Содержание к диссертации
1. Обзор литературы 17
1.1. Meюды зондовой микроскопии 17
Лтомно-силовая микроскопия 17
Силовая спектроскопия 20
Меюды, использующие датчики на основе канти.іеверов АСМ 20
1.1.4 Архитектура кантилеверных датчиков и системы контроля за положением
кантилеверов 26
1.1.5. Производство и методы отчистки кантилеверов 33
1.2. Преобразователи биохимических реакций в аналиіический сиі на.і 35
Амперометрический анализатор 35
Потенциометрический анализатор 37
1.2.3 Смкостной иммуносенсор 37
Кондуктометрические датчики 38
Оптические иммуносенсоры 38
1.2.6.1 Іьсзокварцевьіе иммуносенсоры 40
1.3. Исследования химических и биолоіических процессов на новерхносіи
кантилевера 42
Хсмосорбция низкомолекулярных веществ и поверхностные химические реакции42
Кантилевсрные сеноры на основе высокомолекулярных и биополимерных систем 49
Экспериментальная часть 56
2. Разработка универсальной измерительной системы для
микрокантилеверных сенсоров 56
Введение 56
Материалы и методы 57
Полученные результаты и обсуждение 59
2.3.1 Измерение массы микрообъектов 59
2.3.3 Артефакты метода микровзвешивания с помощью кантилевера 65
2.3.4. Измерение сил натяжения в полимерной пленке 68
2.4 Выводы 73
3. Исследование свойств монослоев низкомолекулярных веществ 73
Введение 73
Материалы и методы 74
Результаты и обсуждение 76
Выводы 80
Глава 4 81
4. Исследование иммунохимических реакций, протекающих на
поверхности кантилевера 81
4.1. Иммунохимический сенсор на морфин 83
Введение 83
Материалы и методы 84
Результаты и обсуждение 88
Выводы 94
4.2. Иммунохимический сенсор на пероксидаэу хрена 95
Введение 95
Материалы и методы 95
Блокировка кремниевой поверхности кантилевера 96
Физическая иммобилизация IgG с иснольюванием белка Л 96
Химическая иммобилизация IgG с испо іьзованием белка Л 96
4.2.3. Результаты и обсуждение 97
Физическая иммобиіиіация IgG с использованием белка Л 97
Химическая иммобипизация IgG на поверхности кантилевера 99
4.2.4. Выводы 102
Глава 5 103
5. Исследование агрегации лизоцима на поверхности кантилевера 103
5.1 Введение 103
Ма і ериалы и методы 105
Результаты и обсуждение 106
Выводы 114
Теоретическая часть 115
Задача колебаний нагруженной балки 115
Модель расчета сил парных взаимодействий между молекулами, находящимися на поверхности кантилевера 118
Качественное описание процесса образования фибрилл в химически иммобилизованном монослое молекул белка 120
Заключение 123
Выводы 123
Благодарное і и 124
Библиография 125
Список иллюстраций
1.1. Схема атомно-силового микроскопа.
1 2. Основные режимы сканирования атомно-силової о микроскопа.
Схема работы АСМ в режиме силовой спектроскопии.
Основные режимы функционирования микрокантилеверных сенсоров.
Архитектура силового иммунохимическою микроканіилеверноіо сенора
Принципиальная схема оптической системы контроля за положением кашилевера (слева), атомно-силовой микроскоп ФемтоСкан с лазерно-опгической системой реіистрации сш нала (справа).
Микрофотография пьезокантилевера [38].
Микрофоіоірафия пары пьезорезистивных кантилеверов 2 и 3, включенных в мост Уин-стона, I и 4 -опорные сопротивления моста [43].
Фотография микроемкостной системы считывания отклонений кангилевера, выполненной по техно югии КМОН [45].
Микрофотография кантилевера с туннельной системой коніроля ею отклонений [47], помещенного между двумя электродами (источником и стоком).
Массив из восьми кремниевых кантилеверов, исполыуемых д ія сенсорных приложений [63].
(а) Кремниевый чип, содержащий 500 кантилеверов. (б) Схематическое июбражепис одною реакционною микроколодца, (в) Фотография с ) іектронною микроскопа реакционной емкости (стрелками отмечены большие для поступления раствора и м&пые для выхода воідуха отверстия), (г) Увеличенное изображение кантилеверов, покрытых золотой п іенкой.
