Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Некоторые подходы к созданию полимерных систем для направленного транспорта лекарственных препаратов 12-31
Глава II. Термо- и рН-чувствительные полимерные носители 32-72
Глава III. Водорастворимые производные инсулина и овомукоида 73-111
Глава IV. Полимерные частицы - носители белковых препаратов 112-150
Глава V. Фазообратимые глюкозочу вствител ьные гидрогели 151-173
Заключение 174-175
Выводы 176-178
Список литературы 179-210
- Некоторые подходы к созданию полимерных систем для направленного транспорта лекарственных препаратов
- Термо- и рН-чувствительные полимерные носители
- Водорастворимые производные инсулина и овомукоида
- Полимерные частицы - носители белковых препаратов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современный уровень развития науки и техники ставит ряд задач по созданию нового поколения полимерных веществ и материалов. В настоящее время не достаточно придать полимерам те или иные химические или физико-механические свойства, такие как механическая прочность, эластичность, устойчивость к действию агрессивных сред и т. д., а во многих случаях требуется создать полимеры, направленно изменяющие свои свойства в процессе эксплуатации. К таким полимерам, получившим название «умные», относятся материалы и системы, способные изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды, например, температуры, рН, освещенности, появление в окружающей среде какого-либо химически или биологически активного соединения в определенной концентрации и т.д.
Одной из наиболее перспективных областей применения таких материалов является химия медико-биологических полимеров. Это, прежде всего, открывает большие возможности в плане создания материалов, способных моделировать отдельные функции некоторых органов и тканей живого организма, то есть активно функционировать в такой сложной, многокомпонентной среде, как живой организм. Активное функционирование подразумевает способность воспринимать информацию, поступающую извне, и изменять свои свойства в соответствии с ней. Очевидно, что эта способность, характерная, в основном, для «живой» материи, может быть придана синтетическим полимерам путем связывания их с соответствующими биологически активными соединениями (БАС). Использование такого подхода позволяет уже на современном уровне развития науки создавать полимерные композиции, моделирующие мышцы, изменяющие свои размеры под
действием внешних условий, кожу, способную к самообновлению, модели почек, избирательно выводящие токсичные соединения из организма и др.
Иммобилизация БАС на полимерном носителе позволяет вплотную подойти и к решению еще одной актуальной задачи современной химии медико-биологических полимеров - контролируемому выделению лекарственных препаратов (ЛП) из специально созданных «депо» по мере возникновения в них потребности, а также к повышению избирательности действия лекарственных веществ на ключевую стадию поражения.
Применение макромолекулярных носителей может позволить использовать альтернативные пути введения известных лекарственных препаратов, более физиологичные и комфортные для человека. Последнее особенно важно для белковых и полипептидных препаратов, которые невозможно вводить в организм через пищеварительную систему, где они подвергаются ферментативному гидролизу и расщепляются до составляющих их аминокислот.
Актуальность работы определяется также задачами возможного применения в клинической практике изделий на основе синтезированных материалов, включая системы для контролируемого выделения лекарств и их направленного транспорта, в том числе, основанные на механизме обратной связи, новые лекарственные формы для защиты лекарств от агрессивной среды живого организма, биологически активные покрытия на раны и ожоги и т.д.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось:
разработка подходов к созданию биологически активных полимерных систем, целенаправленно изменяющих свои характеристики при изменении параметров окружающей среды и активно воздействующих на эти параметры по механизму обратной связи;
разработка методов синтеза полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, и
создание на их основе универсальных систем для направленного
транспорта БАС;
- разработка приемов и методов получения полимерных матриц,
обеспечивающих не только направленный транспорт
иммобилизованных в их объеме БАС, но и защищающих эти
соединения от денатурирующего воздействия окружающей среды.
Решение конкретных биомедицинских задач потребовало провести
ряд фундаментальных исследований в области химии
высокомолекулярных соединений и биохимии, в частности, изучить
процессы, происходящие при иммобилизации БАС, и определить основные
параметры взаимодействия иммобилизованных БАС с их
физиологическими субстратами; выяснить влияние химической природы и
молекулярных характеристик полимера-носителя и состава окружающей
среды на эти параметры; исследовать конформационное поведение
синтетических полимеров и иммобилизованных на них БАС при
различных условиях их функционирования; разработать научные основы
создания полимерных носителей, способных избирательно
концентрироваться в определенном участке организма, а также носителей,
обеспечивающих одновременно защиту содержащихся в них белковых
препаратов от ферментативного гидролиза и их направленный транспорт.
