Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Фармакология гепатопротекторов (обзор литературы)
1.1. Эпидемиология и этиология поражений печени 15
1.2. Патогенетические механизмы повреждения печени при острых гепатитах 16
1.3. Общие сведения о гепатопротекторах 28
1.3.1. Фармакология эссенциальных фосфолипидов 33
1.3.2. Фармакология препаратов солодки 37
1.3.3. Общие сведения о препарате фосфоглив 40
1.4. Резюме 40
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 42
2.1. Характеристика условий проведения эксперимента и объектов исследования 42
2.2. Моделирование экспериментального острого гепатита двухэтапный фармакологический скрининг 44
2.3. Методы биохимических исследований 45
2.4. Методы статистической обработки 48
ГЛАВА III. Сравнительный анализ гепатопротекторной активности препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки 50
3.1. Результаты скрининга первого этапа . 50
3.2. Результаты скрининга второго этапа 52
3.3. Резюме 56
ГЛАВА IV. Фармакодинамика препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива при остром экспериментальном токсическом гепатите 58
4.1. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей катехоламинов в крови и печени крыс с экспериментальным тетрахлорметановым гепатитом 58
4.2. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей 11-ОКС в крови крыс с экспериментальным тетрахлорметановым гепатитом 61
4.3. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей гистамина в крови и печени крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом 62
4.4. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей серотонина в крови и печени крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом 63
4.5. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей цитолиза гепатоцитов у крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом 64
4.6. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей липидного обмена у крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом 65
4.7. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику активности ПОЛ и антиокислительной системы у крыс с экспериментальным хроническим тетрахлорметановым гепатитом 66
4.8. Резюме 70
ГЛАВА V. Заключение 71
Выводы 91
Список литературы 93
- Патогенетические механизмы повреждения печени при острых гепатитах
- Методы биохимических исследований
- Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей серотонина в крови и печени крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом
- Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику активности ПОЛ и антиокислительной системы у крыс с экспериментальным хроническим тетрахлорметановым гепатитом
Введение к работе
Актуальность темы
Согласно данным ВОЗ за последние 20 лет во всем мире наметилась отчетливая тенденция к росту числа заболеваний печени, обусловливающих высокую смертность населения. Сегодня в мире количество больных с различной гепатобилиарной патологией превышает 2 млрд. человек. Только в странах СНГ ежегодно регистрируется от 500 тыс. до 1 млн. человек, страдающих тем или иным заболеванием печени. Резкому увеличению числа больных с хроническими заболеваниями печени способствовал рост заболеваемости токсическими (алкогольными и медикаментозными) гепатитами, а также существенный рост числа больных с ожирением и сахарным диабетом, которые являются основной причиной развития сравнительно новой нозологической формы – неалкогольной жировой болезни печени [Винницкая Е.В., 2007].
Широкая распространенность токсических гепатитов, значительное омоложение основных групп больных, рост хронических форм болезни, приводящих к снижению трудоспособности, определяют многогранность проблемы и актуальность ее исследования специалистами разных областей [Блюм Х.Е., 2005; Павлов Ч.С. и др., 2007; Custer B, 2004; Stckel F; Droz S, 2009].
Морфологические и клинические проявления патологических изменений в печени под действием повреждающих факторов подробно изучены и описаны [Syntichaki P, 2004], но биохимические механизмы реализации этих процессов в клетках печени выяснены еще не до конца [Чиркин А.В, 2008]. Важность изучения этих механизмов не вызывает сомнений, в том числе и из-за частого использования гепатотоксичных препаратов, химических веществ и связанной с этим возрастающей смертности [Lee W.M., 2003].
О повреждении гормональных и медиаторных механизмов регулирования гомеостаза при гепатитах известно немного, данные о роли катехоламинов и других биогенных аминов в формировании осложнений, возникающих на фоне гепатитов, являются противоречивыми [Политова В.П. и др., 1989; Мухаметзянов М.А., 1999]. Между тем, эти вещества оказывают как общее влияние, регулируя тонус сосудов, в том числе печени [Крыжановский Г.Н., 2002], так и локальное, взаимодействуя со специфическими рецепторами мембран гепатоцитов и участвуя в биохимических клеточных реакциях [Imbert-Bismut F., 2001]. Поэтому детальное исследование состояния симпатоадреналовой системы и ее связь с биохимическими звеньями функционирования гепатоцитов при острых гепатитах позволит дополнить имеющиеся сведения о патогенезе заболевания и выявить значение этой системы в защитно-адаптационных механизмах гомеостаза [Can S., 2008].
