Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите [Электронный ресурс] Рябов Вадим Александрович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12-43

Глава 2. Материалы и методы исследования 44-52

Глава 3. Клиническая характеристика больных 53-66

Глава 4. Активность апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите 67-83

Глава 5. Изучение провоспалительных цитокинов, растворимой формы Fas-лиганда и апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите 84-97

Глава 6. Оценка влияния базисной терапии ревматоидного артрита на активность апоптоза периферических лимфоцитов 98-128

Заключение 129-140

Список литературы

• Клиническая характеристика больных
• Активность апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите
• Изучение провоспалительных цитокинов, растворимой формы Fas-лиганда и апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите
• Оценка влияния базисной терапии ревматоидного артрита на активность апоптоза периферических лимфоцитов

Клиническая характеристика больных

Для решения поставленных целей и задач обследовано ПО больных. В исследуемую группу включено 90 пациентов с достоверным РА, удовлетворяющим критериям ACR [88]. Группы сравнения составили 20 больных ОА с преимущественным поражением коленных суставов и 20 здоровых доноров.

В исследуемой группе преобладали женщины: 63 (70%) женщины, 27 (30%) мужчин. Возраст больных колебался от 20 до 74 лет и составил в сред нем 49,34± 11,63 года. Средняя длительность заболевания составила 14,26+13,31 месяцев, причем у 87 (96,67%) пациентов РА диагностирован впервые или в предшествующие исследованию 36 месяцев. I РА выявлен впервые у 25 (27,78%) больных, среди которых было 18 (72%) женщин и 7 (28%) мужчин с начальными симптомами болезни длительностью менее 6 месяцев. Общие демографические показатели по исследуемой группе представлены в таблице 1.

Серопозитивный вариант РА на момент исследования зарегистрирован у 59 (65,56%) пациентов, серонегативный - у 31 (34,44%). Об отягощенной наследственности по РА известно у 9 (10%) больных. Висцеральные прояв ления представлены поражением легких (плеврит, пневмонит) - 3 (3,33%) случая, поражением сердца (перикардит) - 1 (1,11%) случай. Ревматоидные узлы выявлены у 10 (11,11%) больных, типичная клиника синдрома Рейно присутствовала у 7 (7,78%) пациентов. Имевшиеся на момент включения в исследование системные проявления представлены в таблице 2.

У 77 (85,56%) пациентов выявлена функциональная недостаточность (ФН) различной степени выраженности: I - у 42 (46,67%) больных, II - у 34 (37,78%), ФНШ - у 1 (1,11%) [72].

Минимальная степень активности зарегистрирована у 23 (25,56%) пациентов, умеренная - у 45 (50%), высокая - у 22 (24,44%) больных. Распределение показателей активности РА представлено в таблице 3. I стадия выявлена у 5 (5,56%) пациентов, II - у 59 (65,55%), III - у 15 (16,67%), IV - у 3 (3,33%) больных. У 7 (28%) пациентов с впервые диагностированным РА характерных рентгенологических признаков (околосуставной остеопороз, эрозии) выявлено не было. В таблице 4 представлены рентгенологические признаки, описанные у пациентов с впервые выявленным РА.

Общая клиническая характеристика больных в исследуемой группе представлена в сводной таблице 5.

На момент первичного осмотра из 65 больных с установленным ранее РА только 39 (60%) пациентов получали БПВП непрерывно на протяжении не менее 3 месяцев перед исследованием (средняя продолжительность непрерывного приема БПВП у них составила 18,13±11,05 месяцев). В качестве базисного средства использовался главным образом метотрексат в дозе 7,5-20 мг/нед. (в среднем 11,82±3,47 мг/нед.).

Рекомендованная после первичного обследования базисная терапия включала преимущественно метотрексат в дозе 7,5-20 мг/нед. (в среднем 11,13+3,24 мг/нед.) - у 75 (83,33%) пациентов, а также сульфасалазин в дозе 2 г/сут. - у 11 (12,22%) больных.

