Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Ренггеноструктурный анализ является самым мощным из физических методов, применяемых в настоящее время для изучения пространственных структур биологических макромолекул. Точное знание пространственной структуры необходимо для понимания механизма действия ферментов и направленного изменения их свойств методами генной инженерии. Несмотря на крупные достижения белковой кристаллографии в последние годы, получение совершенных и достаточно крупных монокристаллов белков по-прежнему остается лимитирующей стадией ренггеноструктурного анализа и во многом определяет его успех.
Карбоксипептидазы - это аминопептидазы, гидролизующие аминокислоты с С-концов полипептидных цепей. Вместе с другими пептидазами они играют исключительно важнуюроль в обмене веществ всех живых организмов - от бактерий и низших грибов до высших животных и человека. В настоящее время известны пространственные структуры карбоксипептидаз А и В, выделенных из млекопитающих. Однако, ряд важнейших вопросов, связанных с механизмом их действия, до сих пор остается нерешенным. Карбо-ксипептидаза Thermoactinomyc&s обладает смешанной по сравнению с карбоксипептидаэаин Д и В специфичностью. Детальное изучение строения активного центра этого фермента позволит выявить наиболее существенные особенности, ответственные за изменение специфичности,и понять механизм его действия.
Неорганические пирофосфатазы участвуют в процессах-, сопровождающих перенос энергии фосфатными группами. До сих пор неорганическая пирофосфатаза дрожжей остается единственным представителем этого класса, для которого установлена пространственная структура. Расширение спектра исследуемых пирофосфатаз, их всесторонняя характеристика, а также определение пространственной структуры позволит выяснить эволюционные отношения среди пирофосфатаз, выделить особенности строения, наиболее существенные для выполняемой функции.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ — физико-химическое и кристаллографическое исследование двух белков, выделенных из термофильных микроорганизмов - карбоксипептидазы Thermoactinomyces и пирофосфатазы Thermus thermophilics .
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Б результате проведенного исследования получены кристаллы карбоксипептидазы Thermoactinomyces , методами изоморфного и молекулярного замещения определена структура этого фермента при разрешении 3 А, и получено прямое экспериментальное доказательство сходства пространственных структур карбоксипептидаз бактерий и животных. Разработана методика выделения нового представителя семейства пирофос-фатаз - пирофосфатаэы из экстремально'термофильной бактерии Thermus thermophilic, определены важнейшие физико-химические характеристики этого фермента. Установлено, что пирофосфагаза Thermus thermophilus является металлоактивируемым ферментом, проявляет максимальную активность в присутствии ионов магния и по гермостабильности превосходит все известные пирофосфатаэы из других источников. Получены кристаллы пирофосфатаэы, пригодные для рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в настоящей работе результаты являются основой для определения пространственной структуры карбоксипептидазы Thermoactinomyces и пирофосфатаэы Thermus thermophilus с высоким разрешением. Знание пространственной структуры карбоксипептидазы позволит выработать рекомендации для создания фермента с измененными свойствами с целью дальнейшего его использования при получении инсулина . изучение свойств пирофосфатаэы, выделенной из экстремально термофильной бактерии, определение ее пространственной структуры позволит понять механизм каталитической активности и объяснить высокую термостабильность этого фермента.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы докладывались на 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура биологических макромолекул" (Звенигород, 1987), на конкурсе научных работ в Икс-_ гитуте кристаллографии АН СССР (1987).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.
ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Она изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц.