Одним из наиболее перспективных путей решения проблемы лечения гепатитов является рациональное использование наиболее эффективных гепатопротективных средств и их комбинаций. Однако, несмотря на длительный клинический опыт использования гепатопротекторов, границы их применения в гепатологии до сих пор не очерчены [Дударь Л.В., Чернявский В.В., 2009; Колганова К.А., 2009]. Кроме того, конкретный вклад в терапию тех или иных средств выяснить, как правило, невозможно, поскольку лечение в клинике осуществляется комплексно. Индивидуальную активность препаратов можно проверить только в эксперименте. Это в полной мере относится и к такой относительно «молодой» группе гепатопротекторов, как препараты солодки [Ткач С.М., 2009; , ]. До сих пор остается неясным вклад в «защиту» печени от патологического воздействия разных действующих начал корня солодки: терпенов, флаваноидов и полисахаридов.
Одними из наиболее эффективных гепатопротекторов являются препараты эссенциальных фосфолипидов [Рябоконь Е.В., 2009]. На российском фармацевтическом рынке представлены препараты эссенциальных фосфолипидов различных производителей, отличающихся друг от друга по составу фосфолипидов и/или по источнику их получения [Поливанов В.А., 2009]. Это может обусловить неодинаковую их фармакотерапевтическую эффективность, что делает целесообразным проведение исследований по сравнительной активности препаратов эссенциальных фосфолипидов различных производителей на модели экспериментального токсического гепатита.
Цель исследования
Сравнить гепатопротективную активность и особенности механизма действия препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и комбинированного средства «Фосфоглив» на модели токсического гепатита у белых крыс.
Задачи исследования
-
Изучить гепатопротективную активность различных препаратов солодки, используя методику двухэтапного скрининга.
-
Сравнить гепатопротективную активность различных препаратов эссенциальных фосфолипидов, используя методику двухэтапного скрининга.
-
Исследовать патохимические закономерности развития патологического процесса в печени: динамику изменения содержания в крови и печени катехоламинов (адреналин, норадреналин и дофамин), 11-оксикортикостероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы на модели несмертельного тетрахлорметанового гепатита у белых крыс.
-
Изучить влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и комбинированного средства «Фосфоглив» на динамику изменения содержания в крови и печени катехоламинов (адреналин, норадреналин и дофамин), 11-оксикортикостероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы на модели несмертельного тетрахлорметанового гепатита у белых крыс.
-
Определить наиболее эффективный гепатопротектор из изученных препаратов солодки, эссенциальных фосфолипидов и комбинированного средства «Фосфоглив» при тетрахлорметановом гепатите у белых крыс.
Научная новизна
В эксперименте по методике двухэтапного фармакологического скрининга были установлены наиболее эффективные лекарственные средства из групп препаратов солодки и эссенциальных фосфолипидов и их комбинации и определен их спектр защитного действия. При сравнительном исследовании терпеновых и биофлавоноидных препаратов из корня солодки был определен практически равный коэффициент их гепатопротективной активности. Из трех исследуемых препаратов эссенциальных фосфолипидов наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале.
В работе определены особенности механизма действия гепатопротекторов различной химической природы; найдено сходство и различие в развитии их гепатопротективного эффекта. Показано, что единым звеном в механизме действия гепатопротекторов является предупреждение медиаторно-гормонального дисбаланса в центральных и периферических структурах, а также прямая (более характерна для эссенциальных фосфолипидов) и/или косвенная (более характерна для препаратов солодки) регуляция активности ПОЛ и мембранотропная активность. Различия в регулирующем влиянии препаратов на обмен медиаторов и функции мембран определяют специфику их метаболических эффектов.
Практическая значимость
Предложена и экспериментально обоснована модифицированная методика скрининга для поиска соединений с гепатопротективной активностью.
На модели экспериментального гепатита у крыс ранжирована гепатопротективная эффективность трех препаратов эссенциальных фосфолипидов, использующихся в клинике; выявлена и ранжирована гепатопротективная эффективность различных препаратов солодки. Было показано, что наиболее полным спектром гепатопротективного действия обладает комбинированный препарат «Фосфоглив», чем отдельные препараты эссенциальных фосфолипидов или солодки.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При помощи модифицированного двухэтапного фармакологического скрининга был проведен анализ гепатопротективной активности 8 препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки; наибольшую эффективность показал комбинированный препарат «Фосфоглив».
