Содержание к диссертации
Введение
1 Рост и морфология кристаллов лизоцима 11
1.1 Структура и рост тетрагональных кристаллов лизоцима 11
1.2 Методика роста дейтерированных кристаллов лизоцима 17
1.3 Оптимизация условий роста дейтерированных тетрагональных кристаллов лизоцима 19
1.4 Морфология дейтерированных тетрагональных кристаллов лизоцима..21
2 Фазовый переход в кристаллах лизоцима 29
2.1 О возможности существования фазового перехода в кристаллах лизоцима 29
2.2 Акустические свойства тетрагональных кристаллов лизоцима 32
2.3 Мандельштам-бриллюэновское рассеяние света в кристаллах 33
2.4 Описание экспериментальной установки по МБР света и деталей эксперимента 36
2.5 МБР света в тетрагональном кристалле лизоцима 42
2.6 Аномалии температурных зависимостей скорости и интегральной интенсивности акустических фононов 45
3 Изучение низкочастотной динамики лизоцима при денатурации с помощью МБР света 50
3.1 Денатурация лизоцима при повышении температуры и при воздействии хаотропными агентами 50
3.2 МБР света в жидкостях 57
3.3 Детали эксперимента 33
3.4 Эволюция спектров МБР в растворе лизоцима при тепловой денатурации 61
3.5 Эволюция спектров МБР при денатурации лизоцима 6М гуанидингидрохлоридом 69
4 Малоугловое рассеяние нейтронов в лизоциме при тепловой денатурации
4.1 Малоуглового рассеяния нейтронов в белковых растворах 75
4.2 Фрактальность белков 81
4.3 Малоугловое рассеяния нейтронов, основные теоретические представления... 90
4.4 Методика измерений и обработка экспериментальных результатов 93
4.5 Результаты и обсуждения 98
4.5.1 Температурное поведение фрактальной размерности 98
4.5.2 Вычисление и анализ функции распределения по расстояниям... 101
4.5.3 Температурное поведение радиуса инерции лизоцима 105
5 Нсупругое рассеяние нейтронов в лизоциме 108
5.1 Особенности колебательного спектра белков 108
5.2 Методика измерений 115
5.3 Функция плотности колебательных состояний лизоцима и ее температурная эволюция 118
5.4 Влияние изотопического эффекта на динамику лизоцима 124
Заключение
- Методика роста дейтерированных кристаллов лизоцима
- Мандельштам-бриллюэновское рассеяние света в кристаллах
- Эволюция спектров МБР в растворе лизоцима при тепловой денатурации
- Методика измерений и обработка экспериментальных результатов
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение фазовых переходов является основным направлением исследований в физике твердого тела на протяжении последних нескольких десятилетий. Успехи развития физики конденсированных сред привели к возможности изучения более сложных, разупорядоченных, самоорганизующихся систем, таких как биополимеры. В последнее время все большее внимание уделяется изучению фазовых превращений ДНК, белков, и других биополимеров, которые могут приводить к изменению их активности и функции. При этом продуктивным оказывается применение широкого арсенала современных методов исследований твердых тел и кристаллов к изучению биологических объектов.
Настоящая работа посвящена исследованию поведения структуры и динамики белков при фазовых переходах и фазовых превращениях. Известно, что динамика биополимеров в диапазоне частот от 1 до 1000 ГГц обычно отражает локальные конформационные изменения, т.е. прыжки атомов от одной конфигурации к другой, и коллективные возбуждения. Динамика биополимеров в этом диапазоне частот имеет много общего с динамикой стекол, переохлажденных жидкостей и других конденсированных сред. Например, в колебательном спектре белков обнаружены бозонный пик, быстрые ангармонические движения, подобные быстрой пикосекундной релаксации в стеклах и др. Более того, делаются попытки определить температуру динамического (или стекольного) фазового перехода Tg в ряде биополимеров в низкотемпературной области [1]. Другим примером фазовых превращений является переход ДНК из А в В форму при гидратации. При этом фазовом превращении принципиальными оказались исследования низкочастотной динамики ДНК - в экспериментах по неупругому рассеянию света была обнаружена мягкая оптическая мода [2]. Это показывает, что при анализе фазовых превращений биополимеров может быть успешно
использована концепция мягкой моды, которая была предложена Кохреном и Андерсоном для описания фазовых переходов второго рода, а затем успешно применялась при исследовании структурных фазовых переходов в кристаллах. Характерным примером фазового превращения белков является денатурация - изменение нативнои пространственной структуры молекулы белка под воздействием различных факторов, например, при повышении/понижении температуры, воздействии органическими растворителями, детергентами и др. Необходимо отметить, что исследования низкочастотной области колебательного спектра белков при этом фазовом превращении практически не проводились.