Стадии изготовления микрокантилеверных сенсоров.
Поверхность поликристаллического золота после напы іения (а) и после ее травления в микстуре царской водки в течение I минуты (б).
Изоісрмьі сорбции ачканотиолов [34] с п = 4, 8, 12 (первый порядок жспоненциалыюй аппроксимации).
1.16 Стадии образования самооріанизующихся монослоев тиотовых молекул на поверхности монокриста пическою зочота.
1.17. Датчик, производящий контроль окислительно-восстановительной реакции на поверхности кантилевера [64]
Усіройство рецепіорною слоя сенсора для определения цєіия на основе химически модифицированного кантилевера[78].
Система кантилеверов, модифицированных пленками разпичных видов полимеров [66]. Внизу - отклик системы кантилеверов на пары воды и этанола.
Амплитудно-частотные характеристики кантилевера: (А) до иммобилиыции спор, (Б) после иммобилизации и (В) после прорастания спор на поверхности канги іевера.
(а) Микрокантичеверы с чувствизельностью измерения массы 1019 і/Гц [112], (б) кан-тилевер, способный измерить массу одной вирусной частицы [111].
Схема технической реализации определения амнлитудно-часюгных характеристик кантилевера.
Схема технической реализации определения статических отклонений кантилевера.
2.3 Сборка жидкостной ячейки, содержащей кантилевер (слева), универсазьная микроканти-леверная сенсорная система [16] (справа).
2.4. Зависимость резонансной частоты балки кантилевера от изменения массы на ее конце при последовательном прикреплении качибровочных микросфер.
2 5. Изображение кантилевера с пятнадцатью полистирольными микросферами, прикреп энными к его концу с помощью эпоксидного клея. 2.6. Зависимость массы адсорбированных паров толуола на поверхности частиц Диасорб-6()-С16 or массы самих частиц сорбента.
2.7 Кантилевер с прикрепленной частицей Диасорб-60-С16 массой 78,6±3,9 иг.
Кинетические кривые десорбции паров эганола и паров толуола с поверхности частицы Диасорб-6()-С16.
Резонансные кривые при различных мощностях потока водяною пара.
Зависимость добротности кантилевера от мощности рабогы иніа іяюра.
Іеорстические кривые резонансной частогы кантилевера при 27 С (пунктирная линия) и 32 С (сплошная линия).
Схема калибровки оптической системы считывания наноперемещений кантилевера.
Зависимость коэффициента преобразования (отклик с фотодиода в мВ)/(смещсние канти іевера CSG01 в нм) от интенсивности приходящего лазерною и>чка на фозодиод.
РЭМ изображение кантилевера CSC12E (средний) с нанесенной тенкой попибугилме-такрилата.
3.1 Схема химической реакции бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)дисульфида с шююй подложкой (в верхней части рисунка) и схема реакции обратимого образования металло-комплекса (в верхней части рисунка)
Хемосорбция лиганда (103 М) из метанола на золотую поверхность: данные изгиба кантилевера (верхняя кривая); нормированное именение краевого угла смачивания капли воды на золотой подложке, модифицированной литандом, с течением времени (нижняя кривая) [6]. Направление изгиба кантилевера покамно на вставке.
Экспериментальные данные кинетики изгиба кантилевера при химической сорбции на одной из его поверхностей, покрытой золотом, тиофенола и іскеантиола, растворенных в метаноле с концентрацией 10 2М.
Кинетика изгиба кантилевера при последовательной инкубации в водных растворах: Со(С10.4)2 6Н2О (цикл 1 концентрация 10 3М), НС1, О^СЮ^г'бЬЬО (цикл 2 концентрация 10 3М).
Кинетики изгиба кантиіевера при помещении ею в водные растворы О^СІСмЬ'бЬЬО с концентрациями: 10 2М, 10 5М, 10 7М.
Кинетика изгиба кантилевера при инкубации в водных растворах: MAV6H2O (М- Со, Си, Ni; Х- СЮ4) (цикл 1, концентрация 103М). Формы. В правой части рисунка изображены соответствующие формы комплексов.