-
Из препаратов солодки наибольшую активность проявили отвар (содержащий сумму действующих начал) и глицирризиновая кислота (тритерпеновая фракция), менее активен был ликвиритон (флавоноидную фракция). Препараты эссенциальных фосфолипидов (производящиеся на разных предприятиях и имеющие различные торговые названия) обладают далеко не равнозначной эффективностью: наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале, затем по нисходящей следовали эслидин и эссливер форте.
-
В развитии острого токсического гепатита можно выделить единое патогенетическое звено - гормонально-медиаторный дисбаланс и активацию свободно-радикального перекисного окисления липидов на фоне падения активности компонентов эндогенной антиокислительной системы. Это вызывает лабилизацию клеточных мембранных структур (повышение в печени активности кислой фосфатазы) и цитолиз гепатоцитов (повышение в крови активности АЛТ и альдолазы). Вторичным по отношению к этому является падение активности синтетических процессов и, в частности, нарушение белкового, углеводного и липидного обменов.
-
Эссенциальные фосфолипиды (эссенциале) и препараты солодки (глицирризиновая кислота), применяемые для терапии токсического гепатита по отдельности, не способны полностью восстановить нарушенный биохимический баланс организма животных, в то же время комбинированный препарат «Фосфоглив» (содержит эссенциальные фосфолипиды и глицирициновую кислоту) препятствует развитию гормонально-медиаторного дисбаланса (происходит нормализация содержания в организме животных катехоламинов, гистамина, серотонина, 11-оксикортикостероидов), нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ и предотвращает падение активности НАДФ-зависимого ПОЛ и истощение компонентов эндогенной антиокислительной системы, препятствуя, таким образом, нарушению функций цитоплазматических мембран, цитолизу и нарушению обменных процессов в печени.
Внедрение результатов исследования в практику
Основные научные положения и выводы работы применены в научной, педагогической и практической работе кафедры фармакологии и кафедры клинической фармакологии Ярославской государственной медицинской академии.
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2009), 66-летию Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2010), XI-м Международном конгрессе, «ЗДОРОВЬЕ И ОБРАЗОВАНИЕ В XXI ВЕКЕ» (МОСКВА 2010), 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 11 рисунками. Библиография содержит 300 литературных источников: 175 российских и 125 зарубежных.
Патогенетические механизмы повреждения печени при острых гепатитах
Выделяют два механизма гепатотоксичности: иммунные и химические. К иммунным молекулярным реакциям повреждения относятся: функционирование киллерных лимфоцитов и клеточных коопераций, образование неоантигенов и аутоантител, активация системы комплимента [106, 198]; к химическим - активация свободно-радикального окисления липидов и действие ряда эндогенных биологически активных веществ (некоторые цитокины, оксид азота и другие) [72, 99, 160, 167, 212]. Это может вести к гибели клеток вследствие повреждения плазматической мембраны и нарушения цитоскелета, дисфункции митохондрий, утраты внутриклеточного ионного гомеостаза, изменению активности ферментов [65, 106, 166].
Достаточно общим явлением для острых гепатитов различной этиологии можно отметить возникновение циркуляторных расстройств, вызванных генерализованной вазоконстрикцией вследствие активации сим-патоадреналовой системы. Гиперкатехоламинемия (адреналин, норадрена-лин) форсирует спазм прекапиллярных сфинктеров, что уменьшает объем капиллярного русла и снижает внутриорганный кровоток. Застой способствует венозному полнокровию со снижением скорости минутного кровотока печени и механическому нарушению оттока из центральных вен печеночных долек. Чрезмерное влияние катехоламинов, серотонина, гиста-мина вызывает изменение биохимизма клеток, приводящее к потере ферментов, замене К+ на Na+ и Са++, сдвигу РН в кислую сторону.
Внутрипеченочный холестаз возникает при повреждении желчь сек-ретирующих механизмов гепатоцита с нарушением секреции компонентов желчи и затруднением ее оттока, развитием гипертензии. Холестаз оказывает повреждающее действие на эпителий канальцев. Компоненты желчи (желчные кислоты, холестерин, билирубин) вызывают токсическое повреждение митохондрий, блокируя дыхательный цикл и окисление жирных кислот [161]. Нарушается энергетический обмен в клетке, что ухудшает мембранный транспорт. Подавляется синтез ингибиторов протеолиза (а2-макроглобулины, а 1-антитрипсин) и активируются лизосомальные гидролазы (катепсины, РНК-аза, ДНК-аза). Ферментативные нарушения вызывают деструкцию гепатоцитов, стеатоз, ограниченный некроз [272]. Происходит аутолиз некротизированных гепатоцитов с образованием комплекса «антиген-антитело», фиксация антител на ткани печени с некрозом и аутолитическим распадом паренхимы [89; 200].
