Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор Используемые в клинической практике и разрабатываемые антикоагулянты 13
1. Современные антикоагулянты 13
1.1. Антикоагулянты непрямого действия 15
1.2.Антикоагулянты прямого действия 15
1.2.1. Прямые ингибиторы тромбина и активированного факторах 16
1.2.1.1. Ингибиторы тромбина для парентерального введения 16
1.2.1.2. Ингибиторы тромбина и фактора Ха для перорального использования 19
1.2.2. Активаторы плазменного ингибитора антитромбина 21
1.2.2.1. Препараты гепаринов 21
1.2.2.2. Нейтрализация антикоагулянтной активности гепаринов 25
1.2.3. Побочные эффекты современных антикоагулянтов 28
2. Разрабатываемые новые антикоагулянтные средства 29
3. Антикоагулянтная и антитромботическая активность разрабатываемых нативных и химически модифицированных соединений, выделенных из растительных источников 31
Глава II. Материалы и методы исследования 38
Глава III. Результаты собственных исследований 51
3.1. Эксперименты in vitro 51
3.1.1. Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте активированное частичное тромбопластиновое время 51
3.1.2. Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте протромбинового времени 54
3.1.3. Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте тромбинового времени 56
3.1.4. Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте РеаКлот-гепарин (НПО "Ренам") 58
3.1.5. Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте анцистронового времени 61
3.1.6. Ингибирование исследуемыми соединениями амидолитической активности тромбина и фактора Ха 63
3.1.7. Влияние соединений на агрегацию тромбоцитов человека 68
3.1.8. Проведение горизонтального биоспецифичного электрофореза с поликатионами в геле агарозы 70
3.1.9. Нейтрализация сульфатом протамина антикоагулянтной активности исследуемых соединений
3.2. Эксперименты ex vivo 76
3.2.1. Внутривенное введение кроликам образца СЦ 906 (молекулярная масса 50 кДа, степень сульфатирования 2,4) и сульфата протамина 76
3.2.2. Геморрагическая активность СЦ 906 (молекулярная масса 50 кДа, степень сульфатирования 2,4) 84
3.2.3. Антитромботическая активность СЦ 906 (молекулярная масса 50 кДа, степень сульфатирования 2,4) 85
Глава IV. Обсуждение результатов 89
Выводы 104
Практические рекомендации 106
Список использованной литературы 107
- Ингибиторы тромбина для парентерального введения
- Антикоагулянтная и антитромботическая активность разрабатываемых нативных и химически модифицированных соединений, выделенных из растительных источников
- Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте тромбинового времени
- Проведение горизонтального биоспецифичного электрофореза с поликатионами в геле агарозы
Ингибиторы тромбина для парентерального введения
Подобная трепсину сериновая протеаза свертывающей системы крови тромбин (фактор Па) является ключевым ферментом, участвующим в катализе преобразования растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, одну из основ тромба [85]. Разнонаправленность действия тромбина (может быть прокоагулянтом и антикоагулянтом [122]) объясняется тем, что этот фермент: 1. активирует тромбоциты и тромбоцитарные рецепторы активируемые протеиназами (platelet protease-activated receptor -ПАР -1и ПАР -4), моноциты, нейтрофилы, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры, участвуя в прокоагулянтных и провоспалительных процессах; 2. активирует факторы свертывания V, VIII и XI, что способствует генерации тромбина; 3. расщепляет фибриноген до нитей фибрина, опутывающих тромбоциты и скрепляющих сгусток; 4. активирует фактор XIII, что приводит к стабилизации сгустка за счет "прошивания" трансглутаминазой нитей фибрина и появлению устойчивости к лизису; 5. в присутствии тромбомодулина активирует протеин С и снижает фибринолиз, опосредованный тромбин-активируемым ингибитором фибринолиза [121].