Схемы твердофазного иммуноферментното анализа: (а) конкурентного; (б) метода последовательно! о насыщения.
Структурная формула морфина.
Реакция іидрофобизации поверхности покровною стекла с исиоіьюванием тримстит-хлорсилана.
Получение поверхностей с функциональными ЫНг-группами: а) золотой, б) слюды [159] и їй кремния.
Стадии ковалентной иммобилизации белка на поверхности: (а) обработка глутаровым аіьдетидом, (б) прививка белковых молекул за Шг-групны (в) бюкировка остаточных альдегидных групп трис-(гидроксимегиламинометаном).
4.6.Схема конкурентного иммуноанализа: Б) адсорбция антител на специфическую рецепторную поверхность кантилевера, содержащую антиіен А), В) десорбция антител с поверхности под действием мо іскул антигена.
4.7 Зависимость отклонения кантилевера (поверхностного натяжения) ог времени при модифицировании ею 4-аминотиофенолом.
Зависимость отклонения кантитевсра (поверхностного натяжения) ог времени при реакции линкеров глутаровою альдегида с его аминированной поверхностью.
Зависимость отклонения кантилевера (поверхностного натяжения) ог времени при хемо-сорбции коиъюгата овшіьбумина с морфином на поверхность кантилевера, содержащую альдеіидньїе группы.
И и иб кантилевера в результате реакции трис-і идроксиметиламинометана с непрорсаги-ровавшиими альдегидными группами на его поверхности.
Обобщение экспериментальных данных, полученных при создании рецепторного слоя на поверхности кантилевера.
4.12 Іипичная временная зависимость изгиба канти іевера в 0,03 М фосфатном буферном
растворе.
Сорбция ангигел на поверхность кантилевера, содержащую коньки аг овальбумина с морфином.
а) Слой коиъюгата на поверхности г идрофобизированой слюды после многократной промывки в фосфатном буфере (ФБ) (рашер изображения 2,8 х 2,8 мкм) б) Слой коиъюгата на поверхности г идрофобизированой слюды после контакта с раібавленной в ФБ сыворотке крови со специфическими антителами, (размер изображения 2,8 х 2,8 мкм).
Десорбция ангиіел с поверхности кантилевера под действием морфина с концентрациями 3, 10 и 100 мкг/мт
4.16 (а) Зависимость максимального значения поверхностного натяжения, (б) константы десорбции антител за первые 5 минут эксперимента от концентрации морфина.
Архитектура сенсорного слоя микроканти іеверного сенсора (на нероксидазу хрена): (а) при иммобилизации IgG с помощью белка А, (б) при коваленгной иммобилизации антител.
Кинетика изгиба кантилевера с фишчески иммобилишрованным рецепторным слоем при введении раствора ИХ с концентрацией 3 мкг/мт.
4.19 Кинетика изгиба кантилевера с физически иммобилизированным рецепторным слоем после цикла его регенерации в глициновом буфере pll 3,0 при введении раствора ПХ с концентрацией 10 мкг/мл. Сверху приведен контрольный сигнал па белок БСА.
4.20. Изображения поверхностей золота с нанесенными (а) бе іком А, (б) белком А и IgG, (в) белком A, IgG и ПХ. Справа (внизу) графики нормированных шероховатостей каждой из поверхностей
Кинетика изгиба канги.іевера с ковалентно иммобилизированным рецепюрным слоем при jV-om и 0V+1)-om циклах реіенерации в глициновом буфере (pll = 3,0) при введении раствора іIX с концентрацией 3 мкі/мл. Контрольные белки ЬСА и овальбумин с концентрациями 1 мг/мл. Нулевой уровень отклонений кантилевера сиі налов контрольных белков для наглядности смещен в сторону отрицательных значений
Кинетика деформаций кантилевера с ковалентно иммобилизированным рецепюрным слоем при введении раствора ПХ с концентрацией 3 мкг/мл (68 нМочь) и контрольных белков: БСА и оватьбумина с концентрациями 1 мг/мл. Нулевой уровень отклонений кантилевера сигналов контрольных белков для наглядности смещен в область отрицательных значений.