НПВП использовались у 62 (68,89%) пациентов. Из них 24 (38,71%) больных принимали неселективные НПВП: 22 пациента получали диклофе-нак в дозе 50-200 мг/сут. (в среднем 115,91±38,99 мг/сут.), 2 - ибупрофен в дозе 600-800 мг/сут. У 38 (61,29%) пациентов использовался нимесулид в дозе 100-200 мг/сут. (в среднем 157,89±50,04 мг/сут.). Особенности терапии НПВП при различной степени активности РА представлены в таблице 10.

Глюкокортикостероиды (ГКС) получали 11 (12,22%) пациентов, из них 7 в виде bridge-терапии, 2 в виде пульс-терапии в связи с высокой некупи-руемой активностью болезни. Сохраняющаяся высокая активность РА на фоне максимально переносимых доз метотрексата послужила причиной постоянного приема преднизолона до 10 мг/сут. еще у 2 больных. 42 (46,67%) пациента в течение 12 месяцев перед исследованием получили внутрисуставное введение ГКС.

Активность апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите

В ходе работы проведена сравнительная оценка интенсивности апоптоза периферических лимфоцитов в группах РА, ОА и здоровых доноров. Результаты анализа интенсивности ФЦ EtBr и DAPI представлены в таблице 17. Реализация программированной клеточной гибели в виде 1-й 2-нитевых разрывов ДНК оказалась достоверно выше при РА по сравнению со здоровыми донорами (р 0,001). Обращает внимание высокая интенсивность ФЦ ДНК-тропных красителей при ОА с синовитом, которая для DAPI достоверно не отличается от таковой при РА. Активность апоптоза в обоих случаях может объясняться его индукцией на фоне воспалительного процесса. Количество разрывов ДНК у больных ОА без синовита было сопоставимо с данными здоровых доноров.

Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена в таблице при р 0,05, при р 0,01 и при р 0,001. Флуоресценция ДНК-тропных красителей EtBr DAPI Ревматоидный артрит (п=90) 6,01±0,40 31,10+3,00 Остеоартроз, синовит есть (п=10) 5,65±0,41 30,20±2,69 Остеоартроз, синовита нет (п=10) 5,20±0,П 28,70±1,19

Здоровые доноры (п=20) 5,20±0,19 28,06±0,98 Для выявления особенностей активации программированной клеточной гибели при РА и ОА были проанализированы результаты исследования активности К4, Кб, К8.

Данные по К4 представлены в таблице 18. К4 имеет достоверно более высокую активность при РА и ОА с синовитом по сравнению со здоровыми донорами, что, наиболее вероятно, связано с ее ролью активатора цитокинов и реализацией провоспалительных эффектов путем стимуляции синтеза про-стагландинов, ИФН-у, белков острой фазы. Активность К4 у больных РА выше, чем при ОА с синовитом (р 0,05). Отмечаются сопоставимые показатели в группах здоровых доноров и ОА без синовита.

Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена в таблице при р 0,05, при р 0,01 и при р 0,001.

В отличие от К4, выступающей в качестве активатора цитокинов и, предположительно, не участвующей существенно в реализации программи 69 рованной клеточной гибели, уровень К8 и Кб определяет интенсивность апоптоза при соответствующих путях инициации. К8 как активатор эффек-торных К по данным, представленным в таблице 19, достоверно более активна при РА, чем при ОА без синовита и у здоровых доноров. Обращает внимание отсутствие достоверных различий активности К8 у пациентов с РА и ОА с синовитом (р 0,05). Учитывая небольшое количество больных ОА с сино-витом и более высокие в среднем показатели для РА, не следует рассматривать полученные данные как подтверждение равной активности К8 в этих группах, однако отличие от здоровых доноров предполагает схожие пути реализации интенсивной программированной клеточной гибели.

Достоверность различий при сравнении с показателями здоровых доноров отмечена в таблице при р 0,05, при р 0,01 и при р 0,001. Положительная корреляция К8 с эффекторной Кб, представленная в таблице 20, является доказательством участия К8 в осуществлении апоптоза и указывает на отсутствие нарушений проведения апоптотического сигнала.