В связи с поставленными задачами основное внимание в работе было уделено следующим объектам исследования:
синтетическим полимерам, макромолекулы которых могут изменять конформацию в требуемом направлении, т.е. выполнять «умную» функцию;
природным полимерам, биоспецифические свойства которых определяются способностью их макромолекул взаимодействовать с определенными физиологическими субстратами;
8 3) полимерным матрицам, в которых БАС не связано с полимером, а самой матрице изначально приданы биоспецифические свойства или эти свойства возникают в процессе эксплуатации.
Научная новизна и практическая ценность работы. Решение поставленных задач позволило сформулировать и экспериментально проверить на широком круге объектов системный подход к созданию нового поколения полимерных материалов, способных воспринимать поступающую извне информацию и изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды.
В работе впервые:
1) изучено поведение полимерных производных белков,
обладающих нижней критической температурой смешения (НКТС), вблизи
точки фазового перехода и показано, что фазовому расслоению
предшествует изменение конформации макромолекул, которое приводит к
их ассоциации и образованию нерастворимой фазы;
2) обнаружена зависимость НКТС и биологической активности
полимерных производных белков не только от соотношения
белок/полимер-носитель, но и от конфигурации этих производных;
3) предложен подход к созданию макромолекулярных
терапевтических систем, повышающих устойчивость полипептидов к
ферментативному гидролизу и обеспечивающих направленный транспорт
полипептидов в кровоток через пищеварительную систему;
4) изучен процесс химической модификации полипептидов
соединениями, обеспечивающими их направленный транспорт, и
продемонстрирована зависимость активности синтезированных
производных от химической природы полипептидов, а также конформации
и размеров их макромолекул;
5) предложено использовать биоспецифические взаимодействия
для направленного транспорта гидрогелевых частиц и предварительно
введенного в них, но химически с ними не связанного полипептида;
6) на основе сополимеров акриламида с N-(2-D-niK>K03)-
акриламидом, сшитых конканавалином А, созданы химические системы,
работающие по механизму обратной связи и способные выделять
предварительно введенный в них инсулин в ответ на достижение
определенной концентрации глюкозы в окружающей среде;
7) обнаружено, что при взаимодействии таких гидрогелей с
растворами глюкозы различной концентрации, существует пороговая
концентрация глюкозы, при достижении которой наблюдается быстрый
переход гидрогеля в растворимое состояние с эмиссией инсулина, и
определены значения пороговой концентрации для сополимеров
различного состава.
Разработанные основы создания и применения биоспецифических полимерных материалов, способных целенаправленно изменять свои свойства по механизму обратной связи в процессе эксплуатации, позволяют вплотную подойти к решению некоторых принципиально важных проблем современной химии медико-биологических полимеров. В первую очередь это относится к решению проблемы направленного транспорта лекарственных веществ путем их иммобилизации на полимерах с НКТС и последующего нагревания мишени до температуры, выше НКТС. Другой решаемой проблемой является проблема контролируемого выделения биологически активного вещества. Нами разработаны подходы к созданию полимерных систем, выделяющих заданное количество биологически активного вещества не только в ответ на изменение температуры или рН окружающей среды, но также реагирующих на изменение концентрации глюкозы, то есть способных моделировать функцию поджелудочной железы - выделять определенное количество
10 инсулина в ответ на появление определенного количества глюкозы в окружающей среде.
Сформулированные в работе подходы к направленному транспорту полипептидов с одновременным повышением их устойчиврсти к ферментативному гидролизу путем их ковалентного связывания с ингибиторами ферментов или путем физической иммобилизации в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибитором ферментов, могут быть использованы при создании полипептидных лекарственных препаратов для перорального применения.
