Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1. Общие представления о механизме свертывания крови и тромбообразование на полимерной поверхности 9
1.2. Состав и структурные особенности адсорбционного белкового слоя на полимерной поверхности 17
1.3. Кинетика адсорбции плазменных белков на полимерной поверхности 37
1.3.1. Определение равновесной концентрации белка на поверхности . 41
1.3.2. Исследование влияния различных факторов на скорость адсорбции для качественного описания процесса 41
1.3.3. Моделирование адсорбционного процесса в системах полимер - белок 49
Глава 2. Дофузионно кинетическая модель адсорбции белков на гидрофобной полимерной поверхности 61
2.1. Кинетические уравнения образования белкового слоя на гидрофобной полимерной поверхности 61
2.1.1. Кинетика необратимой адсорбции 61
2.1.2. Обратимая адсорбция непосредственно на поверхность 63
2.1.3. Обратимая адсорбция в результате белок -белковых взаимодействий 63
2.2. Моделирование явлений переноса в жидкой фазе 66
2.3. Основные закономерности кинетжи адсоебщи, как следствия из диффузионно-кинетической модели 72
2.3.1. Влияние начальной концентрации белка в растворе на скорость адсорбционного процесса 73
2.3.2. Зависимость скорости адсорбции от коэффициента диффузии 76
2.3.3.Влияние толщины диффузионного слоя на скорость адсорбции плазменных белков 77
2.3.4. Влияние константы скорости конформационных превращений макромолекулы на скорость образования адсорбционного слоя 80
2.3.5. Зависимость кинетики накопления бедка на полимерной поверхности от констант скоростей адсорбции и десорбции обоих слоев 80
2.3.6. Моделирование процесса десорбции обратимого слоя 86
2.4. Модификации модели и перспективы их применения для изучения сложных адсорбционных процессов 93
2.4.1. Адсорбция на поверхности сополимера 94
2.4.2. Адсорбция из смеси белков 95
2.4.3. Моделирование кинетики конформационных превращений 98
Глава 3. Экспериментальная часть. метод определения параметров адсорбционных систем полимер - белок 102
3.1. Материалы и методы исследования 102
3.1.1. Биологические объекты 102
3.1.2. Полимерные материалы, использованные в работе 102
3.1.3. Буферные растворители 103
3.1.4. Рабочий диапазон концентраций белковых растворов 104
3.1.5. Приборы, используемые в работе 104
3.1.6. Приставки МНПВО 105
3.1.7. ЭПР - метка 105
3.1.8. Установка для проведения адсорбции 106
3.1.9. Калибровочные эксперименты 106
3.1.10. Полосы внутреннего стандарта в Ж -спектрах полимерных материалов 109
3.1.11. Синтез спин-меченого У - глобулина 109
3.1.12. Адсорбция спин-меченого jf - глобулина на полиэтилене 111
3.1.13. Получение ЭПР - спектров у - глобулина 111
3.1.14. Подготовка и ход кинетического эксперимента 111
3.1.15. Ошибка в определении концентрации белка на полимерной поверхности . 112
3.2. Обоснование экспериментальных исследований 113
3.2.1. Цель экспериментальной работы 113
3.2.2. Выбор биологических объектов 114
3.2.3. Выбор экспериментальных методов исследования 115
3.2.4. Порядок проведения эксперимента 116
3.3. Рассчет физико-химических параметров адсорбции 117
3.3.1. Определение предельной концентрации необратимого слоя и параметров обратимой адсорбции 117
3.3.2. Определение констант скоростей необратимого адсорбционного процесса 124
3.3.3. Проверка полученных значений параметров, общая характеристика полимер - белковой системы Т27
Глава 4. Сравнительное исследование адсорбции белков плазмы крови на полимерные поверхности 132
4.1. Физико-химические параметры адсорбции различных белков на поверхности гидрофобных полимеров 132
4.2. Зависимость кинетжи адсорбции от рН среды 144
4.3. Исследование структуры белка, адсорбированного на гидрофобной поверхности 146
4.4. Исследование влияния природы полимера на кйнетжу адсорбции белков плазмы крови 153
Выводы 167
Литература 169
Приложение 187
- Состав и структурные особенности адсорбционного белкового слоя на полимерной поверхности
- Основные закономерности кинетжи адсоебщи, как следствия из диффузионно-кинетической модели
- Полосы внутреннего стандарта в Ж -спектрах полимерных материалов
- Исследование влияния природы полимера на кйнетжу адсорбции белков плазмы крови
Введение к работе
Многоплановость использования полимеров в медицине (искусственные органы, ткани и сосуды, клапаны сердца, диализно-диффузионные системы, биоклеи, лекарственные микрокапсулы и т.д.) обуславливает различие требований, предъявляемых к материалу, предназначенному для решения того или иного практического вопроса. При этом, общим условием эффективной работы высокомоле-кулярного изделия является его способность выполнять свои функции, не вызывая ответных реакций со стороны живого организма, не нарушая его естественного метаболизма. Создание и внедрение полимеров в терапевтическую и хирургическую практику ставит перед исследователями проблему изучения взаимодействия материалов нефизиологического происхождения с окружающими их биологическими жидкостями и тканями и, в первую очередь, с кровью, которая может рассматриваться по отношению к полимерам как специфически агрессивная среда.
