Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время урологические инфекционные заболевания занимают одно из ведущих мест в клинике инфекционных патологий (Лопаткин Н.А., Переверзев А.С., 2006; Sobel J.D., Кауе Д., 2005). Пиелонефрит является одним из самых распространенных заболеваний почек в любых возрастных группах, частота которых за последние годы увеличилась и занимает второе место в структуре заболеваний после острой респираторно-вирусной инфекции (Калугина Г.В. и др., 1996; O’Donellj et al., 2002). Пиелонефрит имеет тенденцию к длительному течению, хронизации процесса и является основой глубоких морфологических и энзимопатических нарушений в почках, что в свою очередь, вызывает системные иммунометаболические изменения (Лопаткин Н.А. и др., 2000; Есилевский Ю.М., 2007).
При инфекционной патологии и, в частности, при необструктивном гематогенном пиелонефрите широко используются химиотерапевтические препараты, обладающие мощным бактериостатическим и бактерицидным действием и достаточно широким антимикробным спектром (Зубков М.Н., 2002; Рафальский В.В., 2004; Cilbert D., 2002; Emmеrson A.M., Jones H.M., 2003). Клинические наблюдения последних десятилетий свидетельствуют о значительном снижении эффективности антибиотиков (Неймарк А.И., Гаткин М.Я., 2005). Известно, что антибиотики являются ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот, липидов и углеводов, а также активно влияют на функции цитоплазматической мембраны клеток (Навашин С.М., 1997). Применение антибиотиков нередко сопровождается осложнениями, связанными с подавлением иммунитета. Подтверждением этого являются данные о значительном учащении рецидивов и снижении общей реактивности у больных, принимающих антибактериальные препараты (Переверзев О.С., 2006).
Снижение токсичности и повышение эффективности химиотерапевтических препаратов возможно селективным действием фармакологических средств на определенные клетки и органы (Неймарк А.И., 2000; Симамкович А.В., 2007). Направленный транспорт лекарственных средств в охваченную патологическим процессом зону позволяет наряду с созданием в ней высоких концентраций вводимого препарата максимально уменьшить нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие, снизить терапевтическую дозу препарата и кратность введения (Останин А.А. и др., 2000; Карпушина И.А. и др., 2001; Кирдей Е.Г. и др., 2001; Кузьменко В.В. и др., 2009).
Для достижения поставленной цели применяют микроконтейнеры, в качестве которых могут выступать липосомы, капсулы из человеческого альбумина, магнитные микросферы или аутоклетки крови (Костюченко А.Л. и др., 2000; Аносова Ю.А., 2010). Однако большинство известных носителей имеют ограничения по диапазону и количеству лекарств, которые они могут связывать, а также обладают токсичностью и иммуногенностью. Наиболее выгодным и с точки зрения биологической совместимости считаются системы доставки, в которых используются собственные клетки организма. Реализация идеи направленного транспорта лекарств идет по линии использования эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов в качестве контейнеров для доставки лекарственных средств (Лохвицкий С.В. и др., 1999; Шевцова О.М., Денисова О.И., 2001; Бельский А.Н., Потапчук В.Б., 2001).
Органоспецифичность клеточных носителей, полученных из форменных элементов крови, будет определяться, в первую очередь, свойствами форменных элементов - способностью лейкоцитов мигрировать в очаг воспаления, эритроцитов фиксироваться эритрофагоцитирующими клетками, в основном печени и селезенки, способностью тромбоцитов к адгезии на поврежденных участках интимы сосуда (Генинг Т.П. и др., 1988; Костюченко А.Л., 2000; Третьяков Б.В. и др., 2000).
Цель работы
Разработка экспериментального и теоретического обоснования применения направленного транспорта антибактериальных препаратов, основанного на использовании клеточных носителей, с целью повышения их эффективности и снижения иммунометаболических нарушений при необструктивном пиелонефрите.
Задачи
1. Разработка лабораторной технологии получения клеточных эритроцитарных и лейкоцитарных форм некоторых антибиотиков и фторхинолонов для осуществления направленного транспорта лекарственных препаратов.
2. Моделирование экспериментального необструктивного гематогенного пиелонефрита и оценка сравнительной эффективности свободных и клеточных форм антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов в условиях данной патологии.
3. Установление иммунометаболических нарушений и взаимодействий клеточных и молекулярных структур в их реализации при необструктивном пиелонефрите.
4. Анализ путей реализации иммуносупрессии при необструктивном пиелонефрите и возможностей ее предотвращения с использованием антигипоксанта рибоксина и гликолитического фермента лизоцима.
5. Исследование влияния системного введения некоторых антибиотиков и фторхинолонов на иммунометаболические процессы при инфицировании и необструктивном пиелонефрите.