Практическая значимость некоторых частей работы подтверждена патентами РФ, положительными результатами экспериментов на животных и клиническими испытаниями.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном семинаре «Инсулин: получение, производство, применение» (Минск, 1995); Первой и Второй Международных конференциях «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Санкт-Петербург, 1996, 1998); European Symposium «Formulation of poorly-available drugs for oral administration» (Paris, 1996); Международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (Москва, 1997); Четвертом и Пятом Симпозиумах «Химия протеолитических ферментов», (Москва, 1997, 2002); Третьей Белорусской научно-практический конференции «Эфферентные и физико-химические методы терапии» (Могилев, 1998); The 26і International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials (Boston, 1999); 1st Workshop of Young European Scientist (Lodz, 2002), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2005, 2006), 22-ом и 23-ем Симпозиуме по реологии (Валдай, 2004, 2006), конференции "MedBioTech-2006" (Москва, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 статей в научных журналах, получено 2 патента Российской Федерации,
11 опубликовано 16 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Личный вклад автора. Автор является инициатором выбора направления данного исследования, лично проводил работы по синтезу полимерных производных биологически активных соединений, изучению их строения и свойств. Разработал новый методический подход к созданию универсальных транспортных систем направленного транспорта биологически активных соединений. Автор принимал непосредственное участие в проведении экспериментов на животных и клинических испытаниях.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 211 страницах печатного текста и включает 59 рисунков, 43 таблицы и 13 схем. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (298 наименований).
Некоторые подходы к созданию полимерных систем для направленного транспорта лекарственных препаратов
Создание лекарственных препаратов направленного действия (ЛПНД), относится к наиболее бурно развивающейся области химии медико-биологических полимеров. Только на последнем (2006 года), ежегодно организуемом обществом «Controlled Release Society», симпозиуме было представлено более 500 докладов, посвященных проблемам контролируемого выделения лекарств и создания ЛПНД. Это общество объединяет более 2500 членов из почти 50 стран, и примерно 2/3 его членов являются представителями промышленности.
Первая модель ЛПНД, предложенная еще в начале прошлого века П. Эрлихом [1], предполагала прямую связь лекарства с носителем и нашла свое успешное воплощение в работах, связанных с использованием моноклональных антител одновременно в качестве и векторов, и носителей [2-4]. В дальнейшем эта модель была модернизирована X. Рингедорфом [5], и в ее состав были включены блоки, обеспечивающие растворимость и узнавание мишени (вектор), а также лекарство, присоединенное к полимеру через специальные вставки - спейсеры. Все блоки были объединены полимером-носителем, поэтому вся система представляла собой единое макромолекулярное образование.
Модель X. Рингсдорфа основана на представлении об аддитивности свойств компонентов, входящих в состав ЛПНД: физико-химические характеристики системы определяются в основном полимером-носителем, а биологическая активность - остальными компонентами, включая лекарство. Возможность варьировать структуру полимерного носителя и изменять взаимное расположение компонентов ЛПНД позволяли в широких пределах регулировать фармакологические и фармокинетические свойства ЛПНД [5]. Дальнейшее развитие работ в этой области сводилось, в основном, к поиску подходящих полимеров-носителей, отвечающих все более возрастающим требованиям к таким полимерам, и молекул-векторов, в минимальной степени изменяющих свойства входящих в систему компонентов и более избирательно взаимодействующих с органом-мишенью или даже отдельными клетками. Много усилий было уделено выяснению основных закономерностей взаимодействия ЛПНД с тканями живого организма и изучению путей вывода всей системы или отдельных ее компонентов из организма. Среди принципиальных решений, появившихся за это время, следует отметить разработку методов повышения эффективности использования вектора за счет большего насыщения ЛПНД биологически активным компонентом, а также использование «умных» полимерных носителей, изменяющих свою конформацию при незначительных изменениях параметров окружающей среды и поэтому способных одновременно с функцией носителя выполнять роль молекулы-вектора.
К полимеру-носителю предъявляется ряд специфических требований, таких как растворимость в воде, нетоксичность и биосовместимость, наличие функциональных групп, к которым в достаточно мягких условиях можно присоединять все входящие в систему блоки (как правило, это группы —ОН, —NH2, —СНО, —СООН).
ММ и ММР полимера-носителя определяют длительность циркуляции всей системы в кровяном русле. С одной стороны при необходимости попадания ЛПНД внутрь клеток посредством эндоцитоза полимер-носитель должен иметь достаточно высокую ММ, с другой стороны, для выведения через почки ММ должна быть сравнительно низкой. Экспериментальным путем было установлено, что минимальная ММ полимера-носителя должна быть не ниже 20000, а максимальная - не выше 80000 [6]. При этом предпочтение отдается биодеградируемым полимерам, наиболее легко выводящимся из организма [7]. В качестве таких полимеров наибольшее распространение нашли полисахариды, такие как декстраны, крахмал и их производные, которые не обладают острой или хронической токсичностью, а наличие в их макромолекулах большого количества функциональных групп облегчает присоединение активных компонентов [8]. Для иммунодепрессантов и канцеролитических средств в качестве полимеров-носителей используют транспортные белки [9].