Таблица 20 Корреляция активности каспазы-8 и каспазы- Активность Кб по времени от начала реакции флуоресценции (в минутах) Активность К8 по времени от начала реакции флуоресценции (в минутах) 60 90 120 150 180 30 0,432 0,496 0,378 0,292 0,370 0,414 60 0,456 0,618 0,454 0,375 0,309 0,294 90 0,532 0,538 0,526 0,579 0,669 0,452 120 0,517 0,490 0,503 0,591 0,748 0,523 150 0,259 0,187 0,356 0,356 0,619 0,507 180 0,377 0,314 0,458 0,377 0,698 0,684 Статистическая значимость коэффициента корреляции (г) отмечена в таблице при р 0,05, при р 0,01 и при р 0,001.

Результаты исследования активности эффекторной Кб отражены в таблице 21. Высокий уровень Кб при РА подтверждает ее участие в реализации более интенсивной программированной гибели периферических лимфоцитов. Отсутствие достоверных различий по Кб у больных ОА с синовитом по сравнению со здоровыми донорами не исключает прочих, внекаспазных путей реализации апоптоза. Таблица 21 Активность каспазы-6, M±s

При анализе показателей ФЦ EtBr и DAPI у больных РА обращает внимание наличие достоверной отрицательной корреляции с активностью К8 и Кб. Таким образом, учитывая результаты, представленные в таблице 22, наиболее вероятно, что закономерно функционирующий путь от активирующей К8 до эффекторной Кб при РА не реализуется в виде разрывов ДНК.

Кроме того, принимая во внимание отрицательную корреляцию К8 и Кб с активатором цитокинов К4, которая отражена в таблицах 23-24, не исключается второй, ассоциированный с активностью РА, механизм нарушения программы апоптоза, реализуемый на уровне К8.

Изучение провоспалительных цитокинов, растворимой формы Fas-лиганда и апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите

С целью изучения закономерностей регуляции программированной гибели периферических лимфоцитов при РА в ходе работы часть больных была исследована на содержание в сыворотке крови ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а и sFasL

Среди 39 (43,3%) исследованных пациентов показатель sFasL в количестве, превышающем минимально определяемую концентрацию по используемой методике (0,1 нг/мл), выявлен у 14 (35,9%) больных. Необходимо отметить, что детектируемые уровни sFasL в крови здоровых доноров не обнаруживаются.

У пациентов с определяемыми концентрациями sFasL не выявлено достоверной корреляции как с длительностью РА, так и с основными клинико-лабораторными показателями активности болезни, представленными B V таблице 33.

Результаты исследования sFasL достоверно не различались в группах по степени активности РА (р 0,05). Больные, имеющие определяемые концентрации sFasL в сыворотке крови, при сравнении с группой пациентов из 25 (64,1%) человек с уровнем sFasL менее 0,1 нг/мл не продемонстрировали различий по основным клинико-лабораторным показателям активности РА. Обе группы были сопоставимы по объемам терапии, половозрастной структуре, длительности и рентгенологической стадии РА. Результаты сравнения по клиническим и лабораторным параметрам активности заболевания приведены в таблице 34.

Уровень sFasL сыворотки крови не зависел от серопозитивного или се-ронегативного варианта заболевания, а также от наличия или отсутствия системных проявлений, что отражено в таблицах 35-36.

Для оценки характера участия sFasL в регуляции программированной гибели периферических лимфоцитов при РА проведено сравнение показателей активности апоптоза у пациентов с определяемым sFasL в сыворотке крови и больных без детектируемых уровней. По данным, представленным в таблице 37, достоверных различий не выявлено.

Детектируемые значения концентрации sFasL сыворотки крови не имели достоверной корреляции с показателями активности апоптоза. Результаты приведены в таблице 38. Также не было выявлено достоверной корреляции sFasL с ИЛ-2 и ФНО-а (р 0,05).

Уровень ИЛ-6 исследован у 44 (48,9%) больных. Несмотря на отсутствие достоверных различий в группах по активности РА, что отражено на рис.1, и достоверной корреляции с индексом DAS4 (р 0,05) выявлена достоверная положительная корреляция ИЛ-6 с показателями hsCPB и а2-глобулина. Рост острофазовых показателей при увеличении концентрации ИЛ-6 отражает характерную цитокиновую индукцию гепатоцитов при воспалительном процессе. Роль ИЛ-6 как маркера активности воспаления подтверждается сохранением корреляции с острофазовыми показателями (hsCPB, фибриноген) при исследовании уровня цитокина у 34 пациентов через 6 месяцев и у 28 больных через 12 месяцев от начала наблюдения с коэффициентом корреляции (г) от 0,449 до 0,685 (р 0,001).