(а) Структура молекулы лизоцима [191] (Hen Egg-White Lysozyme) PDB ID: IGXV (6) Предполагаемый механизм агрегации белка лиюцима [192]. Молекулы, находящиеся в состоянии расплавленной глобулы (partially-folded, molten globule-like form II), отличном от денатурированного (III) и нативного (I) состояний, атрет ируют через /? - домены (IV) с образованием центра роста фибрилы. В дальнейшем происходит рост фибриллы (V) посредством постепенного увеличения числа атрегировавших белковых молекул.
Зависимость от времени поверхностною натяжения пленки лиюцима, находящейся на ю.ююй (кривая /) и кремниевой (кривая 2) поверхностях кантилевера. Результаты двух контрольных экспериментов, единственное огличие которых заключается в отсутствии этапа обработки кантилевера лизоцимом, для золотой и кремнивой поверхностей канти-ливера показаны соответственно кривыми 3 и 4.
Изменение формы агрегатов лизоцима на поверхности золота с течением времени нахождения в буфере рН 3.0 при (а,б,в) химической и (г) физической иммобилизации белка
а) Участок поверхности образца, содержащий как слой лизоцима, так и золотую поверхность, не покрытую лизоцимом: б) гистограмма высот поверхности (толщина слоя лизоцима ~ 3 нм), в) высота одиночной фибрилчы над монослоем ~ 3 нм.
а) Поверхность модифицированной слюды, покрытая лиюцимом, после обработки тли-циновым буферным раствором в течение 1 минуты, б) та же поверхность с дефектом «протирания», созданным искусственно с помощью кантилевера, для опреде іения высоты монослоя. На вставке - іистоірамма высот выделенной обпасти (средняя высот слоя мо текул лизоцима на поверхности слюды - 1.8+0.2 нм).
5.6. а) Поверхность слюды, покрытая .жюцимом, после обработки і лициновым буферным раствором в течение 16 часов, б) изображение фибриллы и ее сечение (средняя высота фибрилл лизоцима на поверхности слюды - 2,(Ш),1 нм).
6.1. Сисіема координат для задачи колебаний нагруженной балки.
Модель плотнейшей гексагональной упаковки монослоя белка на поверхности кантипе-вера. Стрелками указаны направления действия сил межмолекулярных віаимодействии и реіультирующей силы, дающей вклад в поверхностное натяжение белковой пленки
Модель кубической упаковки монос.юя белка на поверхности кантилевера. Стрелками указаны направления действия сил межмолекулярных взаимодействий и результирующей силы, дающей вклад в поверхносгное натяжение белковой пленки.
8.1 Механизмы роста фибрилл: (а) линейная сборка олигомеров в двух направ іениях, (б) линейный рост фибрилл из предварительно образовавшегося аморфною ценіра [203].
8.2. Качественная модель образования фибрилл в монослое гексогонально упакованных белковых молекул: (а) трехмерная модель, (б) двумерная модель сечения фибри ты.
Список таблиц
Технические характеристики кантилеверов Nanosensors.
Основные характеристики использованною сорбента.
Константы десорбции паров органических веществ с поверхности частицы Диасорб-60-С16.
2.4. I ехнические характеристики кантилевера CSC12 (Е).
2 5. Изображение кангипсвера CSG01 и ею параметры.
3.1 Зависимость изменения краевою уїла смачивания кап ж воды на золотой подложке модифицированной бис-4-(2-пиридилметиленаминофени і)дисульфидом в этаноле от времени инкубации в растворе (К)3 М) этанола [156].
4.1. Сравнение характеристик анализатора с характеристиками физическою и химического методов иммобилизации рецепторною слоя.
5.1. Сводные данные по кинетике и силовым характеристикам иииба кантилевера в тлици-новом буфере рН 3.0 с лизоцимом, иммобилизованном на ю ююй и кремниевой стороне кантитевера.
5.2. Сводные данные анализа изображений монослоев лизоцима, ковалентно иммобилизованного на зо.ююй и кремниевой стороне кантилевера и помещенною в глициновый буфер с рН 3.0 на время порядка 19 часов.