Одной из наиболее важных задач, возникающих при оценке ге-мосовместимых свойств полимерного имплантата, является установление корреляции между его физико-химическими параметрами и интенсивностью процесса тромбообразования, происходящего на данной яефизиологической поверхности. В соответствии с современными представлениями первичной стадией, тромбообразования на поверхности инородного материала является адсорбция белков плазмы крови. Изучение адсорбции плазменных белков позволяет дать науке о полимерах биомедицинского назначения теоретические представления о механизме тромбообразования, необходимые для целенаправ ленного решения проблемы гемосовместимости. Кроме того, исследование адсорбции в системах полимер - белок может найти применение в пищевой, химической и других отраслях народного хозяйства.
К настоящему времени накоплен большой объём экспериментальных результатов в области изучения адсорбции плазменных белков на полимерной поверхности. Однако, аргументированные представления о стадиях этого процесса и их кинетике, практически, отсутствуют. В связи с этим, исследование механизма адсорбционного процесса в системах полимер - белок и изучение его кинетических закономерностей имеет важное научное значение.
Целью настоящей работы являлось создание физической и математической модели адсорбционного процесса, изучение его отдельных стадий, определение физико-химических параметров полимер « белковых систем и исследование зависимости этих параметров от природы белка и полимера.
В работе впервые предложена научно обоснованная модель адсорбции глобулярных белков на поверхности гидрофобных полимеров. Модель учитывает многостадийный характер образования на поверхности белкового слоя, состоящего из необратимо и обратимо адсорбированных макромолекул. Рассматривается взаимосвязь процессов адсорбции, диффузии и гидродинамических условий. Показана зависимость скорости образования адсорбционного слоя от диффузионного транспорта макромолекул к поверхности.
Разработан кинетический метод определения физико-химических параметров адсорбционного процесса. Метод позволяет экспериментально разделить необратимый и обратимый белковые слои на поверхности.
В ходе экспериментального исследования различных систем белок - гидрофобный полимер показано, что необратимый белковый слой состоит из молекул, претерпевших конформационные изменения. Потеря белком нативной конформации вызывается его гидрофобным взаимодействием с поверхностью. Обратимый адсорбционный слой образуется, преимущественно, за счет гидрофадьных связей между белковыми макромолекулами.
Важным результатом работы является найденная корреляция между соотношением обратимого и необратимого слоев на гидрофобной полимерной поверхности и ее тромборезистентными свойствами.
Предложенный модельный подход позволяет систематизировать экспериментальные результаты, полученные в разных лабораторных условиях и различными методами.
Найденные закономерности позволяют на основе диффузионно-кинетической модели прогнозировать тромборезистентные свойства гидрофобных полимерных материалов. При этом, существует возможность оценить изменение гемосовместимости полимерного изделия при его имплантации в различные участки сосудистого русла кровеносной системы.
Полученные представления о механизме адсорбции в системах полимер - белок могут быть использованы при изучении процессов гемодиализа, ультрафильтрации, оксигенации и ряда других.
Материалы диссертации докладывались на 4-ой Всесоюзной конференции по диффузионным явлениям в полимерах (Звенигород,1980 г.), 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Рига, 1981 г.), на конкурсах научных работ ИХФ АН СССР (1980, 1982 гг.), на научных семинарах ВНИИ медицинских полимеров (1981 г.) и ИНБИ АН СССР (1983 г.).