В последнее время для описания структуры белковой молекулы широкое распространение получил фрактальный подход [3]. Использование этого подхода позволяет корректно оценить изменение пространственной организации белка при денатурации [4]. Из работ Александера и Орбаха следует, что на фрактальных структурах реализуется низкочастотное возбуждение - фрактон [5]. Это возбуждение хорошо изучено экспериментально и теоретически для аэрогелей и ряда других соединений. Вопрос о существовании фрактона в колебательном спектре белков обсуждался только теоретически [6]. В настоящей работе впервые проведены экспериментальные исследования, которые позволили идентифицировать фрактон в колебательном спектре белков.
Таким образом, исследования фазовых превращений биополимеров, направленные на воссоздание полной картины наблюдаемых явлений в колебательном спектре и развитие новых теоретических подходов на базе существующих концепций, являются актуальными.
Целью диссертационной работы было исследование фазовых превращений лизоцима, который является модельным объектом при изучении глобулярных белков, с помощью неупругого рассеяния нейтронов (НРН), малоуглового рассеяния нейтронов (МРН) и мандельштам-
бриллюэновского рассеяния (МБР) света. В качестве объектов исследований использовались монокристаллы, порошки и растворы лизоцима.
Для изучения физических свойств кристаллов лизоцима были получены кристаллы максимального размера с заданной симметрией. Хрупкость, малый размер и особенности существования (в растворе или в парах) белковых кристаллов затрудняли проведение систематического рентгеноструктурного анализа образцов, поэтому необходимо было использовать морфологический подход к описанию структуры кристаллов. Отметим, что в ряде работ по рентгеноструктурным исследованиям кристаллов лизоцима и изучению их оптической активности при повышении температуры указывалось на возможность существования фазового перехода, однако имеющиеся данные по этому поводу были весьма противоречивы. Для решения этих проблем предполагалось исследование динамики решетки тетрагональных кристаллов лизоцима в области температур предполагаемого фазового перехода с помощью МБР.
Исследование денатурации лизоцима проводилось двумя методами: МБР света, что позволяет изучать низкочастотную динамику белка, и МРН -метод, который дает прямую информацию о пространственной организации белка. Предположение ряда теоретических работ о существовании собственного локализованного возбуждения - фрактона в колебательном спектре белков инициировало использование неупругого рассеяния нейтронов для исследования низкочастотной области колебательного спектра лизоцима. Анализ данных по МРН и НРН в рамках фрактального подхода позволяет определить фрактальную размерность лизоцима (и ее изменение при денатурации) и фрактонную размерность.
Основные положения, выносимые на защиту и их новизна Определены оптимальные условия роста тетрагональных кристаллов лизоцима наибольших размеров из растворов, приготовленных на тяжелой воде. С помощью морфологического анализа показано, что
три различные формы кристаллов лизоцима, обнаруженные при росте, являются тетрагональным. Эти результаты подтверждены рентгеноструктурным анализом.
В тетрагональных кристаллах лизоцима в окрестности 307 К обнаружен структурный фазовый переход.
В результате экспериментов по малоугловому рассеянию нейтронов определена фрактальная размерность лизоцима. Показано, что тепловая денатурация лизоцима приводит к уменьшению фрактальной размерности от 2.77 до 2.50.
В низкочастотной области колебательного спектра лизоцима выделено локализованное возбуждение - фрактон и определена его спектральная размерность.
Обнаружено влияние изотопического обмена водорода на дейтерий на обобщенную функцию плотности колебательных состояний лизоцима. Изотопический эффект наиболее выражен в диапазоне частот от 420 до 800 см"1.