Список используемых сокращений
АИС - амперометричсский иммуносенсор
АІ 1С - аминопроиилсилатран
АСМ - атомно-силовой микроскоп
НСА - бычий сывороточный альбумин
ДНК - дизоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
КМВ - кварцевое микровзвешивание
КМОП - компчиментарная металло-оксидно-полупроводниковая технолої ия
МЭМС - микроэ іектромеханические системы
ПЭМС - наноэлектромеханические системы
ПХ - пероксидаза хрена
РИА - радиационный иммунный анализ
РНК - рибонуклеиновая кислота
РЭМ -растровый электронный микроскоп
СЗМ - сканирующий зондовый микроскоп
СІМ- сканирующий тунельний микроскоп
ФСБР - фосфатный солевой буферный раствор
RMS - root mean squared detector (среднеквадратичный детектор)
SAW - surface acustic waves (поверхностные акустические волны)
SPR - surface plasmon resonance (поверхностный плазмонный резонанс)
IgG - гамма-иммуноглобулин (юіасс макромолекул аніите і имеющих «У»-форм>)
Введение к работе
Микрокантилеверпые системы являюіся современными типами высокочувствительных твердофазных преобразователей биохимических реакций, протекающих на их поверхности, в аналитический сигнал. Существенной особенностью кантилевера, не имеющей альтернативных аналогов, является способность прямою измерения натяжения в пленках, помещенных на одну из его сторон. Благодаря эюму информация о сосюянии исследуемых объектов, получаемая с помощью микромеханических систем, оказывается уник&чьной и, вообще творя, отличается от той, которую дают распространенные методы анализа массы, а также оптических, и электрических свойств пченок. Уникальность информации состоит в том, что она непосредственно характеризует знеріию межмолекулярных взаимодействий внутри пленки, преобразующуюся в статический изгиб кантилевера (энерт ию аналитическо-то сигнала).
Появлением кангилеверы обязаны атомно-сичовой микроскопии (АСМ), которая сама по себе является мощным и всеми признаным инструментом исследования свойст поверхностей. В 80-х и 90-х тдах прошлого века развитие методов силовой микроскопии имело тенденцию к более ілубокому и мульти-информативному анализу поверхностей, что в конечном итоге привело к качественно новым методам исследования свойств пченок с использованием кантилеверов, когда обьект исследования определяет параметры микроэлсктромеханическо-ю зонда.
Сейчас системы с кангичеверными преобразователями зарекомендовали себя в качестве полноценного экспериментального метода, применяемого в исследованиях межмо іеку-лярных взаимодействий в монослойных и іенках низкомолекулярных веществ, биопо іимер-ных объектов, а также в обчасти химии поверхностных реакций [30,80,89,93-100,102] и молекулярной биологии [86,103,104]. Использование микрокантилеверов можег быть также полезным для практических задач аналии био ютических маркеров различных иболеваний человека [90,91], коніроля концентраций іербицидов [89], обнаружения ядовитых [107,108] и взрывчатых вещесів [67,70] в окружающей среде.
До появчения кантилеверов и подобных им сисіем не существоваю возможности напрямую экспериментачьно охарактеризовать силы кооперативных взаимодействий биопо ш-меров вблизи поверхности при всей актуальности такой задачи стоящей в областях сенсорных приложений, биосовместимых материалов и медицинских приборов, контактирующих с
физиологическими жидкостями, таких как зонды, протезы, контактные линзы и т.д Подобная задача явпяется актуальной также в исследованиях механизмов агрегации белков в клеточных мембранах, приводящих к нарушениям ионного обмена и нейродегенерагивным заболеваниям человека. На данный момент моменг фундаментальные причины выработки аналитическою сигнала в микромеханических системах в ответ на реакции в биополимерных рецеиюрах, ввиду сложности и разнообразия белковых систем, яв іяюіся мало изученными. Однако фундаментальные закономерности невозможно установить без совершенствования технологий экспериментального изучения конкретных объектов.
