств и биологически-адгезивного реагента. Хитозаны используют в фармации для изготовления таблеток (грануляты), гелей, пленок, микросфер и капсул [10]. Антибактериальная активность аминоглюканов исследована в отношении Е. coli. Бактерицидная активность возрастает с увеличением ММ до ее максимального значения - 9.16x10 Да (рН=5.6), далее наблюдается ее снижение. Эффективность действия хитозана возрастает с увеличением СД и концентрации. Клетки Е. Coli, в условиях воздействия аминоглюкана деформируются и подвергаются аутолизису [11]. Препараты на основе хитина и хитозана оказывают защитное действие при бактериальной септической инфекции (выживаемость достигает 90%).
Установлена способность полимера ингибировать вирусные инфекции в клетках животных организмов, а также предотвращать развитие фаговых инфекций в зараженной культуре микроорганизмов. Противовирусная активность аминоглюкана, как и его антибактериальные свойства, существенно зависит от степени полимеризации и от величины положительного заряда на макромолекулах. Механизм подавления фаговой инфекции заключается в инактивации соответствующих частиц и ингибировании репродукции бактериофагов. В животных организмах влияние хитозана на вирусные инфекции объясняется его воздействием на индуктивную фазу иммунного ответа и эф-фекторные механизмы иммунной системы. Важную роль играет способность аминоглюкана индуцировать в живом организме образование интерферона [12].
Определена способность полимера как иммуномодулятора для повышения резистентности животных, одновременно наблюдается стабилизация прироста массы тела (20-40%). Выраженный иммуностимулирующий эффект обусловлен, в основном, активацией фагоцитарной активности макрофагов. Этот механизм обеспечивает запуск реакций, ответственных за скорость формирования специфического гуморального иммунитета [13].
Сополимеры, комплексы
Модификация физико-химических свойств хитозанов может быть достигнута путем синтеза на их основе привитых сополимеров. В зависимости от их структуры образуются производные с увеличенной гидрофильностью, проявлением свойств пленкообразователей, изменением сорбционной способности. Используются процессы сополимеризации с винильными мономерами в условиях редокс - инициирования и вариантами различных инициаторов традиционного способа. Применяются также методы взаимодействия аминоглюкана с полимерными компонентами, несущими в структуре концевых звеньев реак-ционноспособные функциональные группы. Разработаны синтезы привитых сополимеров хитозана с акрилонитрилом, акриламидом и диметиламиноэтил-метакрилат-метилсульфатом. Наиболее эффективные инициаторы - соединения Со3 (до 99% конверсии). Полученные материалы могут быть использованы как образователи пленок, волокон и в качестве флокулянтов. Синтезированы катионоактивные флокулянты на основе хитозана без разрушения его основной цепи. Вещества использованы для извлечения ионов тяжелых металлов из водных систем. Предложен высокоэффективный адсорбент ионов РЬ2+ и Cd2+, образующийся в результате привитой сополимериза-ции акриламида до 90% с хитозаном в присутствии персульфата аммония [151, 152]. Na-Соль акриловой кислоты и Na-соль метакриловой кислоты привиты в KМХ с помощью СПЛ. Реакция прививки выполнена при 70С в течение 2 часов с использованием персульфата аммония в качестве инициатора. Структурные изменения в хитозане и его производных контролировали использованием ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием. Изучена антибактериальная активность растворимых в воде хитозановых производных (Staphyloccus aureus и Escherichia coli) с помощью метода подсчета ячеек [153].
Разработан синтез 0-полиэтиленгликолированного хитозана. В процессе использованы моноэтиловый эфир полиэтиленгликоля (ПЭГ), иодид метилового эфира ПЭГ. Применяли хитозан с ММ 400 кДа и СД 72%. Аминогруппы были блокированны обработкой гликана ангидридом фталевой кислоты. Сополимеры очищались высаливанием - раствор (NH SO и диализом против воды. Для полученных сополимеров характерно наличие боковых цепей ПЭГ по два от каждого звена, что придает им растворимость в воде до рН=8. Сохраняется биосовместимость хитозана и его низкая токсичность. Свободные аминогруппы перспективны для дальнейшей модификации [154]. Полиэти-ленгликолевый эфир хитозана получают обработкой раствора аминоглюкана в уксусной кислоте окисью этилена (1-3 атмосферы, 60-100 С, рН 9). Обра-зующийся раствор привитого сополимера подвергают очистке вакуумирова-нию [155] Описан способ оксиэтилирования хитина и хитозана в ПРИСУТСТВИи основных катализаторов Образующиеся производные подвергают Т - О-аналоговым превращениям путем взаимодействия с бензилхлоридом сульфатами галогенкарбоновыми кислотами ангидридами карбоновых ки-Р-ненэ-сыщенными карбонильными соединениями Полученные по-лечебно-косметических средствах [156] СТРУКТУРы образующие гидрогели, используемые для доставки лекарственных средств в организм, в изготовлении герметизирующих материалов для хирургии получают взаимодействием мультифункциональных полиэтиленоксидов (МАО) и хитозана. МАО имеют ММ 0,2-100 кДа [157].