Следует отметить, что идеального полимера-носителя, полностью удовлетворяющего всем перечисленным требованиям, пока нет и, вряд ли, он будет синтезирован. Применяемые в настоящее время для направленного транспорта полимерные носители обычно разделяют на два типа: водорастворимые синтетические и природные полимеры и коллоидные системы - полимерные частицы и липосомы. Однако существуют носители, не укладывающиеся в такую классификацию. Так, предложено, например, использовать в качестве носителей сложные полиионные мицеллы, образующие в водных средах пары противоположно заряженных блоксополимеров с полиэтиленгликольными сегментами [10], а также гидрогели [11].
Одним из наиболее распространенных классов известных водорастворимых полимеров является декстран и его производные, которые хорошо зарекомендовали себя в биологическом плане: они практически не токсичны и не антигенны, способны к биодеструкции [12-14]. Наличие в декстране большого количества гидроксильных групп обеспечивает возможность его модификации; так модификация карбоксиметилдекстрана остатками Сахаров (галактозы и маннозы) позволила получить новый полимерный носитель для направленного транспорта [14].
Большие надежды возлагались на использование в качестве носителей белков и, в первую очередь, сывороточного альбумина, глобулинов и антител. Так, например, в экспериментах in vivo сывороточный альбумин, связанный с остатками галактозы или глюкозы, обеспечивал направленный транспорт к клеткам печени связанных с ним лекарств [15]. Однако применение белков зачастую ограничено необходимостью в каждом конкретном случае детального изучения их иммунологических (антигенность, иммуногенность), фармакологических (стабильность, растворимость) и биофармакологических (абсорбция, распространение, метаболизм) свойств [16].
С этих позиций достаточно перспективным представляется использование полиаминокислот, например, поли-а-Ь-глутаминовой кислоты, как упрощенной модели белка [17-20]. В большинстве случаев токсичность их невелика, а антигенные свойства выражены достаточно слабо. Сополиконденсацией различных аминокислот и пептидов удается синтезировать носители с требуемыми функциональными группами и необходимой гидрофильностью [17, 18]. Полиаминокислоты биодеструктируемы и распадаются в организме до биогенных низкомолекулярных соединений. Например, использование в качестве носителя а,р-поли-1Ч-гидроксиэтил-ВЬ-аспартамида позволило получить макромолекулярную форму противоракового препарата Цитарабина, которая обладала высокой стабильностью и нашла применение при противопухолевой хемотерапии [21].
Из других гетероцепных полимеров можно выделить довольно широкий круг биодеструктируемых полиуретанов, подверженных как ферментативному, так и неферментативному гидролизу в средах живого организма и полученных посредством использования моно-, ди- и полисахаридов в качестве гликолей при поликонденсации с различными изоцианатами [22]. Гетероцепные полимеры, содержащие в основной цепи звенья аминокислот и пептидов (полиамиды, полиуретаны, полимочевины и полиэфиры), синтезируемые методом «активированной поликонденсации», подвержены ферментативной деструкции, благодаря наличию в их макромолекулах звеньев природных соединений, содержащих связи СО—NH, СО—О и др. [23, 24].
Термо- и рН-чувствительные полимерные носители
Как уже отмечалось, одним из наиболее универсальных, а главное -простых, способов получения ЛПНД является иммобилизация БАС на полимерных носителях, способных одновременно выполнять и векторные функции, то есть транспортировать БАС в определенный участок организма. К таким носителям следует отнести полимеры, макромолекулы которых могут при изменении некоторых параметров окружающей среды претерпевать конформационные изменения, приводящие к фазовым переходам.
Примером таких носителей могут служить полимеры, обладающие НКТС в водных растворах. Использование термоактивации в качестве движущей силы процесса направленного транспорта представляется достаточно перспективным, поскольку в зонах воспаления или новообразований нередко наблюдается местное повышение температуры, что должно обеспечивать самопроизвольное концентрирование лекарства в этих зонах. Кроме того, почти всегда существует возможность локального нагревания органа-мишени и принудительного транспорта лекарства в этот орган.