Согласно общепринятым концепциям, основным универсальным механизмом повреждения и гибели клеток печени является процесс перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) [278]. Особо значимую роль свободно-радикальные процессы играют в патогенезе заболеваний печени токсического генеза [65, 171, 195].
Процессы ПОЛ носят общебиологический характер, являются необходимым метаболическим звеном. Они протекают в норме в здоровом организме и связаны с синтезом ряда гормонов, медиаторов, окислительным фосфорилированием, липолитической активностью и активностью ряда ферментов [28, 29]. Контроль за активностью процессов ПОЛ осуществляет сложная многоуровневая система антиоксидантной защиты (АОЗ), поэтому в нормальных условиях существует некое равновесное состояние между системой АОЗ и интенсивностью свободнорадикальных реакций. Нарушение этого равновесия приводит к окислительному стрессу. Для нейтрализации избыточной липопероксидации и поддержания внутриклеточной концентрации свободных радикалов и липоперекисей в организме человека существуют ферментная и неферментная системы. Первая представлена каталазой, супероксиддисмутазой, глутатионпероксидазой и другими пероксидазами. Ко второй системе относятся а-токоферол ацетат, каротин, аскорбиновая кислота, гистидин [29, 148].
Выделяют три уровня регуляции скорости свободнорадикального окисления [76, 141]. Первая ступень защиты - антикислородная, поддерживающая в клетке довольно низкое парциальное давление кислорода [223]. В первую очередь сюда относятся дыхательные ферменты, конкурирующие за кислород. Вторая ступень защиты — антирадикальная. Она состоит из различных веществ, имеющихся в организме: витамин Е, аскорбиновая кислота, стероидные гормоны и фермент супероксиддисмутаза (СОД). Они обрывают процессы ПОЛ, взаимодействуя со свободными радикалами. Третья ступень защиты — антиперекисная, уничтожающая уже образовавшиеся перекиси с помощью соответствующих ферментов (ката-лаза, пероксидаза, аскорбат-зависимый фермент) или неферментативно, связывая перекиси и включая их в метаболизм с последующим выведением из организма. При их недостатке возникает сдвиг равновесия в системе ан-тиоксиданты-прооксиданты. При увеличении количества свободных радикалов возникает антирадикальная цепь, действие которой направлено на гашение свободных радикалов. В липидной фазе в качестве ловушки радикалов выступает а-токоферол, реже - убихинон, в водной - аскорбиновая кислота, биофлавоноиды и группа антиоксидантных ферментов - катала-зы, глутатионредуктазы, глутатиопероксидазы, СОД [28,29].
Недостаточность антиоксидантной системы (АОС) быстрее всего приводит к срыву системы детоксикации организма и развитию отравления по типу оксидативного стресса, включающего процесс гибели клеток. При интенсивном образовании радикалов и накоплении продуктов ПОЛ снижается активность ферментов антиоксидантной защиты [53, 223]. Выраженная активация свободнорадикальных процессов, сопровождающаяся депрессией естественных антиоксидантных систем, определяет выраженность синдрома мезенхимальной воспалительной реакции при остром гепатите [1, 49].
Уровень ПОЛ при острых гепатитах возрастает в 1,9-3,5 раза в зависимости от тяжести течения болезни, антиокислительная активность плазмы снижается в 2,2-3,5 раза, что обусловлено истощением антиоксидантных резервов организма [90, 91]. Резкое усиление свободнорадикальных процессов при острых гепатитах приводит к сходным метаболическим нарушениям, несмотря на различную этиологию поражения печени [1, 22, 29, 32, 42, 60, 65, 87, 127]. Образование активных форм кислорода (АФК) и . пероксидов (пероксида водорода, липогидропероксида) разрушает первый уровень защиты печени - антикислородный. Образовавшиеся при этом свободные радикалы ненасыщенных липидов разрушают вторую ступень защиты — антирадикальную. При этом происходит резкое снижение активности всех ферментов антиоксидантной защиты, что приводит к сбою третьей, антиперекисной, защиты. Одновременно снижается уровень эффективности собственных антиоксидантов - токоферола и бета-каротина. Продукты ПОЛ (МДА, ДК, основания Шиффа - ОШ) оказывают мембра-нотоксическое действие, угнетают гликолиз, увеличивают проницаемость капилляров, вызывая отек, что ухудшает течение воспалительного процесса при гепатите. Такой каскад реакций приводит к дезорганизации мембран и повреждению митохондрий, активизируя процесс гибели печеночных клеток [76, 278].