Комплекс хитозана (ММ 150 кДа, СД 80%), карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и антибиотика цефтриаксона (ЦТА) получен растворением ЦТА в 0.4%-ном растворе КМЦ при рН 5.8 и перемешиванием с 0.4%-ным раствором хитозана. В результате выделен нерастворимый комплекс с весовым соотношением хитозан:КМЦ:ЦТА 1:1.5:1.45. Комплекс с содержанием 17.3% ЦТА в таблетках исследован на высвобождение ЦТА при рН 1.95-11.73 в течение 55 часов. Показано, что скорость отщепления сильно зависит от рН среды: максимальное количество антибиотика выделяется при рН 1.95 и 11.73, а минимальное при рН 6.5 [158]. Исследованы гели на основе хитозана и триполи-фосфатов или полифосфорных кислот. Определена скорость выделения противоракового лекарства (6-меркаптопурин) из таких гелей в зависимости от рН. При рН=6.8 выделение лекарства идет по диффузионному механизму, при рП=1.2 диффузия в таких системах не подчиняется закону Фика. Скорость выделения лекарства зависит от степени гидролиза хитозана [159].
Предложены таблетки, капсулы и другие пероральные лекарственные формы для защиты, лечения и замещения поврежденной соединительной тка ни, используемые в косметологии, дерматологии и ревматологии при лечении артрозов. Препараты содержат в качестве активных ингредиентов композицию 5-25 мг/кг хондроитина или его солей и 5-50 мг/кг хитозана (СД 80%) или его производных (N-алкилхитозан, N-карбоксиалкилхитозан, N карбоксиацетилхитозан), а также ингибиторы свободных радикалов (витамины С и Е). Препараты обладают пленкообразующими, бактерицидными, фунги-цидными, ранозаживляющими свойствами [160]. Регулирование высвобождения лекарственного вещества (преднизолон) осуществляется применением комплекса хитозана с хондроитином. Высвобождение преднизолона определено в 0.1 M фосфатном буфере рН 7.2. Высвобождение 50% субстанции из по 45 рошка преднизолона длится 5 минут, из хитозановых гелевых шариков - 200 минут, из шариков комплекса с хондроитинсульфатом - 330 минут. Показано влияние СД хитозана на деградируемость гелевых шариков. Гелевая матрица обеспечивает более эффективное контролируемое высвобождение [161].
Рассмотрено влияние образования полиионов на выделение теофиллина в среде, моделирующей желудочный сок, из таблеток, где в качестве носителя используют сочетание полианионов карагинина или альгината Na с поликатионами метилгликольхитозана. Отмечено повышение концентрации лекарства при набухании носителя [162]. Таблетки - полисахаридные матрицы, обеспечивают пролонгированное высвобождение пуэрарина. Прямое прессование снижает скорость высвобождения. Определяющими факторами являются также содержание в композиции хитозана, его СД, содержание альгината Na и его вязкость [163]. Полученные методом сушки распылением носители белковых лекарственных веществ (бычий сывороточный альбумин) представляют собой микрочастицы хитозана/альгината натрия диаметром менее 10 мкм. Способность частиц к иммобилизации белков зависит от рП среды реакции сшивки альбумина и хитозана. При определенных соотношениях величины рН и изо-электрической точки белка образование его комплекса с альгинатом происходит более или менее эффективно [164].
Рассмотрено применение (З-циклодекстрина для улучшения капсулирова-ния инсулина смесью хитозан/альгинат Са с целью получения лекарственных средств с регулируемым высвобождением активного компонента. Образуются комплексы инсулин/(3-циклодекстрин при различных рН среды. При снижении рН с 6 до 4 капсулирование сильно ухудшается. Новое лекарственное средство предварительно апробировано на кроликах [165".