Учитывая, что у большинства здоровых лиц в сыворотке крови уровень ИЛ-6 ниже порога детекции, а в исследуемой группе больных РА концентрация цитокина не определена только у 3 (6,82%) пациентов, очевидна его роль как маркера воспалительной реакции. Данные представления подтверждает достоверно более высокое содержание ИЛ-6 в сыворотке крови у пациентов с системными проявлениями болезни (р 0,01), что отражено на рис.2. В то же время достоверных различий между серонегативными и серопозитивными больными по уровню ИЛ-6 не выявлено.

Не определялась достоверная корреляция уровня ФНО-а с основными клинико-лабораторными показателями активности РА. Не выявлено достоверных различий по показателю ФНО-а между больными с серонегативным и серопозитивным вариантами РА, при наличии или отсутствии системных проявлений (р 0,05). Данные приведены в таблицах 35 и 36.

Необходимо отметить, что при детектируемых уровнях ФНО-а в сыворотке крови отмечена его умеренная положительная корреляция с концентрацией ИЛ-6 (п=19, г=0,472, р 0,05).

При сравнении пациентов с детектируемыми концентрациями ФНО-а и уровнем цитокина менее 1,7 пг/мл не выявлено различий по клинико-лабораторным показателям активности при сопоставимом возрасте, длительности и стадиям РА. Результаты сравнения представлены в таблице 39.

Оценка влияния базисной терапии ревматоидного артрита на активность апоптоза периферических лимфоцитов

У «неответчиков» не отмечено динамики К к 6 месяцам, а к 12 месяцам выявлено повышение активности К8 с более интенсивной ФЦ DAPL Следует полагать, что часть пациентов данной группы будет иметь положительную клинико-лабораторную динамику при дальнейшем наблюдении.

Таким образом, у больных РА имеются признаки индукции программированной клеточной гибели метотрексатом, которая осуществляется, наиболее вероятно, каспазонезависимым путем или редукцией внутриклеточных ингибиторов К.

В качестве клинического примера возможности использования показателей активности апоптоза периферических лимфоцитов для оценки эффективности терапии базисными средствами приводится история болезни больной К., 56 лет, которая находилась в ревматологическом отделении ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» в декабре 2005 года. Клинический диагноз: Ревматоидный артрит, полиартрит, серопози-тивный вариант, стадия II, активность высокой степени, ФНII степени.

Суставной синдром дебютировал в 2002 году в виде нестойкого артрита мелких суставов кистей, купируемого периодическим приемом НПВП. Обследована впервые в декабре 2004 года, когда отметила значительное ухудшение в виде появления УС длительностью до 120 минут, стойко сохраняющегося симметричного полиартрита с поражением суставов кистей, стоп. По лабораторным данным РФ 192 МЕ/мл, СРБ 24 мг/л, ЦИК 0,181 ед.опт.пл. На основании критериев ACR диагностирован серопозитивный вариант ревматоидного артрита с рентгенологическими признаками II стадии заболевания по Штейнброкеру.

На фоне начатой терапии сульфасалазином в дозе 2 г/сут. отмечена отчетливая положительная динамика, позволившая полностью отказаться в дальнейшем от приема НПВП. Самочувствие больной оставалось хорошим до августа 2005 года, когда самостоятельно прекратила прием сульфасалази-на без клинических или лабораторных показаний для отмены базисного средства. В течение нескольких недель развилось ухудшение состояния - нарастающая по длительности УС, полиартрит с постепенным вовлечением большинства суставов и потребностью в постоянном приеме НПВП, прогрессирующее снижение массы тела.

Больная госпитализирована в ревматологическое отделение ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» в декабре 2005 года. Показатели суставного синдрома приведены в таблице 57.

Лабораторные данные: НЬ 124 г/л, эритроциты 4,0 Т/л, тромбоциты 240 Г/л, лейкоциты 5,4 Г/л, СОЭ 54 мм/ч, hsCPB 48,0 мг/л, фибриноген 5,5 г/л, РФ 512 МЕ/мл, ЦИК 0,185 ед.опт.пл., АлАТ 8,8 Е/л, АсАТ 10,0 Е/л, креатинин 69,4 мкмоль/л. Отсутствовали изменения в общем анализе мочи, на ЭКГ, рентгенограмме органов грудной полости.