При тепловой денатурации лизоцима наблюдались аномалии в скорости и затухании гиперзвука, а также в поведении интегральной интенсивности компонент Мандельштама - Бриллюэна, которые отражают всю последовательность фазовых превращений. Это позволяет использовать МБР света как эффективный метод при исследовании динамики биополимеров.
Представленные в работе результаты и выводы являются оригинальными. В работе впервые:
Оптимизировались условия роста дейтерированных тетрагональных кристаллов лизоцима, и проводился их морфологический анализ.
Исследовалось температурное поведение акустических гиперзвуковых фононов в тетрагональных кристаллах лизоцима с помощью МБР света.
Исследовалось изменение пространственной организации лизоцима при тепловой денатурации с помощью МРН. При этом использовался фрактальный подход к описанию пространственной организации белка, а именно, определялась фрактальная размерность и ее поведение при тепловой денатурации лизоцима.
Проводился детальный анализ низкочастотной области функции плотности колебательных состояний лизоцима в рамках фрактального подхода, что позволило определить фрактонную размерность. Исследовалось влияние изотопического замещения водорода на дейтерий на функцию плотности состояний лизоцима.
Изучалась температурная эволюция спектров МБР в растворе лизоцима при тепловой денатурации и денатурации 6М гуанидингидрохлоридом.
Научно-практическая значимость работы. Исследования, проведенные в представленной работе, расширяют и, в заметной степени, меняют существующие представления о низкочастотной динамике белков. Впервые наблюдался структурный фазовый переход в тетрагональном кристалле лизоцима в окрестности 307 К. Впервые исследовались фазовые превращения лизоцима при денатурации с помощью МБР света, которые показали эффективность использования этого метода при изучении динамики биополимеров. Показано, что структура лизоцима адекватно описывается в рамках фрактального подхода. Анализ результатов экспериментов по МРН в растворах лизоцима позволил предложить фрактальную размерность как количественный параметр для характеристики изменений пространственной организации белков при денатурации. В низкочастотной области колебательного спектра лизоцима идентифицирован фрактон и определена его спектральная размерность. Полученные результаты являются важными для понимания механизмов функционирования белков.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на XIV Международной конференции по росту кристаллов (Гренобль, Франция,
2004), Конкурсе молодых ученых ФТИ им. А.Ф. Иоффе РАН (Санкт-Петербург 2004, 2006), Международной зимней школе по физике полупроводников (С.-Петербург-Зеленогорск, 2005), XVII Всероссийской конференции по физике сегнетоэлектриков (Пенза, Россия, 2005), 3-ей Европейской школе по рассеянию нейтронов (Будапешт, Венгрия, 2005), IV Совещании "Исследования на импульсном реакторе ИБР-2" (Дубна, Россия, 2006), JCBSF-8 - Япония-СНГ/Балтия (Тсукуба, Япония, 2006), 20-ой Международной конференции по рамановской спектроскопии ICORS'06 (Иокогама, Япония, 2006), Международном семинаре "Динамика молекул и материалов" (Гренобль, Франция, 2007), на научных семинарах отдела физики сегнетоэлектричества и магнетизма ФТИ им. А.Ф. Иоффе.
Публикации. По результатам работы опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографии; содержит 56 рисунков, 1 таблицу. Полный объем диссертации 145 страниц. Список цитируемой литературы содержит 113 наименований.
Первая глава посвящена исследованиям по оптимизации условий роста крупных дейтерированных тетрагональных кристаллов лизоцима и их морфологическим особенностям. Условия роста крупных кристаллов лизоцима выбирались путем варьирования концентрации хлорида натрия в растворе. В ходе экспериментов при одних и тех же начальных условиях наблюдалось появление кристаллов с 3-я различными габитусами. Был проведен морфологический и рентгеноструктурный анализ выращенных дейтерированных и протонированных кристаллов.
Вторая глава описывает результаты экспериментальных исследований поведения гиперзвуковых акустических фононов в тетрагональных кристаллах лизоцима с габитусом «пластинки» при повышении температуры от 298 К до 330 К с помощью МБР света. В окрестности 307 К были обнаружены аномалии в температурной зависимости скорости и
восприимчивости быстрого поперечного фонона, а также восприимчивости продольного фонона, что свидетельствует о существовании структурного фазового перехода в тетрагональном кристаллах лизоцима.