В условиях микрокапсулирования комплексы хитозана и альгинатов образуют гелевые структуры, способные нести в своем составе лекарственные субстанции (ретинолпальмитат, ибупрофен), бактерии, ткани животных и косметические препараты. Полиэлектролитные комплексы (НЭК) применяются так-же в качестве сорбентов для извлечения токсических ионов РЬ/ [166, 167]. Изучена возможность защечной доставки противовирусного ацикловира из пленок на основе хлоргидратхитозана и натриевой соли полиакриловой кислоты (НПК). Пленки, содержащие 1 мг/см2 ацикловира, на основе хитозана и НІЖ в различных соотношениях получали по технологии отливания. Стандарты сравнения - крем и водная суспензия ацикловира. Наличие в пленке хитозана и НПК снижает ее гидратацию. Проникновение ацикловира в эпителий происходит более интенсивно из пленок, чем из других форм. Оптимальные пленки получаются при соотношении хитозан:НПК 1:3 [168]. Исследованы особенности процессов образования НЭК с хитозаном. Это связано с возможностью их применения в качестве биоспецифических сорбентов, пленок, мембран, носителей лекарственных веществ. Исследовано образование ПЭК хитозана с ММ 400 кДа, СД 76% с рядом сополимеров малеиновой кислоты методом турбидиметрического титрования. Отмечено участие в ионном взаимодействии только одной группы малеината; выход нерастворимых ПЭК до 80% [169]. Разработаны способы синтеза ПЭК с различным составом и соотношениями функций анионного и катионного характера. Использовался яблочный и лимонный пектин (степень этерификации 63%, ММ хитозана 20 кДа, СД 60%), растворитель - 2% уксусная кислота. Прочность образующегося геля максимальна при соотношении компонентов 1:1.
Деструкция высокомолекулярных хитозанов
Последние десятилетие заметно возрос интерес исследователей к поиску способов получения низкомолекулярных гомологов хитозана, что связано с возможностью использования в медицине и биотехнологиях. Хитозаны, полученные из хитина характеризуются ММ порядка 400-700 кДа. Это ограничивает их использование в качестве лекарственных средств, компонентов лекарственных форм, материалов медицинского назначения, снижает их биологическую доступность в живом организме. С целью получения гомологов с заданной степенью полимеризации используют различные способы физической или химической деструкции исходных высокомолекулярных гликанов. К первой группе способов относится деструкция под действием различных видов излучения высокой энергии. Основной недостаток этих методов заключается в протекании побочных реакций окисления, декарбок-силирования, сопровождающиеся дезаминированием, деструкцией пираноз-ных циклов структуры звеньев полимера. Деструкция гликозидных центров в кислой среде также ряд недостатков, таких как сложность управления процесса очистки образующихся низкомолекулярных полимергомологов. Достаточное распространение получил также способ ферментативного гидролиза хитозанов с использованием специфических хитинолитических ферментов действие которых селективно направлено на деструкцию Р-1 4 межзвеньевой связи. Исследования проводились в 1-2 % водном растворе уксусной кислоты. Исследование влияяния концентрации полимера показало, что оптимальной является 2 масс. %. Увеличение концентрации полимера приводило к заметному росту вязкости, что осложняло осуществление процесса в связи диффузионным фактором и, как следствие, получению полимеров с большой степенью дисперсности.
Важнейшим параметром, определяющим степь деструкции высокомолекулярного хитозана, соответственно, и молекулярную массу конечного продукта, является концентрация Н2О2 в реакционной среде. Исследования проводились при постоянной температуре 50 С. Из рисунка 1 видно, что с увеличением концентрации пероксида водорода молекулярная масса снижается. Однако, по мере повышения концентрации Н2О2 происходит увеличение степени дисперсности целевого продукта, о чем свидетельствует расширение величин молекулярных масс полимеров в серии параллельно выполненных при одинаковых условиях опытов. Так, при концентрации Н2О2 равной 2 масс. %, молекулярная масса изменялась в интервале 2,8-3,3 кДа, а при содержании 2,5 масс. % - 1,1-2,3 кДа. Это связано, по-видимому, с высокой интенсивностью процесса деструкции и сложностью конролирования и управления им. Дальнейшее повышение концентрации приводит к получению олигомеров.
Аналогичная зависимость выявлена и при исследовании влияния концентрации пероксида водорода на молекулярную массу конечного продукта, выполненном при температуре 70 С (таблица 1).