В настоящей диссертации с использованием микрокантилеверной сисіемьі и атомно-силовой микроскопии представлены результаты исследовании нескольких видов наиботсе важных взаимодействий в биополимерных системах и поверхностных реакций в слоях ионо-селективных сурфактантов. На примере иммунохимической реакции морфина со специфическими антителами (ангиморфин-IgG) изучены основные причины генерации поверхностных сил в рецептороном слое при диссоциации иммунных комтексов закрепленных на поверхности кантилевера под действием гаптена (морфин). Поверхностные реакции афипного типа в биополимерных системах необходимые для создания высокоселективных анализаторов биологических агентов были исследованы на примере иммунной пары IgG с пероксидазой хрена. Реакция на поверхности кантилевера проводилась по прямой схеме анализа (label-free), при коюрой производился количественный анализ свойсів рецептороного слоя в ши-симости от мегода ею иммобилизации на поверхности кантилевера. Задача кооперативною взаимодействия биомо іекул на поверхности оказалась актуальной так же и в исследованиях механизмов агреіации белков в клеточных мембранах, приводящих к нарушениям ионною обмена и нейродеіенеративньїм забопеваниям человека.
Изменение массы одиночных живых клеток или грибковых спор в процессе их жизненных циклов явчяется важной задачей в разработке эффективных ингибиторов рост патогенных бактерий. Без прямых методов исследования фазовых переходов образования и деградации микрокристаллов газогидратов невозможно определить энергии их мегастабильно-го состояния. Резонансные кангилевсры применяются также в качестве масс-чувствительных преобразователей для селективных датчиков массы разтичных частиц ити веществ. Все вышеперечисленное является далеко не полным перечнем возможных применений микрорезонансных систем. В данной работе микровзвешивающие возможности кантитеверов впервые используются для исследований сорбционных свойств микрочастиц силикагеля.
Цель и задачи исследовании
Целью диссертационной работы яв іялось по іучсние новых экспериментальных данных с использованием зондовой микроскопии и микрокантичеверных систем о свойствах са-мооріанизующихся монослойных пленок сераорганических соединений, иммунных ком-п іексов и белков, иммобилизованных на твердой подложке, и разработка методики иммобилизации биополимеров на поверхности кантичевера. Методическая часть рабогы включала в себя также рафаботку научного прибора на основе атомно-силової о микроскопа, позволяющею прецизионно измерять массу микрообъектов и латеральные напряжения в тонких п іен-ках, помещенных на поверхности кантилеверов.
В соответствии с поставленной целью реша шсь следующие задачи исследования:
Выявить и охарактеризовать основные механизмы, инициирующие аналитический сиіна і деформаций микрокантилеверного преобразователя при комплексации ионов двухвалентных металлов в рецепторном слое молекул бис-4-(2-пиридилметиченаминофснил)дисульфида на примере самоорганизующихся монослоев сурфактантов: тиофенола, 4-аминотиофеноча и іексантиола.
Разработать методику ков&чентной и физической иммобилизации биополимеров на кремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Исследовать морфологию рецеиюрных слоев прямых биоиолимерных кантилеверных анализаторов морфина и высокомолекулярного антиіена - пероксидазы хрена (ПХ). Изучить механизмы, отвечающие за возникновение поверхностного натяжения в рецепторной пченке при различных методах иммобилизации мо іскул иммуноглобулина G (IgG) в рецепторе.
С помощью АСМ исследовать процессы образования фибрилл лизоцима при низких рН из монослойных пленок на модифицированных гидрофильной и гидрофобной поверхностях. Изучить кинетику и измерить абсолютные значения сил иниба кантилевера на примере мочекул лизоцима, привитых на его золотой и кремниевой сторонах. Построить схему расчега сил парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверхности кантилевера, исходя из данных о величине изіиба кантилевера и о структуре монослойной пленки.
Разработать методику закрепления микрочастиц и реализовать метод измерения их массы с использованием канти іевера атомно-сичовою микроскопа в резонансном режиме. Провести сопоставченис модельных и экспериментальных рез>льтаюв определения массы с помощью канти іевера для оценки относительной погрешности измерения массы и раз-
решающей способности разработанной системы микровзвешивания. Исследовать сорб-ционные свойства одиночных микрочастиц хромаюірафическоіо сорбента (си жкагеля с модифицированной поверхностью).
Научная новизна диссертации
Установлен факт увеличения поверхностного давления в самоорганизующейся пленке мо іеку.і бис-4-(2-пиридилметипенаминофенил)дисульфида (лиіанда), иммобилизованной на поверхности кантилевера, вследствие возрастания электростатической плогносги и пленке в результате комплексации ионов Со2+, Ni2+, Cu2+ с молекулами лиганда. Показана обратимость реакции образования хелатных комплексов в рецепюре. Обнаружено раззи-чие в значениях поверхностных сил при комплексации ионов Со2', Ni2+, Cu2+ в слое лиіанда, связываемое с тем, что энергии образования сооївеїсівующих хелатных комтек-сов отличаются друї от друга.