Констатирована высокая активность болезни. Продолжена терапия НПВП, начато лечение метотрексатом в дозе 7,5 мг/нед. Больная выписана через 2 недели со дня госпитализации при некоторой положительной динамике клинических проявлений и лабораторных данных (СОЭ при выписке 47 мм/ч) с рекомендациями приема метотрексата в дозе 10 мг/нед.

С целью уточнения влияния эффективной терапии БПВП на липидный обмен у пациентов с РА была проведена оценка динамики липидного спектра в группах «неответчиков» и «ответчиков». При отсутствии эффекта лечения отмечено достоверное снижение уровня ЛПВП с повышением КАТ в динамике к 6 месяцам наблюдения, а к 12 месяцам повышение и концентрации ЛПНП (р 0,001). Результаты приведены в таблицах 60-61.

Учитывая возможное влияние провоспалительных цитокинов на обмен липидов, у всех пациентов, обследованных на содержание ФНО-а (п=50) и ИЛ-6 (п=44) в сыворотке крови, была проанализирована возможная их связь с данными исследования липидного спектра, в результате чего достоверной корреляции показателей не выявлено (р 0,05).

При изучении зависимости интенсивности апоптоза от уровня ЛПНП выявлена положительная корреляция ЛПНП и эффекторной Кб с коэффициентом корреляции (г) от 0,248 до 0,224 (р 0,05) при отсутствии корреляции с количеством разрывов ДНК и активностью К8. Не исключено, что полученная корреляционная связь обусловлена однонаправленной динамикой показателей при повышении активности РА, в связи с чем достоверно высказаться о прямом влиянии уровня ЛПНП на Кб не представляется возможным.

Таким образом, подтверждена преимущественная связь активности программированной клеточной гибели с активностью РА, но не с длительно стью болезни. Эффективная терапия БГГОП способствует снижению интенсивности ревматоидного воспаления с улучшением функционального статуса больных и сопровождается активацией программированной гибели периферических лимфоцитов. Повышение активности апоптоза более значимо при ВДРА по сравнению с ранее установленным РА и осуществляется главным образом за счет увеличения активности К8, Кб и степени реализации их эффекта. Отсутствие эффекта базисной терапии сопровождается снижением количества разрывов ДНК на фоне сопоставимых показателей К8 и Кб.

Эффективная терапия метотрексатом индуцирует интенсивность программированной гибели периферических лимфоцитов, предположительно, каспазонезависимым путем.

В течение года наблюдения не получено убедительных данных о возможности использования результатов исследования активности апоптоза с прогностической целью в отношении эффективности терапии БПВП. Вместе с тем, изменения показателей интенсивности программированной клеточной гибели могут предшествовать положительной клинико-лабораторной динамике, что требует динамического наблюдения пациентов.

Высокая активность РА и отсутствие эффекта БПВП могут способствовать не только накоплению активированных периферических лимфоцитов, но и неблагоприятным изменениям липидного спектра, что в совокупности предрасполагает к развитию раннего АС.

Похожие диссертации на Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите [Электронный ресурс]

Состояние циклических нуклеотидов в лимфоцитах при ревматоидном артрите с феноменом кортизолозависимостиХалитова, Гюзель Хайдаровна

Анализ влияния антиревматической терапии на фенотипические особенности и апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артритеКолосова Ирина Раисовна

Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артритеРябков Вадим Александрович

Клинико-патогенетическое значение исследования активности ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, пуриннуклеозидфосфорилазы и 5'-нуклеотидазы в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс]Агафонова Наталья Львовна

Функция системы гипофиз-гонады-надпочечники и состояние глюкокортикоидной рецепции лимфоцитов крови у детей с ювенильным ревматоидным артритомХайретдинова, Татьяна Борисовна

Клинико-патогенетическое значение исследования активности ферментов адениловой ветви пуринового метаболизма в лизатах лимфоцитов, эритроцитов и плазме крови больных ревматоидным артритомУшакова Ирина Сергеевна