Третья глава посвящена исследованию того, как влияет изменение пространственной организации белковой молекулы на низкочастотную область колебательного спектра белка. Для этого определялось температурное поведение гиперзвука в растворе лизоцима при тепловой денатурации и при денатурации гуанидингидрохлоридом. Выбор таких денатурирующих факторов обусловлен тем, что они по-разному изменяют конформацию белка. Были обнаружены аномалии в поведении гиперзвука в растворе лизоцима, которые могут быть соотнесены с фазовыми превращениями.
Четвертая глава посвящена изучению изменений структуры лизоцима при тепловой денатурации с помощью МРН. При этом для описания структуры белка применялся фрактальный подход. Наблюдалось уменьшение фрактальной размерности лизоцима при тепловой денатурации, что свидетельствует о разупорядочении изначально компактной нативной белковой молекулы. Также анализировалось температурное изменение функции распределения по расстояниям и температурное изменение величины радиуса инерции лизоцима.
Пятая глава посвящена исследованию низкочастотной области колебательного спектра лизоцима с помощью НРН. При анализе обобщенной функции плотности состояний лизоцима, полученной по результатам экспериментов, было выделено возбуждение - фрактон, и определена фрактонная размерность. Изучение и сравнение обобщенной функции плотности колебательных состояний дейтерированного и протонированного лизоцима позволило выявить роль водородных связей в динамике лизоцима.
В заключении сформулированы основные результаты диссертации.
Методика роста дейтерированных кристаллов лизоцима
Дейтерированные кристаллы лизоцима (Fluka, США) выращивали методом диффузии паров в «висячей» капле [16] при температуре 18С. Маточный раствор для кристаллизации был приготовлен на тяжелой воде (D20) и содержал 20 мг/мл белка, 0.1 М натрия уксуснокислого (Экрос, Россия), 0.01 М натрия азида (Fluka, США), рН=4.6. В качестве осадителя использовали натрия хлористый (Экрос, Россия), концентрация которого варьировалась от 2 до 4%. Осаждающий противораствор, также приготовленный на тяжелой воде, содержал 0.1 М натрия уксуснокислого, 0.01 М натрия азида, рН=4.6, а концентрация натрия хлорида соответственно превышала его концентрацию в маточном растворе в 2 раза.
Аналогично выращивали кристаллы лизоцима из растворов, приготовленных на обычной воде, при условиях: температура 10С; маточный раствор содержал 20 мг/мл белка, 0.1 М натрия уксуснокислого, 0.01 М натрия азида, рН=4.6, концентрация натрия хлористого варьировалась от 0.5 до 3.5%. Осаждающий противораствор содержал 0.1 М натрия уксуснокислого, 0.01 М натрия азида, рН=4.6, а концентрация натрия хлорида соответственно превышала его концентрацию в маточном растворе в 2 раза. Упомянутые условия кристаллизации были выбраны при анализе литературных данных. Предполагается, что данные условия оптимальны для роста кристаллов лизоцима.
Проводился морфологический анализ как дейтерированных, так и протонированных кристаллов лизоцима. Углы между гранями кристалла и размеры кристаллов определяли с помощью поляризационного микроскопа МП-3. Здесь и далее мы будем называть протонированными кристаллы лизоцима, выращенные на основе обычной воды, а дейтерированными - на основе тяжелой воды.
Структура кристаллов определялась с помощью рентгеноструктурного анализа в Институте кристаллографии РАН им. А.В. Шубникова на установке MAR 345 на длине волны =1.5417 А. Протонированные и дейтерированные кристаллы лизоцима относятся к пр. гр. P432i2 и имеют параметры элементарной ячейки а=Ь=79.535, с=38.118 и а=Ь=79.551, с=38.017 А соответственно. Степень дейтерирования кристаллов лизоцима, выращенных из растворов, приготовленных на тяжелой воде, не определялась.