Естественно, что использование термоактивации, в качестве движущей силы транспорта возможно только при соблюдении двух условий. Во-первых, после иммобилизации БАС полимер-носитель должен сохранять способность к фазовому переходу при температурах выше НКТС, то есть осуществлять транспортную функцию. Во-вторых, полимер-носитель не должен оказывать денатурирующее воздействие на молекулу БАС при температурах выше НКТС.
Как известно, растворы полимеров являются молекулярно дисперсными системами и удовлетворяют основным критериям истинных растворов, таким как самопроизвольность образования, термодинамическая устойчивость, равновесность и обратимость, постоянство концентрации во времени, однородность и гомогенность. С термодинамической точки зрения образование растворов полимеров как самопроизвольный процесс сопровождается уменьшением энергии Гиббса: Gc,=(Gp_pa- GKOMn) 0, (1) где AGCM - изменение энергии Гиббса при растворении, Gp.pa -энергия Гиббса раствора, а ШКОМп - сумма энергий Гиббса компонентов до растворения. Энергия Гиббса связана с изменением энтальпии и энтропии процесса уравнением: L\G =АН AS , СМ СМ СМ ГДЄ /Лг1см — Мр.ра - 2 Г1К0МП, а /лосм = Ор.ра - 2/ОК0МП. Из условия AGCM 0 следует, что самопроизвольное растворение полимера происходит в нескольких случаях. 1. АНСМ О, ASCM О Растворение экзотермично и сопровождается возрастанием энтропии. Энергия взаимодействия между разнородными молекулами больше, чем между однородными. 2. ЛНСМ О, ASCM 0, при условии \ЛНСМ\ \TASCM\ Растворение также экзотермическое, но сопровождается уменьшением энтропии за счет иммобилизации растворителя в образующихся сольватных оболочках макромолекул. При повышении температуры такие системы расслаиваются. 3. АНСМ О, ASCM 0, при условии \ЛНСМ\ \TASCM\ Растворение эндотермическое и сопровождается возрастанием энтропии, причем расслаивание в таких системах происходит при понижении температуры [106].
Для систем полимер - растворитель можно построить кривые растворимости в координатах «температура - состав». Известно несколько типов таких фазовых диаграмм. Так, для растворов, расслаивающихся при понижении температуры, характерны кривые растворимости с максимумом, называемым верхней критической температурой смешения (ВКТС). Кривые растворимости для систем, расслаивающихся при повышении температуры, имеют минимум, т.н. нижнюю критическую температуру смешения (НКТС). Эти два случая представлены на рис. 3 (а и б, соответственно). Кроме того, для некоторых систем характерны открытые или замкнутые (никотин-вода) кривые (рис. 3 г, д). Практически во всех случаях построенные на основании экспериментальных данных кривые растворимости имеют некоторую «толщину», вследствие полидисперсности образца.
В настоящее время известно более десяти N-алкилзамещенных полиакрил амидов, обладающих НКТС [107]. Природа возникновения НКТС у растворов таких полимеров, в частности у поли-N 35 изопропилакриламида [108] заключается в том, что, растворяясь в воде, они образуют неявно выраженные Н-связанные структуры, которые, по-видимому, не образуются при растворении незамещенного полиакриламида. Разрушение этих структур (при добавлении LiCl или мочевины) приводит к понижению НКТС для поли-N-изопропилакриламида, но не изменяет характеристическую вязкость ПАА. По степени уменьшения растворимости под действием мочевины поли-N-изопропилакриламид подобен полиметакриловой кислоте (ПМАК) и полиметакриламиду (ПМАА).
Однако растворимость в воде поли-]Ч-изопропилакриламида существенно повышается (он становится растворимым даже при кипении воды) при добавлении C SC ONa, что обычно объясняют гидрофобным связыванием [108].