Активный центр тромбина (Т) представлен классической каталитической триадой - His57, Asp 102 и Serl95. Наряду с активным центром существует положительно заряженный субстрат-связывающий экзосайт-1, который служит для прикрепления субстратов в надлежащей ориентации [85] и является связывающим участком тромбина к фибрину [137], участвующим во взаимодействии с фибриногеном, гирудином, рецепторами PAR - 1, тромбомодулином, факторами V и VIII, гликопротеидом lba и отрицательно заряженным доменом плазменного ингибитора сериновых протеаз кофактора гепарина II (ГК). Гепарин - связывающий экзосайт-П находится на противоположной от экзосайта-1 стороне молекулы тромбина [229]; связывание гепарина приводит к ингибированию тромбина и облегчению взаимодействия тромбина с антитромбином (AT) [208]. Взаимодействия соединений с экзосайтами могут стимулировать аллостерические изменения в активном центре, что приводит к увеличению ферментативной активности тромбина. Прокоагулянтная активность Т связана с присоединением ионов Na+ к петле тромбина Cys220rp225, свободный же от ионов Na+ тромбин может активировать протеин С, увеличивая таким образом АК потенциал [122; 25].
К прямым ингибиторам Т для парентерального введения относят следующие пептидомиметики: ингибиторы, взаимодействующие только с активным центром протеазы - аргатробан [37], и ингибиторы, взаимодействующие и с активным центром, и с фибриноген-связывающим экзосайтом I протеазы - рекомбинантные гирудины (лепирудин, десирудин, бивалирудин) [36; 105; ПО; 222; 227].
Гирудин, состоящий из полипептидной цепи из 65 аминокислот с тремя дисульфидными мостиками, выделяется слюнными железами медицинской пиявки Hirudo medicinalis. На ТугбЗ у сильного природного АК гирудина располагается сульфатная группа, из-за которой увеличивается аффинность к Т, по сравнению с рекомбинантными гирудинами (r-гирудины без такой группы). Высокая стоимость (трехдневный курс лечения гирудином составляет 1000$) и большая вероятность кровотечений ограничивают использование этого АК. В настоящее время применяют два препарата г-гирудина {лепирудин-lepiradin (Refludan, Pharmion, Великобритания и Berlex Лаборатории, США) и десирудин-desirudin (Revasc, Novartis) [44]} с незначительными структурными и фармакологическими отличиями: на N-конце лепирудина последовательности -Leulyr2 и Vall-Val2 для десирудина. Лепирудин применяют внутривенно, период полувыведения составляет приблизительно 1 час; выводится через почки. Десирудин используют для предотвращения тромбозов после ортопедических операций. Бивалирудин - состоит из меньшей полипептидной цепи, чем гирудин (20 против 65 аминокислот), и соответственно с меньшей молекулярной массой (ММ 2180 против, 7000 Да). В молекуле бивалирудина объединены С-конец додекапептида природного гирудина (аминокислотные остатки 53-64) с N-концом тетрапептида (D-Phel-Pro2- Arg3-Pro4) и четырьмя остатками глицина, соединяющими эти два сегмента вместе [148]. Как и у гирудина, С-конец связывается с экзосайтом 1 Т. Природный и r-гирудины нековалентно связываются с Т. Однако связь гирудина с Т, по существу, необратима благодаря высокой аффинности. Напротив, бивалирудин демонстрирует необратимую связь с Т, медленно трансформирующуюся по обратимой кинетике в случае протеолиза этого аналога гирудина в соединении Arg3-Pro4. Коммерческий бивалирудин (Angiomax), в дополнении к аспирину, используют для предотвращения тромбоза у пациентов с нестабильной стенокардией после операции на сосудах.
Аргатробан (Argatroban) - синтетическое L-аргинин производное, обратимый прямой ингибитор Т [70]; применяют внутривенно, в том числе и в случаях индуцированной гепарином тромбоцитопении, тромбозов периферических сосудов или сосудов мозга (период полувыведения 45 мин). АК активность аргатробана контролируют с помощью АЧТВ, доза регулируется так, чтобы время свертывания плазмы в тесте АЧТВ увеличивалось в 1.5-3.0, в сравнении с контролем.