Методы биохимических исследований
Двухэтапный скрининг препаратов на гепатопротективную активность осуществляли на модели экспериментального острого гепатита.
Основной задачей первого этапа было быстрое, объективное и относительно нетрудоемкое выявление гепатопротективной активности препаратов с возможностью ее количественного расчета [13]. Для этого воспроизводилась жесткая модель токсического гепатита, сопровождающаяся выраженным некрозом печеночных клеток и массовой гибелью лабораторных животных.
В начале исследования у белых крыс была определена токсичность тетрахлорметана или четыреххлористого углерода (СС14) — вещества, используемого для моделирования гепатитов [128]. При внутрижелудочном введении установлены дозы минимальной токсичности (ДМТ), 16%, 50%, 84% и 100% летальности (DLi6, DL5o, DL84, и DL10o), которые оказались равны 6,2; 7,5; 10,1; 12,6 и 15,8 мл/кг.
Для проведения I этапа скрининга была выбрана доза DL50 — 10,1 мл/кг. Введение исследуемых препаратов осуществлялось внутрижелудоч-но через 60 минут после введения токсиканта. Гепатопротективные средства вводили ежедневно всем выжившим животным на протяжении двух недель эксперимента. Анализируемыми критериями являлись процент выживаемости, продолжительность жизни погибших животных, весовой коэффициент печени.
На II этапе проводилось уточнение характера гепатопротективной активности отобранных на I этапе средств и выявление препаратов, обладающих наиболее стабильным и универсальным действием. Для этого у лабораторных животных создавали классическую модель несмертельного токсического гепатита путем однократного внутрижелудочного введения 5 мл/кг 50% раствора СС14 на подсолнечном масле [128]. Ежедневное введение препаратов осуществлялось внутрижелудочно через сутки после применения токсиканта. На 7 сутки эксперимента выполняли биохимические (активность АлТ и щелочной фосфатазы крови, содержание в крови альбуминов, а в печени - гликогена) исследования, на основании которых можно было сделать вывод о характере влияния гепатопротекторов на различные стороны функциональной активности.
Для оценки фармакологической эффективности изучаемых лекарственных средств нами введен коэффициент гепатопротективной активности -КГА[138, 170]. КГА рассчитывался на основании сравнения результатов 3 групп животных (1 - здоровые интактные животные, 2 - контрольные животные, 3 -животные, получающие препараты, по следующей формуле: КГА=К-0/ К-И где И - результат интактных животных, О - результат животных, получивших препараты, К, - результат контрольных животных. Изучение биохимических показателей осуществлялось при помощи спектрофлюориметрических (спектрофлюориметр "Hitachi" MPF-4) и колориметрических (фотоэлектроколориметр КФК-2-УХЛ4,2) методов. Для исследования у крыс брали кровь и печень. Уровень адреналина, норадреналина, дофамина определялся диффе-ренциально-флюориметрическим методом В.О. Осинской [108], основанном на окислении йодом адреналина, норадреналина и дофамина с образованием флюоресцирующих продуктов - адренолютина, норадренолюти-на и дофалютина. Флюоресценция адреналина и норадреналина измерялась при волне возбуждения 360 нм и флюоресценции 520 нм, дофамина -при 330 и 376 нм соответственно. Флюоресценцию опытных проб сравнивали с флюоресценцией определенных разведений кристаллического адреналина, норадреналина и дофамина. Расчет проводился по калибровочным графикам [108]. Концентрация катехоламинов в крови выражалась в мкг/мл, в печени - мкг/г. Определение 11-оксикортикостероидов проводилось по методике Ю.А. Панкова и И.Я. Усватовой [110], которая основана на том, что экстрагированные из плазмы крови 11-ОКС обнаруживают флюоресценцию после обработки проб смесью концентрированной серной кислоты и этилового спирта. Флюоресценция измерялась при длине волны 550 нм и возбуждении светом длиной волны 475 нм. Для определения концентрации 11-ОКС (в мкг/мл) использовалась стандартная проба, которая обрабатывалась, как и опытная. Вычисляли коэффициенты АД/НА; ДА/(АД+НА); 11-ОКС/А. Концентрацию общего холестерина, липопротеидов, триглицеридов в плазме крови определяли ферментативным колориметрическим методом с помощью стандартных наборов фирмы «Human», Германия [69]. Содержание холестерина (ХС) ЛПНП рассчитывали по формуле Фридвальда (Friedewald W.) как разницу между концентрацией общего холестерина, ХС ЛПВП и ХС ЛПОНП [128]. Концентрацию ХС ЛПОНП вычисляли как ТГ/2,2 (содержание триглицеридов, деленное на 2,2) [16, 69]. Совместное определение показателей гистамина и серотонина в крови проводилось методом, основанном на измерении флюоресценции продуктов конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом, а серотонина -с нингидрином по методике Л.