Методом ИК-Фурье-спектроскопии [109] показано, что наличие НКТС в водных растворах N-замещенных полиакриламидов связано, с одной стороны, с возможностью образования неявно выраженных Н-связанных структур, которые определяют растворимость полимера. С другой стороны, оно связано с присутствием в полимере гидрофобного фрагмента, отвечающего за нерастворимость полимера при разрушении Н-связанных структур (рис. 4). Предполагается, что в растворе полимеров с НКТС существует равновесие между двумя (как минимум) конформационными структурами мономерных звеньев, одна из которых определяет растворимость полимера, а другая - фазовое расслоение. По мере разрушения Н-связанных структур происходит как бы постепенное увеличение концентрации гидрофобных подвесок на цепи и при определенной их концентрации полимерный клубок резко меняет свою конформацию (схлопывается) [ПО]. В связи с этим становится также понятной зависимость величины НКТС от структуры алкильного радикала. Удлинение радикала (при длине цепи больше С2), его разветвление, а также дизамещение ведут к дестабилизации Н-связанных циклических структур за счет теплового движения и, следовательно, к уменьшению НКТС [108].
Наличие Н-связанных структур обусловливает различие в поведении имеющих и не имеющих НКТС полимеров N-замещенных акриламидов при изменении температуры. Оказалось, что образцы, не имеющие НКТС, ведут себя как обычные твердые тела, т.е. расширяются при нагревании и сжимаются при охлаждении. Иначе ведут себя образцы с НКТС, в которых структура, соответствующая температурам ниже НКТС, является наиболее рыхлой. Известно, что такая аномалия (например, для Н20) обусловлена образованием при низких температурах устойчивых Н-связанных структур, препятствующих плотной упаковке. В данном случае, разрыхление связано не с системой амидных Н-связей, которые есть во всех образцах (с НКТС и без НКТС), и не с изменением структуры кристаллогидратной воды, которая практически не зависит от наличия НКТС, а с наличием специфической Н-связанной структуры (рис. 5), возможность существования которой подтверждается данными ИК-спектроскопии и квантово-химическими расчетами.
Водорастворимые производные инсулина и овомукоида
Достаточно перспективным представляется использование другого типа носителей, ориентированных на самопроизвольное концентрирование в определенном месте организма, за счет биоспецифического взаимодействия с локализованными в этом месте химическими соединениями.
Примером такого носителя является уже упомянутый выше овомукоид из белка утиных яиц, который обладает поливалентной антипротеиназной активностью по отношению к сериновым протеиназам -трипсину, а-химотрипсину, лейкоцитарной и панкреатической эластазе, лейкоцитарным катепсинам G, а также некоторым бактериальным протеиназам [151]. В настоящее время разработанный в нашей лаборатории препарат овомукоида («Овомин») используют для детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, которая приводит к необратимому разрушению присутствующих в крови веществ белковой природы. При этом овомукоид нейтрализует активированные формы протеиназ, не изменяя концентрацию ингибиторов этих ферментов. Введение овомукоида обеспечивает балансировку в системе протеиназы-ингибиторы, следствием чего является стабилизация основных показателей системной гемодинамики, нормализация сосудистой проницаемости, снижение наработки кардиотропных, вазатропных и других биологически активных пептидов, устранение гиперактивности кинин-калликреиновой и свертывающей системы крови. Характер распределения овомукоида в различных органах животного после внутривенного введения представлен на рис. 24 [152]. Наблюдаемое неравномерное распределение овомукоида в различных органах уже само по себе может быть использовано для повышения избирательности концентрирования связанного с овомукоидом БАС в определенном органе, например, в почках.
Однако более перспективным представляется применение овомукоида в качестве носителя БАС белковой природы для их перорального введения. Это предположение основывается на химическом строении овомукоида, который относится к классу гликопротеинов, то есть наряду с полипептидной частью его макромолекула содержит и углеводный участок. Известно [153], что слизистая оболочка тонкого кишечника, где, в основном, и происходит всасывание в кровоток большинства соединений, содержит большое количество лектинов -белков, способных избирательно и обратимо связывать углеводы. В связи с этим логично предположить, что при попадании в тонкий кишечник овомукоид будет не только ингибировать действие пищеварительных ферментов и предотвращать ферментативный гидролиз связанного с ним БАС, но и избирательно концентрироваться на стенках кишечника за счет биоспецифического взаимодействия углеводной части его молекулы с лектинами слизистой оболочки. Кроме того показано [154], что при введении в тощую кишку овомукоид модулирует как внутри-, так и межклеточную проницаемость стенок кишечника, при этом увеличивая интенсивность всасывания модельных белков.