Основное содержание работы опубликовано в 6 статьях и тезисах докладов.
Состав и структурные особенности адсорбционного белкового слоя на полимерной поверхности
Как отмечено выше, состав и структура белкового слоя,сформировавшегося в результате адсорбции, играет важнейшую роль в свертывании крови на поверхности полимерного материала. В связи с этим, особую ценность приобретает изучение их зависимости от природы высокомолекулярного соединения, комплекса его физико-химических свойств.
В настоящее время, фактически, доказано, что тип полимера оказывает влияние на количество адсорбированных молекул /"5I-56J7", хотя существуют единичные работы / 57_7, в которых определяющей считается, лишь природа белка. На случайный характер совпадения результатов накопления белка на разных материалах, возможно, за счет слабой роли гидрофильных взаимодействий, указано в /"56J при исследовании адсорбции фибриногена на поверхности полимеров, имеющих различную степень гидрофобноети. Не выдержало проверки предположение /"58_7 о ком, что количество белков, адсорбированных из смеси будет пропорционально их концентрации в растворе. Результаты, полученные как на гидрофобных, так и на гидрофильных полимерах / 23, 53, 59-62.7 показывают, что их сродство к белкам разного сорта, далеко, не одинаково.
Ряд исследователей Г 63-67 J7 уделяют основное внимание адсорбции белков непосредственно из плазмы крови. Главным критерием, на который обращают внимание авторы таких, сравнительно немногочисленных, работ, является преимущественное накопление белка того или иного типа. 2 0Л%?Л. и UaOtns [" t QQJ показывают, например, сильное сродство фибриногена к рассматриваемым ими гидрофобным и гидрофильным полимерам, Кш с сотрудниками /"42, 69_7 делает вывод, что основным компонентом адсорбционного слоя на полимерах, обладающих наилучшими гемосовместимыми свойствами, является альбумин, что согласуется с биохимической моделью автора. Аналогичные результаты содержатся и в работах других исследователей /"62, 67, 7Q7» Мы говорили, уже, о предположении 6&Qfi-tf и др. об антагонизме альбуминизации поверхности и тромбогенеза, также, полученных в экспериментах tti 2# /"45J7. Общим результатом данной категории работ следует считать оценку гемосовместимости материалов по степени их альбуминизации, рассчитанной в равновесных /"42, 54, 71,7 Ш!Ж кинетических /"63_7 усло« виях. Для характеристики тромбогенности полимера 3b&sA предлагав ет индекс, численно равный мольному отношению поверхностных концентраций фабриноген/альбумин, умноженному на концентрацию фибриногена /"54J, Подобный параметр для определения сродства белков и полимера в физиологических условиях вводят, также, Х./7?/я и Упдеъ / 71/(табл.1.1 и 1.2).
Трудности изучения в физиологических условиях структурного состава белкового слоя, его архитектуры, степени конформационных изменений, кинетики адсорбции и других особенностей процесса, определяющих интенсивность адгезии клеток, имеют следующие причины. Во-первых методическая сложность постановки адсорбционного эксперимента, близкого к условиям in VCVO, хотя с применением метода радиоактивных индикаторов /"55, 59, 63-66.7 и» особенно Фурье -спектроскопии /"70, 72 7 4J в этой области достигнут определенный прогресс. Во-вторых, анализ таких многокомпонентных систем, как плазма крови, без конкретного представления о поведении ее составляющих не может дать полной картины наблюдаемых явлений. Именно, поэтому, на современном этапе безусловная важность и полезность результатов, полученных при контакте полимеров со смесью белков или плазмой крови, ограничена поиском корреляции между адсорбшюн ными процессами и известными гемосовместимыми свойствами полимеров на уровне описанных выше эмпирических критериев.
С другой стороны, в настоящее время сформировалось научное направление работ, посвященное изучению адсорбции белков в модельных условиях. Такой подход предполагает исследование детальных закономерностей процесса и, далее, осторожную экстраполяцию полученных данных на явления, протекающие в живом организме /"ЗУ. После сопоставления полученных результатов с экспериментами in-ЧЇСУО открываются перспективы целенаправленного пути синтеза и модификации тромборезистентных высокомолекулярных материалов.