Я. Прошиной (1981). Ориентируясь на интенсивность свечения стандартных проб, производится расчет показателей в мкг/мл и мкг/г. Для приготовления стандартных проб использовали гис-тамин дигидрохлорид фирмы «Fluka» (Швейцария) и серотонин-креатинин сульфат фирмы «Reanal» (Венгрия). Активность систем ферментативного (НАДФ-зависимого) и неферментативного (аскорбат-зависимого) ПОЛ определяли по скорости накопления МДА. В качестве прооксидантов использовали НАДФ, аскорбат и пиро-фосфат железа. Скорость ПОЛ выражали в мкМ МДА/мин х мл. [146]. Малоновый диальдегид (МДА) определяли спектрофотометрически; концентрацию МДА выражали в мкМ/мл [4, 146]. Определение токоферола проводили флюорометрическим методом. Концентрацию витамина Е выражали в мг% [165]. Количественное определение аскорбиновой кислоты (АК) проводили дихлорфенолиндофеноловым методом. Концентрацию витамина выражали в мг% [16, 165].
Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику показателей серотонина в крови и печени крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом
Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки на течение экспериментального тетрахлорметанового гепатита оценивалось по изменению динамики показателей гормонально-медиаторного баланса (ка-техоламинов, глюкокортикоидов, гистамина, серотонина), активности ферментов цитолиза (кислая фосфатаза и альдолаза), показателей перекисного окисления липидов и антиокислительной системы. В крови и печени животных определялось содержание адреналина (АД), норадреналина (НА) и дофамина (ДА). Моделирование острого экспериментального гепатита у белых крыс приводило у них к выраженной дисфункции симпатоадреналовой системы (табл. 4-1), которая, прежде всего, характеризовалась повышением в исследуемых тканях концентрации АД и НА и падением уровня ДА. Так, содержание АД достоверно повышалось и в крови (на 81%) и в печени (на 31%), а концентрация НА достоверно возрастала только печени на 20%. В крови увеличение содержания НА на 18% имело характер тенденции. Падение содержания дофамина в крови и печени на 38% и 34% было достоверным по отношению к интактным животным. Повышение значений коэффициента АД/НА в крови на 57% (р 0,05; табл. 4-1) свидетельствовало том, что несмотря на одновременность повышения концентрации АД и НА, в крови и печени этот процесс шел неравномерно: уровень АД увеличился в большей степени, чем НА. Это позволяет сделать вывод о том, что при остром гепатите происходит преимущественная активация гормональной компоненты САС, а не нейро-нальной. В печени «адреналиновый» коэффициент значимых изменений не претерпевал.
Падение значений «дофаминового» коэффициента [ДА/(АД+НА)] в исследуемых тканях (в 2,2 раза в крови и почти в 2 раза в печени; р 0,05; табл. 4.1) указывало о превалировании активности вазоконстрикторных КА над вазодилятирующими и, в итоге, о валовом снижении периферического кровотока.
Как видно из таблицы 4.1, применение исследуемых препаратов положительно влияет на динамику уровня адреналина в крови и печени при формировании острого токсического гепатита. Использование фосфоглива и эссенциале полностью предупреждало его нарастание, как в крови, так и в печени. При введении глицирризиновой кислоты, хотя и имело место достоверное возрастание концентрации данного катехоламина в крови, но в меньшей степени (всего на 16%), чем в контроле. В печени введение гли-цирризиновой кислоты также снизило уровень АД (на 9% по отношению к контролю, р 0,05). При использовании глицирризиновой кислоты концентрация АД в исследуемых тканях была достоверно выше, чем при введении фосфоглива (на 36% для крови и 23% для печени).