В качестве модельного БАС белковой природы в данной работе был выбран инсулин - полипептид, вырабатываемый [3-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин является универсальным гормоном, влияющим на большое число процессов, протекающих в организме, таких как: транспорт глюкозы через мембрану; утилизация глюкозы; ингибирование глюконеогенеза (образования глюкозы из предшественников неуглеводной природы); метаболизм глюкозы; метаболизм липидов; метаболизм белков; размножение клеток и т.д.
Экспериментально доказано, что все эффекты инсулина независимы и самостоятельны [155]. Молекула инсулина состоит из двух цепей, обозначаемых А и В, которые связаны между собой двумя дисульфидными мостиками, соединяющими остаток А7 с остатком В7 и остаток А20 с остатком В19. Третий дисульфидный мостик связывает 6 и 11 остатки А-цепи. Локализация всех трех дисульфидных мостиков постоянна. А и В-цепи инсулина у представителей большинства видов имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.
У различных видов животных в обеих цепях во многих положениях встречаются замены аминокислотных остатков, не оказывающие влияние на биологическую активность гормона, наиболее часты замены по положениям 8, 9 и 10 А-цепи. Из этого следует, что данный участок молекулы не имеет критического значения для биологической активности инсулина. Однако некоторые участки и области молекулы обладают высокой консервативностью. К ним относятся: положение трех дисульфидных мостиков, гидрофобные остатки в С-концевом участке В-цепи, С- и N- концевые участки А-цепи.
Наибольшее структурное сходство наблюдается у инсулинов человека, свиньи и быка. В связи с этим до тех пор, пока инсулин человека не научились синтезировать методом генной инженерии, для терапевтических целей использовали обычно бычий и свиной инсулин [156].
В физиологических условиях выделяемый поджелудочной железой инсулин секретируется в поджелудочную вену, непосредственно соединенную с воротной веной, по которой из кишечника к печени транспортируются также и продукты пищеварения. При этом печень осуществляет контроль количества проходящего через нее гормона. Если количество поступающего инсулина слишком велико, то часть его инактивируется в печени, предохраняя организм от избытка гормона. При инъекционном введении печень теряет такой контроль, и концентрация инсулина в крови может быть выше необходимой на данный момент времени. Это, в свою очередь, может приводить к гипогликемии, а также к неконтролируемому росту клеток кровеносных сосудов с их сужением и повышением турбулентности тока крови и т.д., что часто наблюдается у больных сахарным диабетом [156].
Описанный выше механизм поступления инсулина диктует и основной подход к достижению физиологического соотношения между концентрациями инсулина и глюкозы в крови, который заключается в направленном транспорте инсулина в кровоток через печень, подключая ее тем самым в регуляцию концентрации инсулина в периферийных органах [157]. Этого можно достичь только путем перорального введения гормона, при котором, всасываясь в кровоток через слизистую оболочку кишечника вместе с продуктами пищеварения, инсулин попадает через сеть капилляров в воротную вену [158], а затем в печень.
Преимущества перорального применения инсулина настолько велики и очевидны, что, начиная с момента обнаружения лечебного действия этого гормона в 1922 г. [159], не прекращаются попытки создания препаратов инсулина, устойчивых к действию протеиназ пищеварительного тракта и способных проникать в кровь через слизистую оболочку кишечника.
Главными препятствиями, возникающими при создании таких препаратов инсулина, как и других лекарств полипептидной природы, являются их гидролиз протеиназами желудка и кишечника, а также ограниченное всасывание препаратов в кровоток через слизистую оболочку кишечника, обусловленное большими размерами молекул. При этом, как показано в работе [160], даже при внутрикишечном введении полипептидов (минуя желудок) около 75 % препаратов разрушаются под действием протеиназ уже в первые полчаса и в кровоток попадает только 0,5 % от первоначально введенного количества. Фактически задача создания инсулина для перорального применения сводится к обеспечению безопасного пути прохождения инсулина через агрессивную среду желудка и к нейтрализации протеолитических ферментов тонкого кишечника с максимальным концентрированием инсулина на его стенках.
Полимерные частицы - носители белковых препаратов
Принцип действия таких оболочек основан на различиях в составе сред желудка и кишечника, в первую очередь на различиях в рН. Поскольку рН желудка (1,0-2,5) является более кислым, чем рН кишечника (6,6-7,5) [212], то наиболее разумным для создания защитных оболочек представляется использование полимерных кислот. Эти соединения практически не набухают в кислой среде, но достаточно быстро растворяются в нейтральных и щелочных средах.