6. Анализ механизмов реализации иммунометаболических эффектов антибиотиков и фторхинолонов и возможностей их фармакологической коррекции с помощью антиагреганта дипиридамола, антигипоксанта рибоксина, гликолитического фермента лизоцима, дезинтоксиканта ПВП.
7. Изучение влияния антибиотиков и фторхинолонов, включенных в эритроцитарные носители, на иммунометаболические показатели лабораторных животных при необструктивном пиелонефрите.
8. Изучение влияния антибиотиков и фторхинолонов, иммобилизованных на лейкоцитарных носителях, на иммунометаболические показатели лабораторных животных при необструктивном пиелонефрите.
9. Изучение влияния предварительного экспонирования эритроцитов и лейкоцитов в ультрафиолетовых лучах и магнитном поле и обработки клеточных форм антибактериальных препаратов лизоцимом и ПВП на иммунометаболические показатели лабораторных животных при необструктивном пиелонефрите.
10. Сравнительное изучение влияния эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибиотиков и фторхинолонов на активность метаболических маркеров эритроцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов при пиелонефрите.
Научная новизна
Впервые экспериментально обоснован метод направленного транспорта антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в аллогенные эритроцитарные и лейкоцитарные носители, при необструктивном пиелонефрите с целью их селективного воздействия на орган и повышения эффективности, снижения системной токсичности и коррекции нарушенных иммунометаболических процессов.
Установлена высокая бактерицидная и протективная активность антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов, включенных в клеточные носители. Выявлено, что введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в клеточные носители, оказывало более существенный фармакологический эффект, что выражалось в более ранней нормализации (5 – 7 сутки) клинических, лабораторных и гематологических показателей.
Установлено, что развитие необструктивного гематогенного пиелонефрита сопровождается резкими иммунометаболическими нарушениями – происходит дезинтеграция окислительно-восстановительных и энергетических процессов в эритроцитах, снижение функционально-метаболической активности нейтрофилов крови, угнетении ГИО и ГЗТ, появление иммуносупрессирующей активности у легких эритроцитов.
Впервые установлена клеточная кооперация в реализации иммунометаболических нарушений при пиелонефрите, которая заключается в том, что при инфекционном поражении почек усиливается выделение в сосудистое русло окислительно-модифицированных фосфолипопротеинов, под влиянием которых тромбоциты индуцируют у легких эритроцитов способность вызывать выделение прилипающей при 4 – 100С к стеклу фракции спленоцитов иммуносупрессирующих цитокинов, ММ 50 – 60 кДа (тромбоцитарно-эритроцитарный механизм).
Показано, что при пиелонефрите изменяется активность метаболических маркеров крови, участвующих в реализации иммунологических функций. Тромбоциты приобретают способность снижать активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов и ингибировать антителозависимую клеточную цитотоксичность.
Введение свободных антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов усиливало иммунометаболические изменения, вызванные пиелонефритом. Дипиридамол, рибоксин, лизоцим и ПВП снижали иммунометаболические нарушения при пиелонефрите и введении антибактериальных препаратов.
Впервые установлено, что введение клеточных (эритроцитарных и лейкоцитарных) форм антибактериальных препаратов нормализовало окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах, не вызывало процессов цитолиза и холестаза, в разной степени повышало функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, гуморальную и клеточную формы иммунного ответа. Введение клеточных форм аминогликозидов или фторхинолонов отменяло тромбоцито-эритроцитарный механизм иммуносупрессии: снижается иммуносупрессорный потенциал сыворотки крови, активность тромбоцитов, в крови появляются тяжелые эритроциты, индуцирующие выделение прилипающими при 32 – 370С и не прилипающими при 4 – 100С клетками селезенки иммуностимулирующих цитокинов ММ < 15 кДа. Иммуномодулирующее действие клеточных форм антибактериальных препаратов корригирует с показателями метаболической активности клеток крови. Установлены два метода усиления и пролонгации иммунометаболической активности клеточных носителей с антибактериальными препаратами. Первый – использование лекарственных средств, не вызывающих дополнительной фармакологической нагрузки: лизоцим и ПВП, второй – использование природных физических факторов: ультрафиолетовое облучение и магнитное поле.
Научная новизна подтверждена зарегистрированным открытием «Закономерность развития иммуносупрессии при нарушении энергетического гомеостаза организма человека и животных под действием тромбоцитов» (диплом № 397).
Практическая значимость
На основе экспериментальных данных разработана лабораторная технология получения эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов для использования в клинической практике, включающая адаптированные методики иммобилизации антибиотиков и фторхинолонов в эритроцитарные и лейкоцитарные носители; экспрессные физико-химические методики их стандартизации по количеству включенного препарата; условия хранения клеточных носителей и клеточных форм антибактериальных препаратов; оптимальные сроки хранения клеточных носителей без и с включенными препаратами. Установлен и экспериментально подтвержден коэффициент включения антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов в клеточные носители и предложена формула для его расчета; предложены формулы расчета объема крови, необходимого для включения в клеточные носители требуемого количества антибактериальных препаратов и исходной концентрации антибактериальных препаратов, необходимой для их включения в клеточные носители в требуемых количествах. Получены клеточные (эритроцитарные и лейкоцитарные) формы антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов, стандартизованные по количеству действующего вещества. Установлена инверсия действия антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных в клеточные носители на активность иммунной системы, неспецифическую резистентность организма, окислительно-восстановительные, энергетические процессы в клетках, процессы цитолиза и холестаза при экспериментальном пиелонефрите.
Показана перспективность клинических испытаний эффективности клеточных (эритроцитарных и лейкоцитарных) форм антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов при необструктивном пиелонефрите или других видах патологии, характеризующихся иммунометаболическими нарушениями, на фоне микробной компрометации организма.
Материалы диссертации внедрены в научную работу ряда кафедр Курского государственного медицинского университета, Воронежской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов, ОАО «Фармстандарт-лексредства».
Получен патент на изобретение «Иммобилизованная форма доксорубицина».
Связь диссертационной работы с планом НИР
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации темы 01201056147).
Положения, выносимые на защиту
1. Лабораторная технология получения эритроцитарных и лейкоцитарных форм некоторых антибиотиков и фторхинолонов для осуществления направленного транспорта лекарственных препаратов и оценка их эффективности в условиях экспериментального необструктивного пиелонефрита.
2. При экспериментальном необструктивном пиелонефрите наблюдается усиление процессов перекисного окисления липидов, снижение активности антиоксидантной защиты и энергетического потенциала эритроцитов, увеличение в крови количества иммуносупрессорных субстанций, угнетение функционально-метаболической активности нейтрофилов крови, гуморальной и клеточной форм иммунного ответа. В развитии иммуносупрессии важную роль играют тромбоцито-эритроцитарные и эритроцито-лейкоцитарные взаимодействия.
3. Системное введение свободных антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов усиливает иммунометаболические нарушения при необструктивном пиелонефрите.
4. Дипиридамол, рибоксин, лизоцим и ПВП снижают иммунометаболические нарушения при пиелонефрите и введении антибактериальных препаратов.
5. Введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в эритроцитарные носители, нормализует окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах, состояние гепатоцитов, повышает функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, гуморальную и клеточную формы иммунного ответа при необструктивном пиелонефрите.
6. Введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных на лейкоцитарных носителях без или в присутствии АТФ, нормализует окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах, нормализует или стимулирует функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, гуморальный и клеточный иммунный ответ при необструктивном пиелонефрите.
7. Иммунометаболическую активность антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в клеточные носители, в разной степени корригирует лизоцим, ПВП, ультрафиолетовое облучение и магнитное поле.
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на III, IX, XIV, российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1996, 2002, 2007), научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета (Курск, 2001); 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2002), 67-й, 72-й, 73-й, 74-й научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного центра РАМН (Курск, 2002, 2004, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2004), пленуме правления Российского общества урологов (Саратов, 2004), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), юбилейной межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2005), региональной научно-практической конференции, посвященной 20-летию факультета постдипломного образования (Курск, 2006), международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании» (Одесса, 2007), международной научно-практической конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармобразовании» (Белгород, 2008), международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (Москва, 2008), VII съезде аллергологов и иммунологов (Санкт-Петербург, 2009), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009), II и III Всероссийских научно-практических конференциях «Биотехнология, биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009, 2010), научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии», посвященной памяти профессора В.В. Пичугина (Курск, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии» (Москва, 2009), межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, микробиологии, биологической химии, клинической фармакологии и фармакотерапии, клинической иммунологии и аллергологии, ЛОР-болезней, кожных и венерических болезней, урологии, патофизиологии, акушерства и гинекологии, спортивной медицины и реабилитации, инфекционных болезней, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, НИИ экологической медицины, хирургических болезней № 2 Курского государственного медицинского университета.
Публикации
Опубликовано 55 научных работ, в том числе 15 в реферируемых изданиях, в двух монографиях и учебно-методическом пособии. Работы содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации. Зарегистрировано открытие и получены 2 патента.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 316 страницах машинописного текста, иллюстрирована 80 таблицами и 21 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список использованных работ включает 444 источника, 310 - на русском, 134 - на иностранных языках.