Как видно из таблицы 4.1, при моделировании острого токсического гепатита концентрация НА в крови повышалась недостоверно. Все исследуемые препараты недостоверно снижали ее на 8-21%. Фосфоглив в печени препятствовал достоверному нарастанию уровня НА.
Фосфоглив при введении животным с моделируемым острым токсическим гепатитом препятствовал падению уровня ДА, как в крови, так и в печени. Его применение приводило к полной нормализации исследуемого показателя. При введении эссенциале и глицирризиновой кислоты наблюдалась лишь тенденция к повышению содержания ДА в крови и в печени. Также, следует отметить, что при введении глицирризиновой кислоты уровень ДА крови и печени был достоверно ниже на 24% и 26%, чем при использовании фосфоглива.
Как было указано выше, достоверное повышение «адреналинового» коэффициента (табл. 4.1) в крови контрольных животных на 57% указывало на дисбаланс активностей гормонального и медиаторного звеньев САС в пользу первого. Введение больным животным фосфоглива и эссенциале способствовало нормализации значений коэффициента АД/НА.
Фосфоглив и эсенциале препятствовали отрицательному изменению значений показателей «дофаминового» коэффициента в крови и печени. Наиболее эффективным препаратом был фосфоглив: его применение приводило к полной нормализации исследуемого показателя. При введении глицирризиновой кислоты наблюдалась лишь тенденция к повышению значений «дофаминового» коэффициента в крови на 25% и в печени на 15%. Следует отметить, что при введении глицирризиновой кислоты значения коэффициента ДА/(АД+НА) крови и печени был достоверно ниже на 36% и 38%, чем при использовании фосфоглива.
Влияние препаратов эссенциальпых фосфолипидов, солодки и фосфоглива па динамику показателей 11-ОКС в крови крыс с экспериментальным тетрахлорметановым гепатитом У животных больных острым токсическим гепатитом наблюдалось выраженное (в 2,1 раза, р 0,05) повышение в крови концентрации 11-оксикортикостероидов. Применение фосфоглива и эссенциале способствовало нормализации содержания 11-ОКС крови. Глицирризиновая кислота была не эффективна (табл.4.2). Коэффициент 11-ОКС/АД ни в одной из контрольных и опытных групп не отличался друг от друга и от группы интактных животных. На фоне острого гепатита у экспериментальных животных наблюдался параллельный рост концентрации ГТ в крови и печени в 2,7 и 2,3 раза. Все исследуемые препараты приводили к положительной динамике уровня ГТ в крови и печени. Наиболее эффективным препаратом был фос-фоглив: его применение способствовало полной нормализации исследуемого показателя. Эссенциале, вводимый на фоне острого токсического гепатита, также нормализовал содержание ГТ в печени, а в крови, хотя и препятствовал его повышению (на 40%, р 0,05). Глицирризиновая кислота и эссенциале у больных животных достоверно препятствовали повышению уровня ГТ на 28%, но несмотря на это его содержание все равно в 1,8 раза было достоверно более высоким по отношению к здоровым крысам. В печени же при введении глицирризиновой кислоты наблюдалась лишь тенденция к снижению концентрации ГТ на 30%. Следует также отметить, что при введении глицирризиновой кислоты содержание ГТ в крови и печени было достоверно выше на 62% и 31%, чем при использовании фос-фоглива (табл.4.3).
Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и фосфоглива на динамику активности ПОЛ и антиокислительной системы у крыс с экспериментальным хроническим тетрахлорметановым гепатитом
При развитии токсического гепатита имеет место поражение печеночной паренхимы, некроз ряда клеток и их цитолиз. В качестве маркеров некротических процессов, происходящих в печени при ведении четырех-хлористого углерода, были выбраны два фермента - цитоплазматический гликолитический фермент фруктозо-1,6-дифосфоальдолаза (Фр-1,6-ДФА) и лизосомальный фермент кислая фосфатаза (КФ) (табл.4.5).
При развитии острого токсического гепатита уровень плазменной активности одного из ведущих ферментов гликолиза Фр-1,6-ДФА, локализованного в цитоплазме гепатоцитов и диффундирующего в кровь после гибели клетки повышался в 1,8 раза (табл. 4-5; р 0,05). Активность лизосо-мального фермента кислой фосфатазы, являющегося маркером клеточной деструкции, при экспериментальном остром токсическом гепатите повышалась на 41% (табл. 4-5; р 0,05).
Таким образом, эксперимент показал, что развитие острого экспериментального гепатита характеризовалось усилением процессов распада внутриклеточных структур с выходом цитоплазматических ферментов в кровеносное русло.