Для получения защищенных препаратов инсулин (его композицию) иммобилизовали в объеме гидрогеля на основе сшитых полимерных кислот или помещали в желатиновую капсулу или в другой инертный водорастворимый полимер, который покрывали пленкой полимерной кислоты [213-215]. Использование таких систем, хотя и приводило к некоторому снижению концентрации глюкозы в крови подопытных животных, особенно при совместной иммобилизации инсулина и ингибиторов протеолитических ферментов тонкого кишечника, однако эффективность действия инсулина, введенного перорально животным, не превышала 10% от эффективности действия инъекционного инсулина [184, 199].
Несколько лучшие результаты были получены при использовании микросфер на основе сшитого полимера акриловой кислоты (Eudragit 100) [216, 217]. В опытах in vitro было установлено, что при рН 1,0 максимальное количество выделяющегося за 2 часа инсулина не превышает 2,5 % от введенного количества. В фосфатном буфере (рН 7,4) в течение первого часа из микросфер выделялось 22 % инсулина, а в течение последующих пяти часов дополнительно выделялось 28 % гормона. Пероральное введение таких микросфер совместно с апротинином (панкреатическим ингибитором протеолитических ферментов) и солями желчных кислот (ускорителями диффузии через стенки тонкого кишечника) здоровым кроликам и крысам с экспериментальным диабетом обеспечивало снижение уровня глюкозы в пределах до 37 %, что составляло около 12 % от эффективности такого же количества гормона, введенного подкожно. Следует также отметить пролонгированность действия перорально введенного инсулина - гипогликемический эффект наблюдался в течение 6 часов после введения композиции.
Достаточно большое внимание было уделено исследованию защитных систем на основе гидрогелевых частиц, образующихся за счет водородных связей между молекулами полиметакриловой кислоты и полиэтиленгликоля (ПЭГ). В первую очередь обращает на себя внимание простота получения защищенных белковых препаратов [218]. Для их приготовления белок сначала растворяли в фосфатном буфере (рН 7,4), а затем туда же добавляли предварительно высушенный гидрогель. После насыщения белком гидрогель отфильтровывали и промывали 0,1 М раствором НС1; при этом происходило коллапсирование гидрогеля, то есть образование микрочастиц, которые и собирали, используя метод центрифугирования. Кроме простоты получения, использованный метод обеспечивал высокую степень вхождения белка в микрочастицы (выше 90% от исходно взятого количества). В опытах in vitro было установлено, что при кислых значениях рН (2,2) инсулин из подобных микрочастиц практически не выделялся, а при повышении рН до 6,5 происходило быстрое выделение содержащегося в микрочастицах полипептида. Изучение эффективности действия этих систем показало, что биодоступность инсулина (эффективность действия инсулина по сравнению с инъекционно введенным гормоном) составляет от 4,6 % до 7,2 % [219, 220]. При этом было показано, что увеличение молекулярной массы ПЭГ (от ПЭГ-400 до ПЭГ-1000), то есть уменьшение степени сшивания гидрогеля, приводит к уменьшению биодоступности инсулина [221].
Большой интерес с точки зрения возможного практического применения препарата представляют результаты изучения зависимости биодоступности инсулина от размеров гидрогелевых частиц [222-224]. Показано, что для частиц с размером меньше 50 мкм биодоступность инсулина достигает примерно 10 %, в то время как для частиц большего размера не превышает 1 %. По-видимому, это связано с различиями в адгезии частиц различного размера к слизистой оболочке кишечника. Для маленьких частиц она должна быть максимальна и, следовательно, абсорбция инсулина из маленьких частиц должна превосходить аналогичный параметр для частиц большего размера. На рис. 34 показана зависимость уровня глюкозы в крови крыс с экспериментальным диабетом от времени при пероральном введении инсулина, инкапсулированного в частицы ПМАК-ПЭГ геля размером менее 53 мкм. Видно, что введение препарата инсулина предотвращает резкое повышение уровня глюкозы в крови, обычно наблюдающееся после приема пищи. Для увеличения биодоступности инсулина было предложено модифицировать рН-зависимый гель хитозаном [225].