К прямым ингибиторам тромбина для парентерального использования можно отнести и концентраты плазменного ингибитора сериновых протеаз -антитромбина [231; 260]. Дефицит AT, приводящий к тромбозам [39], корректируют трансфузией AT, выделенного из плазмы человека или полученного с помощью рекомбинантных технологий [76; 142]. Не считая относительно редких случаев наследственного дефицита AT, снижение этого ингибитора наблюдают при различных патологических состояниях: синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания [60], некоторых случаях острых тромбозов [231], сепсисе [257], тепловом шоке [82].
Долгое время, оральные антагонисты витамина К (OAK), такие как варфарин, были единственными АК для перорального приема, используемыми при длительном лечении. Однако у OAK наблюдали ряд особенностей, которые усложняли их применение в обычной клинической практике: медленное начало действия, узкий терапевтический диапазон, многочисленные взаимодействия с другими лекарствами или с пищей, нестабильный АК ответ, что предполагало частый контроль за лечением [172]. Поэтому необходимость в новых, эффективных и удобных АК для перорального использования, без частого контроля за дозой всегда существовала, что стимулировало разработку исследователями новых АК для перорального использования, в основном ингибиторов тромбина и фактора Ха [38; 218].
В настоящее время для профилактики и лечения венозной тромбоэмболии при операциях на бедре или колене, инсульта, тромбоза глубоких вен, инфаркта у пациентов с фибрилляцией предсердий, иногда, перорально применяют новые оральные антикоагулянты (НОАК) такие аптечные препараты ингибиторов тромбина и фактора Ха, как дабигатрана этексилат (прадакса), ривароксабана (ксарелто) или апиксабана, соответственно [172].
Преимущества НОАК перед антагонистами витамина К - быстрое начало/конец действия, меньшее число взаимодействий с другими лекарствами, предсказуемая фармакокинетика, без необходимости регулярного контроля коагуляции, что может позволить использование фиксированных доз [26].
Антикоагулянтная и антитромботическая активность разрабатываемых нативных и химически модифицированных соединений, выделенных из растительных источников
Помимо антикоагулянтных свойств ученые проводили исследования и в других областях патологий сердечно-сосудистой системы, а именно оценивали антитромботические (АТБ) свойства, свойства ингибирования роста клеток сосудов (антифиброзные эффекты) фукоиданов [269]. В опытах на лабораторных животных (крысах и кроликах) использование фукоидана уменьшало размеры рубцов после смоделированной ишемии крыс, высокосульфатированный фукоидан в опытах с артериальным тромбозом ингибировал активность по отношению к тромбину [151; 269].
Каррагенаны, выделенные из красных водорослей, также обладали антикоагулянтными, антитромбоцитарными свойствами. В опытах Byankina Barabanova и соавт. нативный полисахарид имел высокую АК активность, что связано с содержанием сульфатов, а также 3,6-ангидрогалактана, галактозы [48; 225]. Но при всем этом каррагенаны являлись более слабыми ингибиторами в сравнении с гепарином. При дополнительном сульфатировании образцов и сохранении умеренной молекулярной массы АК активность увеличивалась и могла приравниваться к гепарину [79].
Помимо водорослей, интерес в качестве сырья для АК и АТБ средств представляют морские про- и эукариоты. Их разнообразие велико, что позволяет найти новые структуры со специфической активностью, но при этом из-за высокой сложности и мало изученности молекул применение их в фармакологии и биотехнологии является пока ограниченным [64]. Исследователи продемонстрировали способность сульфата дерматана, выделенного из асцидий, уменьшать размер тромба на модели артериального тромбоза у мышей [139]. Другая группа ученых оценила способность ГАГ, выделенного из семейства Haliotidae, увеличивать время образования фибринового сгустка в тестах АЧТВ и ТВ [152]. Фукан, выделенный из голотурии при помощи кислотного гидролиза, также ингибировал активности тромбина и фактора Ха через антитромбин, а хондраитин, выделенный из того же источника, оказывал меньшее воздействия на увеличение времени свертывания, при этом действуя посредством кофактора гепраинаП [56;57]. Большой класс растительных полисахаридов составляют пектины, которые присутствуют во всех клеточных стенках высших растений. Главная цепь молекулы состоит из 1 - 4-связанных остатков a-D-галактуроновой кислоты. В своем составе молекула имеет метоксигруппу, за счет которой, вероятно, отмечается разносторонняя физиологическая активность (иммуномодулирующая, антидотная, антиоксидантная, гастропротективная) [251; 254; 255; 256]. В исследованиях Maas N.C. и соавт. пектин , полученный из цитрусовых, сульфатировали и исследовали АК и АТБ активность. Как и гепарин, сульфат пектина из цитрусовых ингибировал тромбин посредством антитромбина [ 165]. В экспериментах Cipriani T.R. in vitro в качестве антикоагулянта использовали пектин лимона; в экспериментах in vivo соединение обладало антитромботическими свойствами и полностью ингибировало венозный тромбоз [63].