Изучение влияния температуры на глубину протекания деструкцию исследовали в интервале 20-70 С. Установлено, что более перспективным параметром, позволяющим в большей степени регулировать молекулярную массу образующихся полимергомологов, является температура. Как видно из рисунка 2, с ростом температуры при постоянстве остальных параметров реакции, молекулярная масса снижается. Причем величина молекулярной массы полимеров, полученных в серии параллельных опытов, изменяется в пределах 5-10%, что соответствует ошибке эксперимента.
Методы определения ММ образующихся низкомолекулярных полиме-раналогов зависят от ориентировочной величины этого показателя. Для характеристики хитозанов с предполагаемой ММ 15-20 кДа использовали вискози-метрический метод (вискозиметр Уббелоде; 0.86 мм), с использованием констант уравнения Марка-Куна-Хаувинка Кт=2.4х10"3, а=0.69 [158]. Для определения молекулярных масс более низкомолекулярных и олигомерных полимер-гомологов применяли химический метод определения по концентрации восстанавливающих концевых гликозидных гидроксилов. При этом использовалось достаточно изученное свойство моносахаридов и, в частности, В-глюкозы легко взаимодействовать с гидразидом изоникотиновой кислоты (ГИНК). Вероятность взаимодействия ГИНК с подобной углеводной структурой возрастает при введении в реакционную систему катионоактивных аминосодержащих полимерных катализаторов. Метод присоединения ГИНК к структуре концевых звеньев олигомеров не предусматривал введения каких либо катализаторов. Определение конверсии ГИНК при образовании полимерных гидразонов проводили иодометрическим методом. Оценка этого показателя проведена ну 81 тем: а) установления концентрации ГИНК в жидкой фазе, образующейся при экстрагировании продуктов реакции б) в структуре хитозанизоникотиноил-гидразина после его выделения и очистки экстракцией. Расчет степени полимеризации исследуемых олигомеров производился по данным определения среднего содержания макромолекул в анализируемом образце для испытания. Установлена практическая идентичность расчетных данных по вариантам методов а) и б). Показано также, что использование для разработанной методики олигомеров в солевой или основной форме практически не влияет на конечные результаты определения ММ.
Образующиеся гомологи хитозана растворимы в водных растворах уксусной кислоты пониженной концентрации до 0,5% в основной форме. Косвенная оценка степени полимеризации образующихся гомологов хитозана производилась вискозиметрическим методом. Установленные показатели характеристической вязкости колеблются и пределах от 8,0 до 1,0 дцл/г.
Следует отметить, что наиболее надежным и удобным методом остановки процесса деполимеризации хитозана является физическое удаление Н2О2: фазовое разделение, экстракция. Фазовое состояние продуктов гидролиза может быть различным (суспензия или раствор). Этот метод реализуется при получении гомологов хитозана со степенью полимеризации более 30. Изучалась также возможность химического метода фиксирования пероксидной деполимеризации хитозана путем нейтрализации деструктирующего реагента (Н2О2) формальдегидом. Это актуально для образования низкомолекулярных водорастворимых гомологов в жидкофазной системе либо для растворов хитозана в разбавленных кислотах. В процессе обработки однофазной системы водным рас-твором формальдегида остаточное количество окислителя вступая с ним во взаимодействие интенсивно превращает сЬормальдегид в муравьиную кислоТУ. Процесс смещается в этом направлении при наличии в системе компонента с основными свойствами. Этот метод наиболее эффективен для варианта процесса деполимеризации в основной форме. Продуктивность значительно снижается пг)и использовании раствог)ов соттевьтх гЬорм хитозана Опрехтеленным недостатком является возможность взаимодействия формальдегида с первичными аминогруппами гликана с образованием оснований Шиффа, М-метилол-группировок, пространственного структурирования. В связи с указанными недостатками разработан метод химического прерывания деструкции, заключающийся в действии водного раствора аммиака. Данный способ позволяет избежать уменьшения степени деацетилирования, как в случае использования формальдегида. Помимо этого, при взаимодействии аммиака с пероксидом водорода получается основная форма низкомолекулярного хитозана и в результате реакции образуются экологически безопастные продукты: молекулярные азот и кислород.
Получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами
С целью определения оптимальных условий взаимодействия хитозана с ГИНК, проведено исследование влияния их мольного соотношения на степень связывания. Изучение проведено в интервале 1.0-1.8 мольного избытка по отношению к хитозану. Установлено, что введение исходного мольного соотношения более 1.0, в изученном интервале, не приводит к увеличению массовой доли ГИНК в образующемся комплексе. Контроль содержания ГИНК в комплексе осуществляли по данным ИК-спектроскопии аналогично предыдущему.
Известно, что полимерные матрицы используются для создания лекарственных средств с пролонгированным действием и контролируемым высвобождением субстанции. 1-Изоникотинил-2-В-глюкозилгидразон, отличаясь высокой гидрофильностью, обладает туберкулостатической активностью соответственно концентрации в его структуре изониазида (ГИНК), но токсичность его в 10-12 раз ниже лекарственной субстанции. Винильные полимеры с углеводными боковыми цепями, несущие свободные полуацетальные гидроксилы - поли-3-акрилоил-В-глюкоза и поли-З-метакрилоил-В-глкжоза - были использованы для создания соответствующих гидразонов на основе ГИНК. Данные аналоги, отличаясь пониженной токсичностью, при сохранении антимикобактериальной активности лекарственной субстанции обладают пролонгацией действия в организме [45, 46].
Исследован процесс комплексообразования низкомолекулярных гомологов хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты (ГИНК) в присутствии ТРР. Для подтверждения образования комплексов ГИНК с хитозаном проведено их исследование с помощью ИК-спектроскопии. В ИК-спектрах комплексов на блюдается смещение характеристических полос поглощения в сравнении с ис ходными хитозаном и ГИНК. В частности, смещение полосы поглощения соот ветствующей валентным колебаниям гидразидной С=0 связи с 1654 см" в ис ходном ГИНК до 1663 см" свидетельствует об участии ее в образовании ком плексов, вероятно с первичной или вторичной аминогруппой хитозана. На их участие указывает также смещение полосы поглощения в области 1616 см" от вечающей деформационным колебаниям первичной и вторичной аминогрупп в хитозане до 1631 см" в комплексе Кроме этого в комплексообразовании со гласно данным ИК-спектроскопии участвует «пиридиновый» атом азота ГИНК на что указывает смещение полосы поглощения соответствующей валентным колебаниям -С=М- ГИНК с 1584 см" до 1560 см" . Ви 97 димо, взаимодействие «пиридинового» атом азота ГИНК происходит со связями Р=0 молекул ТРР.
С целью установления оптимального времени максимального связывания макромолекул хитозана с молекулами ГИНК проведено исследование влияния времени взаимодействия в интервале 30-300 мин. на степень их связывания (рис.9). Установлено, что максимальная массовая доля ГИНК достигается при 120 мин. Данные исследования проведены при мольном соотношении хито-зан:ГИНК 1:1. Расчет содержания ГИНК осуществляли по данным ИК-спектроскопии. ИК-спектр ГИНК содержит интенсивную полосу поглощения в области 1665-1650 см"1\ характеризующую валентные колебания гидразидной карбонильной группы, отсутствующей в спектре хитозана.
С целью определения оптимальных условий взаимодействия хитозана с ГИНК, проведено исследование влияния их мольного соотношения на степень связывания. Изучение проведено в интервале 1.0-1.8 мольного избытка по отношению к хитозану. Из таблицы 6 видно, что введение исходного мольного соотношения более 1.0, в изученном интервале, не приводит к увеличению массовой доли ГИНК в образующемся комплексе. Контроль содержания ГИНК в комплексе осуществляли по данным ИК-спектроскопии аналогично предыдущему.
ИК-спектральное исследование подтвердило образование комплексов. Смещение полосы поглощения соответствующей валентным колебаниям гидра-зидной С=0 связи с 1654 см в исходном ГИНК до 1663 см" свидетельствует об участии ее в образовании комплексов, вероятно с первичной или вторичной аминогруппой хитозана. На их участие указывает также смещение полосы поглощения в области 1616 см" , отвечающей деформационным колебаниям первичной и вторичной аминогрупп в хитозане до 1631 см" в комплексе. Кроме этого в комплексообразовании согласно данным ИК-спектроскопии участвует «пиридиновый» атом азота ГИНК, на что указывает смещение полосы поглощения, соответствующей валентным колебаниям -С=К- ароматического цикла ГИНК с 1584 см" до 1560 см . Видимо, взаимодействие «пиридинового» атом азота ГИНК происходит со связями Р=0 молекул ТРР.