Получение и изучение дейтерированного аналога кристаллов лизоцима предполагает исследование влияния различных факторов на рост кристаллов лизоцима из растворов, приготовленных на тяжелой воде (D2O). Мы предполагали, что изотопический обмен водорода на дейтерий не приведет к существенным изменениям условий роста, кроме некоторого снижения растворимости лизоцима [29]. Поэтому при выборе оптимальных условий выращивания дейтерированных кристаллов можно использовать литературные данные, относящиеся к росту протонированных кристаллов лизоцима.
При росте дейтерированных кристаллов лизоцима варьировался только один параметр: содержание осадителя в маточном растворе, в качестве которого использовали натрия хлорид. Остальные условия роста мы не изменяли, считая их оптимальными для роста тетрагональных кристаллов лизоцима. Таким образом, были получены зависимости размера дейтерированных кристаллов от концентрации осадителя (рис. 1.6 а). Аналогичная процедура использовалась для определения зависимости размеров выросших кристаллов от концентрации осадителя протонированных кристаллов (рис. 1.6 б). Из рис. 1.6 б хорошо видно, что при выращивании как дейтерированных, так и протонированных кристаллов лизоцима, характер зависимостей размеров кристаллов от содержания осадителя в растворе подобен, и имеет максимум. При низкой концентрации осадителя наблюдается появление мелких кристаллов лизоцима, вследствие малого пересыщения раствора. Повышение концентрации осадителя приводит к появлению достаточно крупных кристаллов лизоцима хорошего качества. Их размеры достигают максимума при концентрации натрия хлорида 3% (рис. 1.6)
Мандельштам-бриллюэновское рассеяние света в кристаллах
Фазовые переходы в кристаллах обычно сопровождаются предпереходными явлениями - аномалиями различных физических свойств. При этом может наблюдаться необычная (аномальная) температурная зависимость таких характеристик кристалла, как теплоемкость, диэлектрическая проницаемость и других, в том числе и упругих постоянных [34]. Поэтому интересно рассмотреть акустические свойства тетрагональных кристаллов лизоцима, которые получены при исследованиях с помощью ультразвуковых методов и МБР света.
С помощью МБР света были определены скорости распространения продольных упругих волн в тетрагональном кристалле лизоцима при комнатной температуре, а также значения упругих модулей [35]. Скорости распространения звука в кристалле в плоскости (ПО) в направлениях [001] и [110] равны 2.12±0.03 км/с и 2.31±0.08 км/с, соответственно. Кристаллы лизоцима в тетрагональной фазе можно охарактеризовать шестью независимыми упругими константами: Си, Си, С]з=Сгз, Сзз, С44-С55, Сев-Согласно соотношениям Кристоффеля для тетрагональных кристаллов скорости продольных волн в данных направлениях и упругие модулями связаны следующим образом: U[U0]L = V(CH + С12 + 2С66 )/2Р 5 У[001]1 = VC33 ІР (2.2) где р - плотность. Упругие модули тетрагонального кристалла лизоцима имеют следующие значения С7/=5.49±0.03 ГПа, Сп+С12+2Сбб =12.81±0.08 ГПа, Cji=5.48±0.05 ГПа, С44+ х/г C;j=2.99±0.05 ГПа. Необходимо отметить, что значения скоростей распространения упругих волн, полученные с помощью ультразвуковых методов в диапазоне частот от 1-25 МГц, меньше приведенных выше значений [36]. То же справедливо и для значений упругих модулей.
На рис. 2.2 показана температурная зависимость относительного значения скорости ультразвука в кристалле лизоцима в направлении [ПО] [36]. Хорошо видно, что при повышении температуры скорость ультразвука уменьшается линейно, что соответствует классическим представлениям о температурном поведении скорости звука в кристаллах. Однако, ультразвуковые исследования в данном случае проводились в диапазоне температур от 20С до 5С, что не соответствует температурам, при которых ожидается фазовый переход.
Данная глава посвящена исследованию упругих свойств тетрагональных кристаллов лизоцима в интересующем нас диапазоне температур - от 298 К до 330 К, в котором предположительно мог реализоваться фазовый переход. Наиболее информативным и удобным для этого методом является МБР света. Это убедительно показано при исследовании перестройки ДНК из А-формы в В-форму [2], фазовых превращениях в полидисахаридах [37] или при индуцированном обезвоживанием фазовом переходе в кристаллах лизоцима [35].
