Введение к работе
Актуальность проблемы
Аутоиммунные заболевания относятся к одним из наиболее распространенных заболеваний, которые в развитых странах поражают до 5 - 8% населения (Leffel et al., 2003). В основе патогенеза аутоиммунных болезней лежит развитие самоподдерживающегося иммунного ответа на собственные антигены организма, что приводит к деструктивным изменениям клеток и тканей, содержащих такие антигены (Галактионов, 2000). Несмотря на продолжающиеся многолетние исследования, точные причины возникновения аутоиммунных болезней до сих пор остаются неизвестными. К основным факторам, способствующим развитию аутоиммунных патологий, относятся генетическая предрасположенность (Rose, 2002), лекарственные средства и ксенобиотики, которые, в частности, включают органические и неорганические производные ртути (Frenkel et al., 1994; Ohsawa, 1997; Kimber, Dearman, 2002). Известно, что в подавляющем большинстве случаев (около 80%) аутоиммунные болезни поражают женщин вне зависимости от возраста (Fairweather, Rose, 2004).
В клинической практике для иммуносупрессии используются главным образом стероидные гормоны, циклоспорин, цитостатические иммунодепрессанты, антитимоцитарный глобулин. Значительные трудности в лечении тяжелых аутоагрессивных заболеваний связаны с тем, что применяемые для иммуносупрессии препараты дают многочисленные осложнения. Стероидные гормоны приводят к сахарному диабету, остеопорозу, язвенной болезни. Цитостатические иммуносупрессоры обладают миелотоксическим действием. Циклоспорин может приводить к почечной недостаточности (Vitko, Viklicky, 2004).
В связи с большим количеством побочных реакций, вызываемых вышеназванными препаратами, не прекращается поиск новых нетоксичных иммунодепрессантов, основное действие которых направлено на В- и Т-лимфоциты, так как считается, что именно В- и Т-клеточные клоны играют основную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Rose N.R. et al. 1993). Одним из препаратов, представляющим интерес для лечения системных аутоиммунных патологий, является отечественный пептидный препарат Тимодепрессин.
Тимодепрессин представляет собой синтетический дипептид, состоящий из двух неприродных D- аминокислот (триптофана и глютаминовой кислоты) в последовательности g-D-Glu-D-Trp. Он синтезирован в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук, а его свойства подробно изучены экспериментально и клинически (Deigin et al., 1999). При испытаниях показано, что Тимодепрессин уменьшает количество лимфоцитов, подавляет их активность, введение Тимодепрессина снижает колониеобразование в селезенке мышей, количество лимфоцитов в периферической крови и процент клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Тимодепрессин при различных схемах применения способен подавлять развитие реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) (Poverenny et al., 1999). Препарат разрешен Фармкомитетом МЗ РФ к медицинскому применению в 2000 году. Положительный эффект лечения с помощью Тимодепрессина больных с аутоиммунными цитопениями (Виноградова и др., 2002) может служить основанием для рекомендации препарата при широком спектре заболеваний аутоиммунного генеза. Однако эффективность Тимодепрессина на моделях системных аутоиммунных заболеваний до настоящего времени не изучена.
В качестве экспериментальных моделей системных аутоиммунных заболеваний человека, как правило, используют животных, развивающих аутоиммунный процесс спонтанно, например, модель системной красной волчанки на мышах NZB/NZW (Burkhardt, Kalden, 1997). Результаты исследований последних лет показывают также, что адекватной моделью системных аутоиммунных патологий могут стать инбредные животные, у которых аутоиммунный процесс индуцирован регулярными инъекциями сублетальных доз соединений ртути. У мышей с гаплотипами H-2s, H-2q и H-2f регулярные воздействия хлорида ртути в дозе 1, 6 мг/кг вызывают появление аутоантител к фибрилларину – белку ядрышка, участвующему в биогенезе рибосом (Reuter et al., 1989; Красильщикова и др., 2006). Фибрилларин, наряду с другими белками и рибо- и дезоксирибонуклеопротеинами клеточного ядра, является мишенью антител при системных аутоиммунных заболеваниях человека (Сперанский, Иванова, 2002), а антитела к нему встречаются у 7-10 % больных системными аутоиммунными заболеваниями (Tormey et al., 2001).
Было показано, что мыши с гаплотипом H-2s (линии SJL/J, B10.S и A.SW) более чувствительны по сравнению с линиями мышей, имеющими гаплотипы H-2q, H-2f (Hansson, Abedi-Valugerdi, 2003). У мышей линий SJL/J, B10.S и A.SW, как у больных людей, аутоиммунный процесс также сопровождается поликлональной активацией В- и Т-лимфоцитов, увеличением титра сывороточных иммуноглобулинов классов IgG и IgE и отложением иммунных комплексов в почках (Hultman et al., 1995; Roether et al., 2002).
Механизм индукции аутоиммунного процесса, вызываемого хлоридом ртути у мышей с чувствительным генотипом неизвестен. Наиболее распространенной является гипотеза о структурной модификации фибрилларина ртутью, протеолиз и представление измененного пептида в комплексе с молекулами MHC I и II класса клеткам иммунной системы (Chen, von Mikecz, 2005; Kubicka-Muranyi et al., 1995; Kubicka-Muranyi et al., 1996). Другая гипотеза основана на способности тяжелых металлов нарушать иммунологическую толерантность, которая в нормальном организме контролирует состояние аутореактивности (McCabe, 2003; Moneim, 1994; Ziemba, 2005).
Интересен также факт, что наличие аутоантител к фибрилларину коррелирует с повышенным содержанием ртути в моче больных системной склеродермией (Arnett et al., 2000). В 2004-2005 гг научной группой Сильва с соавт. при обследовании работников золотодобывающих рудников в Бразилии, где в производственном процессе активно используют ртуть, обнаружено, что в их крови содержатся антиядрышковые аутоантитела в повышенных концентрациях (Silva, 2004; Silbergeld, 2005).
Возвращаясь к экспериментальным моделям аутоиммунных заболеваний, стоит отметить, что статус здоровья лабораторных животных может оказывать существенное влияние на результаты эксперимента. Животные, содержащиеся в обычных (конвенциональных) условиях, как правило, инфицированы специфическими для грызунов вирусами и микроорганизмами, вызывающими у них заболевания, протекающие, чаще всего в хронической форме без выраженных клинических признаков. Известно, что некоторые возбудители специфичных для лабораторных грызунов инфекционных заболеваний, например, вирус мышиного гепатита - чрезвычайно распространенный контаминант вивариев, являются сильными иммуномодулирующими агентами (Baker, 1998). Однако литературные данные о влиянии патогенной микрофлоры грызунов на течение аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей, отсутствуют. Исключения влияния патогенной микрофлоры на иммунный статус животных можно добиться, сохраняя лабораторных животных в условиях, свободных от патогенной флоры (СПФ).
Как правило, целью экспериментов, проводящихся на лабораторных животных, является экстраполяция полученных данных на людей. Используя инбредных животных, исследователь имеет дело с определенным генотипом, и как следствие - фенотипом, что, несомненно, ценно для решения определенных задач. Однако учитывая, что в человеческой популяции представлен широкий диапазон генотипов, влияние различных факторов на популяцию в целом корректнее оценить на аутбредных (нелинейных) мышах. Аутбредные животные гетерозиготны по неопределенному числу генов и, подобно людям, генетически и фенотипически неоднородны. В связи с этим, аутбредных животных используют, в частности, для изучения токсикологических эффектов потенциально опасных реагентов (Гуськова, 2008). Последние литературные данные о способности хлорида ртути индуцировать образование антиядрышковых аутоантител у аутбредных мышей (Abedi-Valugerdi, 2009; Красильщикова и др, 2010) ставят под сомнение существующее представление о преимущественной роли генотипа в индукции аутоиммунных патологий у мышей.
Одной из важнейших проблем доклинических испытаний является корректный подбор лабораторной модели для исследования эффективности лекарственных препаратов. Принимая во внимание дефицит моделей системных аутоиммунных патологий, индуцированный хлоридом ртути аутоиммунный процесс у мышей, представляет особый интерес.
Цель работы
Целью данной работы являлась разработка отечественной лабораторной модели системного аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей, и ее использование для тестирования лекарственных препаратов.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать модель аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей линии SJL/J (включая, анализ образования аутоантител к фибрилларину и формирования иммунных комплексов в почках).
-
Проанализировать изменения титра аутоантител от времени, пола животного и присутствия патогенных возбудителей.
-
Провести исследование на описанной модели иммуносупрессорной активности широко применяющегося в клинической практике препарата циклоспорина (Сандиммун).
-
Провести исследование на описанной модели иммуносупрессорной активности отечественного пептидного препарата Тимодепрессина.
-
Проанализировать способность аутбредных (нелинейных) белых мышей развивать аутоиммунный процесс под действием HgCl2.
Научная новизна работы
Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено изучение аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути, у мышей линии SJL/J в течение длительного времени и снята еженедельная динамика аутоиммунного процесса индивидуально по каждому животному. Впервые показана разница в течении аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути, при использовании конвенциональных животных и животных, свободных от патогенной микрофлоры. Показано, что циклоспорин при профилактическом применении в дозе 50 мг/кг полностью подавляет образование аутоантител к фибрилларину у мышей линии SJL/J. Установлено, что модель отражает дозозависимость эффекта циклоспорина. Впервые проведено исследование иммуносупрессорного действия отечественного пептидного препарата Тимодепрессина на возможность подавления образования аутоантител к фибрилларину. Обнаружено, что Тимодепрессин значительно снижает аутоиммунный ответ у мышей в дозе 0,7 мг/кг при профилактическом применении и в дозе 0,35 мг/кг при терапевтическом применении. Впервые установлена способность мышей аутбредных стоков CFW и CD-1 развивать системный аутоиммунный процесс под действием хлорида ртути.
Научно-практическое значение
Полученные результаты показывают, что модель может быть использована для тестирования иммуносупрессорных препаратов, а так же для изучения механизмов индукции аутоиммунного процесса под влиянием солей тяжелых металлов.
Апробация работы
Результаты работы докладывались и обсуждались на Гумбольдтовской конференции (Санкт-Петербург, 2005); XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005); XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); II съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007); 6th International Congress on Autoimmunity (Porto, 2008); 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология. Естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008); Focus on Microscopy 2009 (Krakow, 2009); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009); International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (Moscow-Pushchino, 2009); семинаре отдела клеточной иммунологии ФБГУ «ГМЦ Институт иммунологии» ФМБА России; межлабораторном научном коллоквиуме ИБХ РАН 16 сентября 2010 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, 6 из них статьи в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на _____ страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован____ таблицами и ____ рисунками. Указатель литературы включает_____ отечественных и ______ зарубежных источников.