Рафабоганы методики ковалентной и физической иммоби шзации белков на кремниевых и золотых поверхностях кантилевера. Впервые реалиюваны высокоселективные микро-кантилеверные анализаторы на основе биополимерной пары - пероксидазы хрена и IgG -с чувствительностью к нескольким наномолям анализируемою вещества в 1 л буферного раствора. Показано, что конформационные изменения молекул IgG при связывании с пе-роксидаюй генерируют аналитический сигнал деформаций кантилевера, характеризующий уменьшение эшропии макромолекулярных коми іексов.
Впервые реализован контроль селективной реакции определения морфина на поверхности кантилевера. Установлено, что причиной деформаций кантилевера при диссоциации комплексов морфин-IgG на его поверхности является спонтанное снятие напряжения в рецеишрной п іенке, которое сообщалось сисіеме при иммобилизации молекул IgG в рецепюре.
Обнаружен катализ роста фибрилл лизоцима из химически иммоби іизованноіо моиос.юя на поверхностях золота и слюды при рН = 3,0. Впервые получены данные по морфологии и размеру фибрилл лизоцима, выросших из монослоя химически иммобитизованых молекул белка. С помощью микроканти іеверной системы проведены измерения сил в пзен-ках лизоцима на гидрофобных и гидрофильных поверхностях кантизевера при «кислом» значении рН = 3,0. Обнаружена корреляция между скоростями процессов роста фибри 11
из монослоев на гидрофильных и гидрофобных полюшках и развитием си і в п іенке белка на данных поверхностях.
Предложена качественная модель, объясняющая возможность образования фибрин из молекул белка, находящихся на поверхности в связанном состоянии.
Предложена схема расчета парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверхности кантипевера, на основе данных о величине изгиба кантипевера и структуре монослойной пленки. Эксперимент&тыю определены силы парных взаимодействий мотекул лизоцима в монослое на поверхности кантилевера.
Разработана методика закрепления микрочастиц на поверхности кантилевера и реализован метод измерения их массы с помощью кантилевера атомно-силового микроскопа в резонансном режиме. Впервые охарактеризованы сорбционные свойства одиночных микрочастиц хроматографическото сорбенга диасорб-6()-С16 к парам полярных и неполярных растворителей.
Практическая значимость работы
Результаты диссертации позволяют продвинуться в решении следующих задач:
исследования кооперативных взаимодействий в бионо шмерных пленках;
разработки новых методов исследования массовых свойств микрообъектов;
создания новых прямых методов иммунохимическою анализа на базе микроэпек-тромеханических систем;
создания высокочувствительных сенсоров на ионы металлов в жидкостях, разработка ионоселективных электродов;
создания методов диагностики и профилактики нейродеї оперативных заболеваний животных и человека, вызванных прионными патогенными белками.
Стоит отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биопоїимеров, биофизике, молекулярной биолотии и медицине.
Апробации работы. Основные результаты диссертационной работы были представ тепы на следующих научных конференциях:
Международный симшниум «Mo іекулярньїй дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, 2004.
Международная конференция «Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques in conjunction with 13th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy», Sapporo, Japan, 2005.
Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005.
Международная конференция «Малый полимерный конгресс», Москва, 2005.
Международная конференция «Биоіехнолої ия и медицина», Москва, 2006.
Международная конференция «International Conference on Nanoscience and Technology 2006», Swisserland, Basel, 2006.
Всероссийская конференция (с международным участием) «Химия поверхно-сш и наноіехнология», Санкт-Петербург, 2006.
«Чегверіая всероссийская каргинская конференция», Москва, Россия, 2007.
Личный вклад автора
Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии выполнены автором. Все образцы приготовлены автором лично (ja исключением синтеза химических веіцесів). Разработка многофункциональною измериісльного комплекса на основе микроскопа «Фемто-скан» и проведенные на нем измерения выношены автором лично. Ана шз и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 20 рабог.