Проходящий через кристалл пучок света взаимодействует с имеющимися в кристалле элементарными возбуждениями. В случае МБР в процессе рассеяния участвуют тепловые фононы акустических ветвей, поэтому МБР может служить методом исследования акустических мод в твердом теле. Такого рода рассеяние было предсказано Мандельштамом [38] и Бриллюэном [39] и впервые экспериментально наблюдалось Гроссом [40].
С точки зрения квантовой теории рассеяние света можно рассматривать как неупругое столкновение фотонов с фононами, при котором происходит либо уничтожение фотона (рассеяние с понижением частоты или стоксово рассеяние), либо уничтожение фонона и рождение фотона (рассеяние с повышением частоты или антистоксово рассеяние) [41, 42]. При этом законы сохранения энергии и импульса имеют вид: где Q и q - частота и волновой вектор акустического фонона, а со ,к и сох кх - частоты и волновые вектора падающего и рассеянного фотонов соответственно. Поскольку частота упругой волны О. « со много меньше частоты световой волны со , то из (2.3) следует условие брэгговского рассеяния где в - угол между направлениями падающего и рассеянного света. Для видимого света Ак « 105сл , что, как видно из (2.4), по порядку величины соответствует наибольшему значению q, которое можно исследовать в процессе рассеяния первого порядка. В твердых телах граница первой зоны Бриллюэна определяется kw «108см х , следовательно, qm!LX « к . Поэтому дисперсионное соотношение для МБР линейно: Cl = q и , где и -скорость акустической волны в кристалле. Учитывая, что к = соп/с , где с -скорость света в вакууме, п - показатель преломления кристалла, соотношение (2.4) можно записать в виде
Таким образом, в спектре рассеянного света на акустических фононах кроме несмещенной линии, возникающей из-за рассеяния на статических неоднородностях, появляются два сателлита, относительное смещение частоты которых равно: где v = a line - спектроскопическая частота световой волны, выраженная в см"1, Л v - смещение компонент МБ относительно частоты возбуждающей линии. Задавая частоту света v и угол рассеяния в, зная п и определив из эксперимента сдвиг частоты компонент МБР Av , можно определить скорость акустических фононов в кристалле
Распространение акустических волн в кристаллах сопровождается затуханием. Мерой затухания является амплитудный коэффициент затуханиия а , который показывает, как уменьшается амплитуда волны на длине 1 см пути А = А0 ехр (- ах)
Эволюция спектров МБР в растворе лизоцима при тепловой денатурации
На рис. 3.5 а показан спектр МБР света в растворе лизоцима измеренный при 342 К. Пик с максимумом на несмещенной частоте является релеевским пиком, а менее интенсивные по сторонам от него - компоненты МБ. Кроме того, по обе стороны от несмещенной линии видны дополнительные вклады - квазиупругое рассеяние, определяемое релаксационными процессами. На рис. 3.5 а приведен пример обработки полученных экспериментальных спектров. Спектры рассеяния описывались суммой гауссиана, соответствующего релеевскому рассеянию и трех лоренцианов, два из которых соответствовали бриллюэновским компонентам и один -квазиупругому рассеянию. В данной работе (глава 2) выше подробно рассматривалось, как можно вычислить величину скорости и затухания упругих волн по спектрам МБР света.
По результатам обработки спектров были построены температурные зависимости сдвига, полуширины на полувысоте и интенсивности компонент Мандельштам-Бриллюэна в двух растворах: і) в растворе лизоцима в натрий ацетатном буфере и іі) в натрий ацетатном буфере. Анализ результатов проводился следующим образом: для каждого из растворов были построены температурные зависимости относительных величин смещения, полуширины и интенсивности компонент МБ. Данные нормировались к значениям соответствующих величин, полученных во время эксперимента при Т=300 К, так как можно считать, что при данной температуре растворы находятся в состоянии равновесия. В результате -вклад именно динамики лизоцима достаточно наглядно представлен на рис. 3.6, рис. 3.7 и рис. 3.8.