В зависимости от конкретной задачи исследования при изучении адсорбции белков используются разнообразные эксперименталь?-ные методы. Так, для определения количества адсорбированных макромолекул широкое распространение, наряду с методами Фурье -спектроскопии и радиоактивных индикаторов, получили: ИК - спектроскопия МНПВО /"52, 57, 75 J, УФ - спектроскопия /"76-78 J, гель - электрофорез /"79-81,7, эллипсометрия С82-87_7, калориметрия / 88 -91_7, потеншометрическое титрование / 92, 937", флюоресцентная спектроскопия С 94-97 J\ В большинстве работ изотермы адсорбции, выражающие зависимость поверхностной концентрации белка от его концентрации в растворе, описываются уравнением Лэнгмюра, при использовании которого предполагается, что установилось динамическое равновесие между процессами адсорбции и десорбции глобул. В то же время, существует мнение о необратимом характере адсорбционного процесса, неоднократно подтвержденное экспериментально / 98, 99J7 . Поэтому, в каждом конкретном случае, для интерпретации адсорбционных результатов необходимо установить является ли завершение адсорбции следствием установления термодинамического равновесия или оно обусловлено необратимым заполнением активных центров полимерной поверхности /" 3_7. Возможен,кроме того, вариант, когда на поверхности существуют два типа центров различной химической природы, например ионные и гидрофобные /"77 J7, что еще более усложняет картину адсорбции. На отклонение изотермической кривой от лэнгмюровской при малых концентрациях белка в объеме / С / указывает Sthniiit с соавторами / 56 /; причем, предлагается следующее уравнение где р - поверхностная концентрация белка, ( А& свободная энергия адсорбции, R. - газовая постоянная, 77 - температура, - коэффициент перехода от объема к поверхности в предположении посадки, при которой большая ось вращения молекулы параллельна поверхности /$Cde-on /; = 60 і ). При более высоких концентрациях характер зависимости меняется,что указывает на сложный механизм адсорбции.
Возможность формализации зависимости поверхностной концентрации от объемной в виде простого уравнения может объясняться разбросом экспериментальных точек fQj. Кроме лэнгмюровского, в качестве таких уравнений используются БЭТ / I00 J, уравнения Фрейн-длиха /"101 ] и другие. Рассчет термодинамических функций на основе изотермических кривых представлен в Г102 J при исследовании системы альбумин - амберлитовая смола XAD 7 . Применение простейших уравнений типа Лэнгмюра требует выполнения еще одного условия: суммарное количество белка на поверхности не должно превышать концентрацию монослоя. Различия в поверхностной концентрации белков, в некоторой степени, можно объяснить двумя видами посадки: Side- on. и e.nd- Oft (большая ось молекулы перпендикулярна поверхности). Предельные концентрации монослоя в зависимости от упаковки макромолекул на поверхности представлены в табл. 1.3 /2, 53, 63, 81./.
Основные закономерности кинетжи адсоебщи, как следствия из диффузионно-кинетической модели
В настоящем разделе изложены результаты, полученные при моделировании поведения адсорбционных систем полимер - белок.Общий принцип моделирования заключался в изменении одного-двух параметров, входящих в систему уравнения / 2.13 /, в широком интервале для того, чтобы исследовать ход адсорбционного процесса в диффузионной, кинетической и диффузионно-кинетической областях. Начальные условия к / 2.13 / выбирались в соответствии с экспериментом, изложенным в главе ІУ, а именно: Следует отметить, что начальные условия / 2.17 / справедливы для динамических экспериментов с различной геометрией адсорбционной ячейки и подводящих магистралей, в том числе, экспериментов С/г
Прежде, чем перейти к результатам моделирования, дадим общую характеристику изменению поверхностных концентраций &Ы , С$2 и С$4 в зависимости от времени (рис.2.1 ). Как видно из рис., концентрация нативных молекул монрслоя /Л/ / имеет мак симум на кинетической кривой и асимтотически стремится к нулю при і - , что объясняется наличием необратимого связывания белка с поверхностью. Концентрации необратимого и обратимого слоев / Csi и Csz / монотонно возрастают во времени до до стижения пределов, соответственно С$1 и На рис. 2.1 представлен, кроме того, графік функциональной зависимости относительной концентрации нативных молекул в составе адсорбционного слоя / &/См / от времени. Как видно из рис., эта зависимость имеет монотонно неубывающий характер. При изменении параметров, входящих в / 2.13 / получены следующие результаты. Увеличение начальной концентрации белка в растворе, согласно уравнениям / 2.4 /, /2,7 /, приводит к росту скорости образования прочно сорбированного и обратимо сорбированного слоев. В этих же условиях, при достижении СЕК равновесия доля обратимо сорбированных глобул ( Csz / s ) возрастает вплоть до величины y—j-( СГ - концентрация белка по завершении адсорбции). Учитывая обратимый характер процесса / 2.5 /, можно сделать вывод о том, что адсорбция белка, обладающего высокой объемной концентрацией (в плазме крови - альбумина), приводит к лучшему экранированию активных центров молекул, претерпевших конформационные изменения. Если придерживаться гипотезы, что необратимый слой является тромбогенным, полученный результат коррелирует с известными экспериментальными данными, согласно которым степень альбуминизации поверхности является количественным критерием ее тромборезистентности / 42, 54, 71_7.