Введение фосфоглива и эссенциале оказывало значимое влияние на процессы цитолиза гепатоцитов: активность Фр-1,6-ДФА в крови нормализовалась (ее активность по отношению к контролю достоверно снизилась на 32 и 27% соответственно). Эффект глицирризиновой кислоты был менее значим и не достигал достоверных различий с группой контроля.
Состояние липидного обмена анализировалось по содержанию в крови триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов высокой, низкой и очень низкой плотности.
В условиях экспериментального острого токсического гепатита у белых крыс происходило существенное нарушение липидного обмена: повышение концентрации триглицеридов (ТГ) на 81% (р 0,05), изменение липопротеидного спектра (табл. 4.6). Сатистически достоверно снижался холестерин в антиатерогенной фракции ЛПВП: в здоровом контроле он составлял 22% от общего количества, при моделировании гепатита - 14% (р 0,05), что закономерно увеличивало степень атерогенности плазмы крови. Так, коэффициент ЖШП/ЛПВП достоверно повышался в 1,8 раза.
Как видно из таблицы 4.6, все исследуемые препараты не оказывали достоверного влияния на содержание в крови больных животных ОХ, ЛГШП и ЛПОНП. Стоит отметить, что введение фосфоглива и эссенциале повышало уровень ОХ (на 18 и 19%) и ЛПОНП (на 18 и 21%) по отношению к контрольным крысам, но это явление имело характер тенденции (р 0,05). В случае введения животным с токсическим гепатитом фосфог-лива и эссенциале наблюдалась нормализация значений коэффициента ЛПНП/ЛПВП. Все это вместе взятое снижало атерогенность плазмы больных животных.
Уровень ТГ нормализовался только при введении фосфоглива: по отношению к контролю он достоверно снизился на 27% и стал достоверно не отличим от содержания ТГ в крови здоровых животных.
В целом действие гепатопротекторов на липидный обмен можно охарактеризовать следующим образом: они способствовали снижению в крови содержания ТГ, не влияли на уровень ЛПНП и повышали синтез холестерина и его включение в антиатерогенные ЛПВП. Все это вместе взятое способствовало снижению атерогенности плазмы.
Повышение содержания продуктов пероксидации липидов в печени и эритроцитах больных крыс происходило только за счет аскорбат-зависимого ПОЛ, активность которого при остром токсическом гепатите достоверно возрастала в 2,5 и 3 раза соответственно (табл. 4.7). Активность ферментативного (НАДФ-зависимого) ПОЛ, наоборот, снижалась соответственно на 24 и 38% (р 0,05) по отношению к здоровому контролю. Происходило также нарушение соотношения активности ферментативного и неферментативного ПОЛ в исследуемых тканях: коэффициент АЗ/НЗ ПОЛ увеличивался при остром токсическом гепатите в 3,6 раза в печени и в 5 раз в эритроцитах.
Ограничение реакций ПОЛ в клетках до физиологического уровня достигается за счет согласованного функционирования специфических защитных антиокислительных систем.
При моделировании токсического гепатита активация ПОЛ происходила на фоне истощения возможностей антиокислительной системы организма: так, концентрация аскорбиновой кислоты в печени достоверно снижалась на 30% (таблица 4.7). Процессы, происходящие в печени, находили зеркальное отражение в показателях крови. Дополнительно к вышеперечисленным параметрам АОС в крови исследовали также концентрацию токоферола, которая падала на 28% (табл. 4.7; р 0,05).
Поскольку имеет место тесная связь между изменением проницаемости эритроцитарных мембран и мембран клеток, пораженных патологическим процессом органов [30, 49], исследовалась осмотическая резистентность эритроцитов при их инкубации в 0,5% растворе NaCl. При моделировании токсического гепатита процент гемолиза эритроцитов достоверно нарастал в 1,4 раза, что свидетельствовало о снижении осмотической резистентности эритроцитов при формировании патологического процесса (табл. 4.7; р 0,05).
Использование в качестве терапии токсического гепатита фосфогли-ва препятствовало у подопытных животных нарастанию активности аскрр-бат-зависимого ПОЛ. Одновременно с этим препарат противостоял истощению компонентов антиокислительной системы. Таким образом, фос-фоглив приводил к гармонизации систем ПОЛ и АОС и предотвращал нарушение функций цитоплазматических мембран. Один из итогов этого действия стабилизация мембран эритроцитов.