На рис. 3.6 показана температурная зависимость относительной величины сдвига при нагревании і) раствора лизоцима в натрий ацетатном буфере и іі) натрий ацетатного буфера. Пренебрегая температурной зависи мостью показателя преломления и плотности [67], мы можем говорить фактически о поведении скорости гиперзвука в натрий ацетатном буфере и в растворе белка (см. выражение (2.7)) при изменении температуры (далее мы будем обсуждать именно поведение скорости гиперзвука Av ). Хорошо видно (рис. 3.6, кривая 1), что при рассеянии в натрий ацетатном буфере прослеживается монотонное увеличение Аи при повышении температуры до 344 К, а затем незначительное его уменьшение при дальнейшем нагревании буфера до 360 К. Температурная зависимость скорости гиперзвука в натрий ацетатном буфере соответствует представлениям о поведении упругих волн в вязкой среде при изменении температуры [68].
Рассмотрим теперь температурные зависимости относительного изменения скорости гиперзвука в растворе лизоцима (рис. 3.6, кривая 2). В температурной зависимости относительной величины Ао в растворе лизоцима можно условно выделить 3 участка. Первый из них находится в области температур, близких к комнатной: 294-305 К. При этих температурах, как видно на рис. 3.6, поведение скорости в растворе белка такое же, как и в буфере. Нагревание раствора лизоцима приводит к тому, что скорость гиперзвука монотонно увеличивается с увеличением температуры до 333 К. Таким образом, второй участок кривой 2 на рис. 3.6 можно ограничить температурным диапазоном 305-333 К. Дальнейшее нагревание раствора лизоцима приводит к нетривиальному поведению скорости гиперзвука: в окрестности 333 К наблюдается «скачек вниз», затем отсутствие зависимости скорости от температуры в диапазоне 333-336 К и снова «скачек» скорости, но уже вверх при 336 К. Вторая аномалия локализована в температурном диапазоне 336-350 К и имеет характерный минимум при 342 К.
Перейдем к рассмотрению температурной зависимости величины относительной полуширины бриллюэновских компонент полученных при рассеянии МБР в растворе лизоцима в натрий ацетатном буфере (рис. 3.7, кривая 2) и в натрий ацетатном буфере (рис. 3.7, кривая 1). Хорошо видно, что при повышении температуры до Т 342 К в обоих растворах затухание гиперзвука экспоненциально уменьшается. Выше Т 342 К поведение затухания гиперзвука в буфере и в растворе белка различаются: затухание гиперзвука в буфере продолжает экспоненциально уменьшаться, в то время как в растворе лизоцима затухание гиперзвука увеличивается. Отметим, что в окрестности Т 342 К наблюдается минимум скорости гиперзвука на второй аномалии (сравните рис. 3.6 и 3.7).
Сравнительный анализ температурной зависимости относительного изменения интенсивности рассеяния в растворе лизоцима в натрий ацетатном буфере и в натрий ацетатном буфере, также дает интересные результаты. На рис. 3.8 хорошо видно, что при нагревании натрий ацетатного буфера интенсивность рассеяния света в нем монотонно возрастает во всем рассматриваемом нами температурном интервале. Это соответствует представлениям о поведении интенсивности компонент МБ в маловязких жидкостях [68]. Интенсивность рассеяния света в растворе лизоцима также монотонно возрастает с ростом температуры до Т 340 К (рис. 3.8 кривая 2), подобно поведению интенсивности рассеяния в буфере. Начиная с температур выше Т 340 К упомянутые зависимости расходятся -существенно уменьшается интегральная интенсивность бриллюэновских компонент в растворе белка. Это связано со значительным увеличением поглощения света, из-за чего интенсивность рассеяния падает.
Таким образом, для белкового раствора аномальное поведение при 1=340 К наблюдается в температурных зависимостях сдвига частоты (рис. 3.6), полуширины (рис. 3.7) и интенсивности (рис. 3.8) бриллюэновских компонент.