В кинетической области при достаточно высоких концентрациях Су? , таких, что knCu»0j &цС?-&A t&#&&& и kifCv » fate решение / 2.16 / принимает вид: т.е. лимитирующей в процессе образования обоих слоев стано . вится стадия конформационных превращений. Это означает,что в любой момент времени все активные центры fi» будут закрыты нативными глобулами, т.к. Как следует из модели, в диффузионной области скорость накопления белка на полимерной поверхности должна возрастать с ростом его коэффициента диффузии в растворе.Именно в этом случае, наиболее явно проявляется важная роль диффузионных и гидродинамических параметров адсорбцион ных систем. Причем, время образования адсорбционного слоя обратно пропорционально коэффициенту диффузии белка На качественном уровне монотонное убывание времени заполнения поверхности от 9) сохраняется и в диффузионно-кинетической области (рис. 2.3 ). Однако, из-за влияния кинетических констант на скорость адсорбции дать аналитическое выражение этой зависимости, в данном случае,невозможно. Полученные нами результаты численного моделирования позволяют определенно утверждать, что, чем подвижнее макромолекулы в растворе, тем менее их перенос сказывается на кинетике заполнения поверхности. Как в экспериментальных ячейках, так и в организме изменение о связано с изменением гидродинамических условий. При моделировании нами установлено, что скорость адсорбции необратимого и обратимого белковых слоев пропорциональна числу Рейнольдса / /U. / и уменьшается с увеличением . Следовательно, при малых числах /к. длина диффузионного пути велика, что приводит к замедлению адсорбционного процесса. Поэтому, время образования белковых слоев в большинстве модельных экспериментов / /U 4/0; о" /О си / велико. Напротив, в артериаль ной системе организма реализуются высокие числа Рейнольдса (Ht. 100, КГ3 см о 10 см при скорости потока lf I м/сек ) и адсорбция завершается в течение нескольких секунд. Несоответствие в скорости адсорбции in- TfCVb и в лабораторном эксперименте / 54, 142 / объясняется, таким образом, неадекватностью гидродинамических и диффузионных условий (различием 3" ). Анализ кинетических кривых, приведенных на рис.2.5, показывает, что при больших значениях у лимитирующей стадией суммарной адсорбции становится стадия образования обратимого слоя. Для поверхностей, энергично взаимодействующих с ближайшими белковыми глобулами,характерно быстрое формирование необратимого слоя и последующее постепенное завершение процесса путем образования обратимого слоя. Следует ожидать, что поверхности, обладающие повышенной тромбогенностью, характеризуются высокими значениями АІ И, следовательно, малыми временами заполнения поверхности белком с измененной конформацией. При малых значениях «V /кі4 кцСи ; й -кг-і / стадия конформационных превращений становится лимитирующей, что в кинетической области приводит к уравнениям / 2.18 /.
Полосы внутреннего стандарта в Ж -спектрах полимерных материалов
Спин - меченый У - глобулин получали прибавлением по каплям 0,1-0,2 мл спиртового раствора метки к 10 мл раствора белка. Мольное соотношение белок: метка составляло 1:4. Реакцию проводили при интенсивном перемешивании ( = 20-22С ). Затем, раствор белка ставили на диализ против фосфатного буфера,несколько раз меняя буфер. После диализа раствор белка центрифугировали. I - сывороточный альбумин - полиэтилен; 2 фибриноген-полиэтилен; 3 - яичный альбумин - полиэтилен; 4 - сывороточный альбумин - по-лидиметилсилоксан (или полисилоксанкарбонат); 5 - фибриноген -полидиметилсилоксан/йолисилоксанкарбонат; 6 - сывороточный альбумин - Биомер. К раствору белка определенной концентрации добавляли мелкодисперсный полиэтилен и перемешивали в течение 3 часов. Адсорбент и белковый раствор разделяли фильтрованием через ватный тампон под давлением с помощью полиэтиленового шприца. Десорбцию белка проводили в тех же условиях: суспензионную смесь полиэтилена с белком перемешивали в 100-кратно заменяемых объемах буферного растворителя. Концентрация белка в супернатанте определялась спектрофотометрически. Регистрация спектров спин - меченого белка, адсорбированного на полиэтилене, проводилась в прямоугольном резонаторе прибора СшЛС&л. // f позволяющем проводить измерения в присутствии влаги. Спектры спин - меченого белка в растворе регистрировались в тонкостенных капиллярах с внутренним диаметром 0,05 см. Перед проведением эксперимента образцы полимера подвергались 2-х кратной обработке ацетоном и этиловым спиртом с целью обезжиривания поверхности, после чего помещались с двух сторон в адсорбционную ячейку (рис.3.1 ). Затем, проводилась предварительная промывка системы буфером в открытом режиме (рис.3.1. б ) с контролем герметичности ячейки.
Далее, буфер замещался на белковый раствор. После замещения, раствор белка протекал через ячейку с фиксированной скоростью в течение определенного отрезка времени (адсорбционный эксперимент). По завершении адсорбции система вновь промывалась буфером (десорбционный эксперимент). Адсорбционный эксперимент, в зависимости от длительности, проводился в замкнутом и открытом режимах, десорбционный -только, в открытом режиме. После окончания десорбционного эксперимента и удаления буфера образцы извлекались из ячейки, просушивались в эксикаторе над UOJCLI И, затем, концентрация белка на поверхности регистрировалась методом МНПВО. Минимальное время регистрации первой точки выбиралось равным времени прохождения фронта жидкости через ячейку (10 сек 100 сек, в зависимости от скорости потока). Все эксперименты проводились при комнатной температуре ( = 20-22С ). Погрешность в определении поверхностной концентрации адсорбированного белка обуславливается двумя основными причинами. Во-первых, при проведении последовательных операций (взвешивание, растворение, фиксация времени эксперимента, регистрация на спектрометре) увеличивается систематическая ошибка эксперимента, в целом (погрешности приборов приведены в 3.1.5 ). Во-вторых, возникает случайная ошибка, связанная с вероятностным характером ад- сорбционного процесса - неоднородностью и дефектностью поверхности полимера, возможными фяуктуациями гидродинамического потока, неравномерностью покрытия полимерного материала белковым слоем и т.д. Случайная ошибка оценивалась по воспроизводимостью каждой точки кинетической кривой. Эксперименты строились из рассчета - 4 значения на одну точку кривой, 10 точек - на кинетическую кривую. Воспроизводимость одной точки кинетической кривой - не менее 0,8, т.е. отклонение поверхностной концентрации белка от среднего значения в данный момент времени не превышала 20%.
Исследование влияния природы полимера на кйнетжу адсорбции белков плазмы крови
В разделе 4.1 было показано существование зависимости протекания стадий адсорбционного процесса от химической природы полимерного материала. Здесь, мы более подробно остановимся на характере этой зависимости. Прежде всего обратимся к таблицам 4.1 и 4.2 , в которых представлены физико-химические параметры адсорбции плазменных белков на поверхности полиэтилена и поли-диметилсилокеана. Как видно из таблиц, переход от одного материала к другому не сопровождается изменением константы скорости конформашюнных превращений fy ни для альбумина, ни для фибриногена. Этот факт вполне можно объяснить гидрофобным меха- низмом реакции конформашюнных превращений белка на поверхности, скорость которой в большей степени зависит от природы макромолекул, чем от вида гидрофобного полимера. В то же время,уменьшение константы Ян альбумина и, наоборот, возрастание ее для фибриногена при замене полиэтиленовой поверхности силиконовой, а , также, изменение предельной поверхностной концентрации обоих белков указывает на селективный характер первой стадии / 2.1 / полимер - белковых взаимодействий. Возможное объяснение изменения указанных параметров адсорбции альбумина при переходе к силиконовой поверхности заключается в падении доли метиленовых групп в полимере, которые, как отмечалось выше, имеют большое сродство к данному белку. В результате, при физиологических концентрациях белка в растворе и малых толщинах диффузионного слоя скорость накопления прочно адсорбированного фибриногена на силиконовой поверхности выше, чем на полиэтиленовой, а скорость необратимой адсорбции альбумина не меняется (рис.4.8 )
Определяющее значение химическая природа полимера имеет, как видно из таблиц 4.1 и 4.2 для кинетики обратимой адсорбции белков. На первый взгляд, такой вывод не лишен некоторой паро-доксальности, поскольку следовало ожидать большего влияния материала на белок - поверхностные, нежели на белок - белковые взаимодействия. Дело, на наш взгляд обстоит следующим образом. В результате посадки на. полимерную поверхность молекула претерпевает определенные структурные изменения. Несмотря на то, что скорости конформашюнных превращений на гидрофобных полимерах близки между собой, природа и степень внутримолекулярной перестройки глобулы может быть совершенно различной на разных материалах. В частности, об этом свидетельствует изменение числа активных центров на денатурированной молекуле альбумина (на по-лидиметилсилоксане - их в два раза меньше). Подобное различие может быть вызвано разницей межфазных энергий полиэтилена и по-лидиметилсилокеана, различием в механизме закрепления глобул или другими, неизвестными, пока, причинами. Конформационные изменения макромолекулы связаны, обычно / 46, 122./ с освобождением разнообразных реакционных групп ( S-H , Qf , $-$ и других), число и соотношение которых определяет возможность молекулы необратимого слоя вступить во взаимодействие с нативными глобулами. Можно предположить, что в случае альбумина, часть гидрофильных связей, освобождаемых при его адсорбции на полиэтилене, на силиконовой поверхности остается блокированной, что приводит к уменьшению констант скорости адсорбции и десорбции обратимого слоя ( &&/ , &гг ) и: константы его равновесия ( l(- &&L ). Совпадение для разных полимеров числа активных центров, образованных молекулой, входящей в состав необратимого слоя фибриногена, не свидетельствует, однако,.об идентичности ее структурной перестройки, поскольку наблюдается возрастание констант 4/ и Кгь при переходе от полиэтилена к полидиметилси-локсану.
Таким образом, имеют место две противоположные тенденции. С одной стороны, значительные конформашгонные изменения адсор-бированного белка должны неблагоприятно сказываться на тромбо-резистентных свойствах протеинированной поверхности / 2, 3J7. С другой - усиление реакционной способности освобожденных групп денатурированных молекул ведет к возрастанию скорости обратимой адсорбции и дезактивации прочно адсорбированного белка. Преобладание того или другого явления зависит от конкретного вида полимер - белковой системы и условий, в которых она находится. Оценка результирующего эффекта может быть проведена в рамках предложенной диффузионно-кинетической модели.
Общая характеристика адсорбционных свойств полиэтилена и полидиметилсилоксана по отношению к альбумину и фибриногену была дана в разделе 4.1. Здесь, целесообразно остановиться на влиянии гидродинамических условий на кинетику отдельных стадий адсорбционного процесса. При высоких скоростях потока (-$т ? ki ) вклад диффузионной составляющей во время образования необратимого и обратимого слоев невелик и ход процесса определяется, в основном, кинетическими константами (система находится в кинетической области). Однако, при медленном течении раствора или крови (например, в венах) диффузия начинает вносить значительный вклад в кинетику адсорбции и может, даже, стать лимитирующей стадией в процессе накопления прочно и обратимо адсорбированного белка, что, как мы отмечали, было показано экспериментально / 31, 96_7. Лимитирование диффузией кинетики обратимой и необратимой адсорбции приводит к значительному изменению вида функции г» () от времени (рис.4.9 ), что, в свою очередь, сказывается на тромборезистент-ных свойствах поверхности. Таким образом, существует принципиальное отличие в использовавши полимерных имплантатов в различных участках сосудистого русла. В целях придания синтезируемым гидрофобным полимерам улучшенных тромборезистентных свойств применяются такие методы как сополимеризация / 2, 108 J, изменение технологии изготовления /"108.7, различного рода модификации синтетических изделий /"63J, В этой связи, определенный интерес представляет изучение влияния состава и способа получения высокомолекулярного соединения на кинетику отдельных стадий адсорбционного процесса.
