Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ НАБОРОВ ДИФРАКЦИОННЫХ ДАННЫХ В БЕЛКОВОЙ КРИСТАЛЛОГРАФИИ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
1.1. Характерные особенности белковых кристаллов 7
1.2. Объем и характер экспериментальных данных в белковой кристаллографии ... 9
1.3. Современные методы съемки обратного пространства 17
1.4. Формирование таблицы структурных амплитуд. Проблемы шкалирования .... 24
1.5. Характеристики качества наборов экспериментальных данных 32
1.6. Постановка задачи оптимизации 42
ГЛАВА II. ОПТИМАЛЬНАЯ СТРАТЕГИЯ СЪЕМКИ ОБРАТНОГО ПРОСТРАНСТВА
2.1. Принципы и количественные критерии оптимальной съемки 46
2.2. Оптимизация съемки обратного пространства в методе экранной прецессии 50
2.3. Оптимизация съемки обратного пространства в методе вращения 62
2.4. Оценка эффективности оптимизации съемки обратного пространства 71
2.5. Планирование эксперимента и сбор оптимизированных наборов данных от кристаллов -кристаллинов фракций и лейцинаминопептидазы 80
ГЛАВА III. ВЫЧИСЛЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ПРИВВДЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ АМПЛИТУД ПРОИЗВОДНЫХ К ЖАЛЕ НАТИВНОГО БЕЛКА НА БАЗЕ СТАТИСТИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ. УЛУЧШЕНИЕ ОЦЕНОК КАЧЕСТВА ПРОИЗВОДНЫХ
3.1. Корректное определение коэффициента приведения данных от производных к шкале нативного белка. Критерий изоморфизма 89
3.2. Формула для вычисления коэффициента приведения .90
3.3. Статистический критерий отбора шкалируемых отражений 93
3.4. Оценка точности вычислений. Формирование набора экспериментальных данных-кристаллина Шьпри разрешении .96
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 110
ЛИТЕРАТУРА 112
- Объем и характер экспериментальных данных в белковой кристаллографии
- Принципы и количественные критерии оптимальной съемки
- Корректное определение коэффициента приведения данных от производных к шкале нативного белка. Критерий изоморфизма
Объем и характер экспериментальных данных в белковой кристаллографии
В результате этого угловой интервал отраженного луча значительно расширяется и может достигать величины приблизительно в 1. Геометрически уширение дифрагированного луча означает, что узел обратной решетки приобретает конечные размеры и может быть полностью зафиксирован только при вращении кристалла на определенный угол. Узлы, которые не пересекли поверхность сферы полностью, дадут так называемые частичные отражения /39,40/.
Интенсивность узла обратной решетки существует на фоне неупорядоченного отражения, даваемого кристаллом. Поэтому истинное значение энергии дифракционного максимума, измеряемого в соответствии с формулой (1.3), может быть получено как разность интенсивностеи излучения в узле и пространстве между узлами, что соответствующим образом увеличивает объем измерений /1,41/.
Следовательно, для расчетов по формуле (I.I) необходимо измерить интенсивность отраженного кристаллом рентгеновского излучения в узлах и части пространства между узлами обратной решетки, которые попадают в асимметричную область обратного пространства, имеющую вид шарового сектора с границами, определяемыми симметрией дифракционной картины и заданным разрешением. Кристаллу должно быть придано вращательное или иное движение (кроме поступательного), обеспечивающее прохождение узлов конечного размера сквозь поверхность сферы отражения /31,41/.
Значение фазы oCfd/f J структурного фактора в белковой кристаллографии определяется методом многократного изоморфного замещения /1,5-11/, который часто усиливается использованием аномального рассеяния /9,10,44/.
Принципы и количественные критерии оптимальной съемки
Низкая радиационная стабильность кристаллов белков и их слабая отражающая способность предъявляют противоречивые требования к технике дифракционного эксперимента, что обуславливает необходимость тщательного подхода к стратегии съемки обратного пространства. Вне зависимости от используемого метода сбора данных эта стратегия должна обеспечивать получение набора структурных амплитуд удовлетворительного качества за минимальное время экспозиции.
Наиболее широкие возможности в выборе путей съемки предоставляет исследователю нульмерная схема, так как при ее использовании каждый дифракционный максимум измеряется независимо от других, и условия оптимальной съемки сводятся в основном к сокращению времени измерения интенсивности этого максимума /I/. Для двух- и трехмерных схем порядок, в котором производится съемка, играет существенную роль, однако выбор оптимального пути наталкивается на значительные трудности. Это вызвано сложными зависимостями между симметрией кристалла и геометрией используемых методов. Вследствие этого, при получении набора структурных амплитуд требуемой полноты, приходится прибегать к многократной регистрации отдельных групп отражений.
Как было показано ранее (табл. 3), увеличения точности измерений при этом не происходит, поэтому оптимальная стратегия съемки должна сводить число многократно измеряемых отражений к разумному минимуму. Число симметрично связанных отражений на кадре можно уменьшить, выбрав соответствующим образом начальную установку кристалла относительно первичного пучка и оси гониометрической головки. Очевидно, что лучшей начальной установкой будет установка, обеспечивающая максимальную заселенность кадра независимыми отражениями, находящимися в заданной области разрешения. В методе экранной прецессии это условие выполняется при установке оси высшей фриделевскои симметрии вдоль оси гониометрической головки /60,116/. Такая же установка является оптимальной для кристаллов большинства сингоний в методе вращения /103/. Исключение составляют кристаллы кубической сингоний. Например, для кристаллов группы Лауэ /77 3 минимальный размер независимой области обеспечивается при установке направления /101/ вдоль оси вращения камеры /115/.
Ранее было показано, что число структурных амплитуд, достаточное для построения карт электронной плотности, можно получить только с относительно большого количества кадров, которые мы в дальнейшем будем называть кадрами набора данных. Ввиду того, что каждый кадр характеризуется своими значениями отражающего объема:кристалла, условиями поглощения, обработки и так далее, данные, полученные с разных кадров, необходимо привести к общей шкале. Процедура вычисления шкальных факторов основана на использовании отражений с одинаковыми индексами или же симметрично связанных отражений, которые регистрируются более чем на одном кадре. Следовательно, набор данных должен обладать некоторой избыточностью, и средняя кратность / измерения одного отражения для него должна быть больше единицы, а число общих отражений на кадре А// больше некоторого числа /V0C , зависящего от точности измерений.
Корректное определение коэффициента приведения данных от производных к шкале нативного белка. Критерий изоморфизма
Как отмечалось ранее, при использовании метода изоморфного замещения для определения структуры белка экспериментальные данные сводятся в таблицу, строки которой упорядочены по индексам Миллера А, к & , а колонки содержат данные, относящиеся к нативному белку и ряду его тяжелоатомных производных. Пример такой таблицы дан в работе /101/. Метод требует, чтобы данные всех колонок были приведены к одной шкале, в качестве которой обычно выбирается шкала нативного белка. В соответствии с уравнением (І.б) структурный фактор тяжелого атома можно определить как
Эта формула справедлива, если Fp»c и Fpc измерены в одной шкале. Практически же в результате измерений мы имеем величины Fc- и fpi » гДе индексы /У и 2 относятся соответственно к нативному и модифицированному кристаллам. Отсюда, пользуясь шкалой нативного белка, можно переписать формулу.