Методика измерений и обработка экспериментальных результатов
В эксперименте проводилось измерение интенсивности нейтронов, зарегистрированных детектором, в зависимости от угла рассеяния 20 между направлениями волновых векторов падающих и рассеянных нейтронов
Схема спектрометра приведена на рис. 4.10 а. Полихроматический пучок нейтронов из холодного замедлителя монохроматизуется механическим селектором скоростей со спиральными щелями. В результате получается пучок нейтронов с длиной волны, определяемой скоростью вращения селектора, и разбросом ±10% от среднего значения. Для проведения экспериментов скорость селектора выбиралась нами равной 7000 об/с, что соответствовало длине волны нейтронов 3.38 А. Монохроматический пучок нейтронов коллимируется с помощью набора круговых диафрагм малого размера, разнесенных на большие расстояния. Это позволяет приблизиться к условиям плоской волны с точностью до отношения r/R, где г, R - диаметр отверстий диафрагм и расстояние между ними. Далее пучок нейтронов направляется на образец. Исследуемый образец располагается на расстоянии 15 м от селектора скоростей. Максимальный размер пучка на образце 16x16 мм . Рассеянные в образце нейтроны детектируются двумерным позиционно-чувствительным детектором, размером 64x64 см с разрешением 10x10 мм2. Расстояние от образца до детектора выбиралось равным 1,3 м и 5,6 м, что обеспечивало определение интенсивности рассеяния в диапазоне волновых векторов от 4,01x10 до 5.088x10" А 1.
Большая общая длина спектрометра объясняется не только тем, что нужно обеспечит регистрацию интенсивности рассеяния на очень малых углах, но и необходимостью высокого углового разрешения экспериментальной установки. Неопределенность значения волнового вектора в эксперименте определяется немонохроматичностыо падающего на образец излучения, расходимостью первичного пучка и неопределенностью в расчете угла рассеяния, связанную с конечными размерами образца и конечным пространственным разрешением детектора.
С помощью вышеописанной установки исследовалось малогловое рассеяние нейтронов в двух образцах: растворы лизоцима с концентрацией 50 мг/мл и 250 мг/мл в натрий ацетатном буфере (0.1 М, рН=4.6). Для того чтобы увеличить контраст при приготовлении белковых растворов использовали тяжелую воду. В раствор добавляли 20% раствор азида натрия в соотношении 1:1000 для предотвращения бактериального заражения.
На рис. 4.11 представлена зависимость интенсивности рассеяния в растворе лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, полученная в ходе экспериментов при 300 К. Аналогичные зависимости были получены при исследовании растворов с концентрациями белка 50 и 250 мг/мл при температурах: 300, 316, 328, 333.5, 334.5, 336.5, 337.5, 340.5, 342.5, 344.5 и 347.5 К. В ходе эксперимента перед началом регистрации спектра образец выдерживался в течении 10 минут при каждой температуре и время накопления сигнала составляло 10 минут.
Обработка полученных результатов подразумевает вычитание из полученной зависимости I(q) вкладов, связанных с особенностями экспериментальной установки и с рассеянием чистым растворителем. Исследуемая нами система является двухфазной: кроме рассеяния I(q) на частицах, экспериментальная кривая содержит рассеяние основной матрицей - растворителем, которое в большинстве случаев полагается аддитивным благодаря отсутствию интерференции между частицами и растворителем. Кроме того, первичный пучок рассеивается на деталях камеры (коллимирующие щели, держатель и т.п.), что также дает некоторую добавку к рассеянию. Для устранения этих нежелательных вкладов в регистрируемую интенсивность проводят измерения рассеяния чистым растворителем, в качестве которого, как уже упоминалось выше, использовался натрий ацетатный буфер hu/q), и вычитают его из рассеяния образцом, т.е. белковым раствором Ip.s.(q). При расчете интенсивности рассеяния лизоцимом Iiys(q) необходимо учитывать поправки на проходимость пучка в обоих случаях Tp,s, и Тьи/ соответственно, а также возможность попадания на детектор нейтронов в случае полного перекрывания пучка Icd(q)- В последнем случае для расчетов используют кривую рассеяния кадмиевой пластинки, установленной в держателе вместо исследуемого образца. Таким образом, при расчете кривой рассеяния лизоцимом использовалась следующее выражение:
