Введение к работе
Актуальность проблемы. Макрофаги фенотипически и функционально гетерогенны и могут проявлять противоположную по своей сути активность, например, развивать воспаление либо купировать его, индуцировать иммунный ответ либо поддерживать его толерантность, разрушать ткани либо участвовать в их репарации и построении межклеточного матрикса [Stout R.D., Suttles J., 2004]. Свойства макрофагов являются результатом воздействия многих факторов, включая цитокины, хемокины, адренергические и холинергические агонисты, гормоны, иммуноглобулины, жирные кислоты. Как элемент врожденного иммунитета, макрофаги обеспечивают первую линию защиты от микроорганизмов, аллергенов, трансформированных клеток, вырабатывая микробицидные факторы, привлекая других участников неспецифической резистентности, регулируя сосудистый тонус в месте воспаления, а также фагоцитируя и уничтожая инфекционные агенты.
Макрофаги являются также одним из звеньев, связывающих врожденный и приобретенный иммунитет благодаря способности презентировать иммунокомпетентным клеткам чужеродные антигены, выделять хемокины, привлекающие лимфоциты к очагу воспаления, а также вырабатывать цитокины, способствующие протеканию иммунологических реакций. От поведения антигенпрезентирующей клетки (прежде всего, макрофага и дендритной клетки) в первую фазу иммунного воспаления зависит тип развивающегося иммунного ответа: продуцируя IL-12 или IL-10, они способствуют развитию Th1 или Th2 типа иммунного ответа [Alzona M. et al., 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher B., 2007].
В свою очередь, цитокины поляризованных T-хелперов индуцируют активацию макрофагов, причем качественно различную. Большинство функций макрофагов, которые традиционно ассоциировались с их активацией (фагоцитоз микроорганизмов, микробицидная активность, индукция воспаления, противоопухолевая активность), стимулируются цитокинами Th1, прежде всего, – IFN-. Такую активацию макрофагов стали называть классической [Gordon S., 2003; Mantovani A. et al., 2004, 2005]. Цитокины Th2 (IL-4, IL-10), в свою очередь, не просто подавляют классическую активацию, но вызывают появление у макрофагов качественно иных свойств. Эти макрофаги способствуют образованию межклеточного матрикса, репарации и ремоделированию тканей, подавляют воспаление, стимулируют сосудообразование, фагоцитируют апоптотические клетки [Martinez F.O., 2008]. Такую активацию макрофагов стали обозначать термином «альтернативная активация» [Gordon S., 2003; Mantovani A. et al., 2004, 2005].
Для классически активированных макрофагов (М1) характерна продукция воспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, стимуляция циклооксигеназы (COX) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS). Для альтернативно активированных макрофагов (М2) характерна продукция противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-, антагониста рецептора IL-1 (IL-1Ra), экспрессия печеночной аргиназы [Mantovani A. et al. , 2004, 2005].
У активированных макрофагов резко повышается потребление L-аргинина: М1 с помощью индуцибельной NO-синтазы преобразуют его в оксид азота и цитруллин; М2 с помощью аргиназы – в мочевину и орнитин [Munder M., 1998]. Макрофаг утилизирует L-аргинин преимущественно по одному из путей – либо через NO-синтазу, либо через аргиназу, что позволило рассматривать метаболизм аргинина как показатель типа активации макрофага [Munder M. et al., 1998; Kreider T. et al., 2007].
Хотя и М1, и М2 клетки способны к фагоцитозу, но это их свойство качественно различается. Известно, что активаторы М1 (IFN-g и TNF-a) увеличивают экспрессию CR3 и чрезвычайно мощно усиливают способность макрофагов к FcgR-опосредованному фагоцитозу и внутриклеточному киллингу патогенов [Erbe D.V. et al., 1990; Corradin S.B. et al., 1991; Drevets D.A. et al., 1996; Trinchieri G., Gerosa F., 1996; Ahmed J.S., 2002; Berclaz P.-Y. et al., 2002]. Фагоцитоз апоптотических клеток является признаком альтернативной активации [Rathmell J.C., Thompson C.B., 1999; Savill J. et al., 2002].
Макрофаги представляют собой важный регуляторный элемент гемопоэза [Дыгай А.М., Жданов В., Удут Е.В., 2009; Дыгай А.М., Жданов В., 2010]. Известно, что при иммунном ответе функционирование кроветворной ткани меняется (Th1 ответ сопровождается выходом в кровеносное русло нейтрофильных гранулоцитов, а клиническим признаком Th2 является повышенное содержание эозинофильных гранулоцитов). Показано, что сиалоадгезин (CD169) – иммуноглобулиноподобный рецептор семейства Siglec – экспрессируется на резидентных макрофагах костного мозга и лимфоидных органов [Crocker P.R., Gordon S., 1989], опосредует адгезию Т- и В-лимфоцитов с макрофагами лимфоидной ткани [Van den Berg T.K. et al., 1992], участвует в иммунном воспалении [Hartnell A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004; Ikezumi Y. et al., 2005]. При Th1-зависимых состояниях экспрессия сиалоадгезина повышается [Hartnell A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004]. Рецептор к эритробластам (CD163) – член семейства скавенджер-рецепторов – может связываться с бактериями и индуцировать локальное воспаление [Babs O. et al., 2009]. Воспалительные стимулы (ЛПС, IFN-g и TNF-a) подавляют экспрессию CD163, а противовоспалительные (IL-10 и дексаметазон), напротив, резко ее повышают [Buechler C. et al., 2000].
В отличие от лимфоцитов, которые, единожды поляризовавшись, не меняют свою ориентацию, макрофаги способны изменять свой поляризационный профиль [Gratchev A. et al., 2006]. Именно благодаря этой пластичности они представляют собой перспективную фармакологическую мишень для регуляции баланса Th1/Th2. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов, разрешённых к медицинскому применению, обладающих способностью изменять баланс Th1/Th2 клеток в желаемом направлении [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2000а], что объясняет востребованность в поиске препаратов с доказанной селективной способностью к регуляции этого баланса.
В нашей работе в качестве регуляторов функционального состояния были выбраны водорастворимые полисахариды высших растений (аир болотный, береза повислая, девясил высокий, календула лекарственная, клевер луговой, полынь горькая, мать-и-мачеха обыкновенная), альгинат кальция (кальциевая соль альгиновых кислот, полученная из бурых водорослей) и D-глюкуроновая кислота, а в качестве препаратов сравнения были взяты фармакопейные препараты (ликопид, галавит и глутоксим), главной фармакологической мишенью которых является макрофаг. Так, ликопид изменяет функциональное состояние макрофага, взаимодействуя с паттерн-распознающими структурами клетки [Иванов В.Т. и др., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В. 1996, 2003], а галавит и глутоксим изменяют функционально-метаболическую активность макрофагов [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2003; Мрикаев Б.М., 2005; Мирошник О.А., Редькин Ю.В., 2006].
Действие выбранных нами новых веществ на макрофаги и иммунный ответ ранее не изучалось. В литературе имеются косвенные данные, позволяющие предполагать наличие у них способности изменять функциональное состояние макрофага и проявлять иммуномодулирующие свойства. Так, известно, что:
- растительные полисахариды могут взаимодействовать со многими рецепторами макрофагов, вызывая при этом развитие воспалительных или противовоспалительных свойств и, как следствие, способствовать протеканию Th1 и Th2 типа иммунного ответа [Schepetkin I.A., Quinn M.T., 2006];
- соли альгиновой кислоты проявляют противоопухолевую активность, в основе которой лежит стимуляция цитотоксических свойств макрофагальных клеток [Otterlei M. et al., 1991; Fujihara M. et al; 1993];
- структуры с высоким содержанием D-глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспрессии их рецепторов [Camenisch T.D., McDonald J.A., 2000], а также функций дендритных клеток [Termeer C.C. et al., 2000].
Учитывая изложенные выше факты, представляется актуальным исследовать специфические характеристики макрофагов при Th1/Th2 иммунном ответе и выявить показатели, которые наиболее адекватно свидетельствовали бы о функциональном состоянии макрофага; опираясь на полученные данные, изучить влияние полисахаридов различной природы на макрофаги и иммунный ответ.
Цель работы: изучить регуляцию функционального состояния макрофагов при Th1/Th2 экспериментальном иммунном ответе водорастворимыми растительными полисахаридами и обосновать их применение для модуляции иммунного ответа.
Задачи:
-
Разработать модели для изучения функционального состояния макрофагов при экспериментальном Th1 и Th2-зависимом иммунном ответе для отбора веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами.
-
Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных и исследовать роль сигнальных молекул p38, МЕК 1/2 и PI3K в их NO-стимулирующем действии.
-
Оценить действие водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на метаболизм аргинина перитонеальных макрофагов, стимулированных и нестимулированных липополисахаридом E. coli.
-
Изучить влияние фракций полисахаридов на баланс продукции NO/аргиназы макрофагами, а также роль внутриклеточных сигнальных молекул в активации продукции оксида азота.
-
Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов in vitro.
-
Исследовать влияние in vivo водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на Th1 и Th2-зависимые гуморальные и клеточные реакции.
Научная новизна. Разработаны модели для изучения функционального состояния макрофагов при Th1/Th2 экспериментальном иммунном ответе in vitro, позволяющие по способу метаболизма аргинина быстро и эффективно проводить скрининг веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Впервые в динамике иммунного ответа выявлено, что при Th2-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется; в динамике Th1-зависимого иммунного ответа баланс NO/аргиназа постепенно изменяется в сторону аргиназы. Впервые показано, что независимо от типа иммунного ответа фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов значительно увеличивается. Экспрессия костномозговыми макрофагами сиалоадгезина (CD169) снижается, а экспрессия рецептора к эритробластам (CD163) не меняется при Th1 и значительно понижается при Th2 типе иммунного ответа.
Исследовано влияние in vitro водорастворимых полисахаридов (выделенных из фармакопейного растительного сырья аира, клевера, мать-и-мачехи, полыни, календулы, берёзы, девясила), а также D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами. Показано, что некоторые из исследованных веществ по своему активирующему действию не уступают липополисахариду E. сoli, но при этом механизм их NO-стимулирующей активности отличается от действия липополисахарида E. сoli и полностью зависим от сигнальной молекулы фосфотидилинозитол-3-киназы (PI3K), частично от MAP киназ р38 и МEK1/2.
Впервые показано, что исследуемые водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов березы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция in vitro сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону оксида азота. На макрофаги, стимулированные липополисахаридом E. сoli, исследуемые вещества могут действовать как синергисты, так и как антагонисты.
У полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи обнаружена уникальная способность увеличивать секрецию провоспалительного цитокина IL-12 перитонеальными макрофагами мыши, но при этом не влиять на выработку противовоспалительного IL-10. Все тестируемые вещества усиливают выработку TNF- и ингибируют продукцию IL-10 мононуклеарами человека.
Обнаружено, что фракции полисахаридов березы и клевера сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота, установлена роль сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы, МЕК1/2, транскрипционного фактора NF-kB и цАМФ в активации NO-синтазы исследуемыми фракциями.
Впервые проведено комплексное исследование иммуномодулирующих свойств водорастворимых растительных полисахаридов, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на моделях Th1 и Th2 иммунного ответа. Установлено, что курсовое введение исследуемых веществ стимулирует Th1 тип иммунного ответа, кроме того, большинство тестируемых веществ проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.
Практическое значение работы. В работе изучены иммунофармакологические свойства растительных полисахаридов, их способность изменять функциональное состояние макрофагов в сторону усиления провоспалительных свойств и регулировать иммунный ответ Th1 и Th2 типов. Получены данные о фармакодинамике новых веществ как на уровне системных реакций организма (иммунный ответ), так и на клеточном (макрофаги) и пострецепторном (NF-kB, цАМФ, р38, PI3K и МЕК1/2) уровне, что может служить основой для дальнейшей разработки этих веществ и получения новых фармакологических иммуномодуляторов, стимулирующих Th1-зависимые реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний. На основании результатов работы получено 8 патентов на изобретение.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. При протекании иммунного ответа Th1 или Th2 типа in vivo активация макрофагов имеет черты как классической, так и альтернативной активации (смешанная активация). В динамике Th1-зависимого иммунного ответа стимуляция индуцибельной NO-синтазы снижается и выявляется активация аргиназы; при Th2-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется.
2. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция изменяют функциональное состояние макрофагов. Характерным свойством этих веществ является способность активировать макрофаги in vitro классически, стимулируя преобладание провоспалительных черт: усиление синтеза оксида азота и провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF-.
3. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция обладают иммуномодулирующими свойствами, стимулируют Th1 и подавляют Th2 тип иммунного ответа, а именно, способствуют усилению реакции ГЗТ и повышению числа антителообразующих клеток, при этом снижают содержание иммуноглобулинов E и G1 в сыворотке крови и тяжесть протекания анафилактического шока.
Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на Республиканской научно-практической конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на Х международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на «IV Съезде физиологов Урала» (Екатеринбург, сентябрь 2009).
Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 17 научных статей (в том числе 1 в зарубежном издании), из них 13 в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 8 патентов на изобретение.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 2 рисунками и 52 таблицами. Библиографический указатель включает 485 источников, в том числе 155 отечественных и 330 иностранных.
Похожие диссертации на Фармакологическая регуляция функционального состояния макрофагов при иммунном ответе