Целлюлоза является самым распространенным, доступным органическим соединением и физиологически близким полисахаридом к организму человека с известной структурой, а также химия которого хорошо изучена. Молекула целлюлозы является линейным гомогликаном, который построен из остатков глюкозы, связанных в положении Р(1— 4). Исходными материалами для синтеза целлюлозы служат различные структурные модификации целлюлозы - хлопковая волокнистая целлюлоза со степенью полимеризации от 1000 и выше или другие порошковые формы целлюлозы, получаемые из хлопка, древесины и другого сырья [34], а в последние годы микрокристаллическая целлюлоза - МКЦ [254]. Для увеличения АК активности в целлюлозу вводят сильные электроотрицательные группы - сульфатные, сульфонатные, фосфатные, ацетатные, карбоксильные, аминные, что предполагает механизм действия, связанный с электростатическим комплексообразованием между белками крови и производным целлюлозы [256].
Fan. L. и соавт. также отметили, что при введении большего количества сульфатных групп в молекулу крахмала, АК активность увеличивалась [91]. Инулин - органическое вещество из группы полисахаридов, полимер D-фруктозы. Подобно крахмалу, инулин служит запасным углеводом, встречается во многих растениях, главным образом семейства сложноцветных, а также колокольчиковых, лилейных, лобелиевых и фиалковых. В медицине инулин используется в медицинских тестах для измерения общего количества внеклеточного объема жидкости и определения функции почек. В фармакологии используется для регидратации и реминерализации при потери воды, в качестве пребиотика. Также есть сведения о снижении уровня сахара в крови и влиянии на липидный обмен [134].
Интересными для изучения антикоагуляционных свойств предстают и олигомеры - лигнины. Флуоресцент-связывающие исследования показали, что низкомолекулярные сульфатированные лигнины способны ингибировать процесс свертывания за счет связывания с антитромбином, подобно гепарину (НФГ) [113]. Помимо этого Henry В. и соавт. определили, что низкомолекулярные лигнины (НМЛ) ингибировали фактор Ха и Х1а, эластазу лейкоцитов человека [114]. Таким образом, сульфатированные лигнины могут стать перспективными материалами, обладающими АК свойствами и конкурирующими соединениями с гепарином.
Антикоагулянтная активность гепарина связана с особенностями строения его молекулы: размер молекулы и наличие сульфатных групп в составе. Активность гепариновых фракций, в которых на дисахаридную структурную единицу приходится четыре сульфатные группы, в 1,5 раза превышает активность фракции гепарина с тремя сульфатными группами [83; 158].
Интенсивность изучения биологической активности фукоиданов значительно опережает исследования их химической структуры. Поэтому имеется немного данных о связи структуры и биологической активности этих полисахаридов. Считается, что модификация ряда растительных полисахаридов {целлюлозы, хитозана (животного происхождения, получают из панциря крабов, криля, креветок и пр.), декстрана (полисахарид бактериального происхождения} путем сульфатирования приводит к появлению у них антикоагулянтных свойств. [221]. Исследования японских ученых показали, что помимо сульфатных групп антикоагулянтная активность полисахаридов во многом зависит от степени разветвленности, типа связи, молекулярно-массового распределения. Размеры молекулы полисахаридов, количество и расположение О-сульфатных или свободных карбоксильных групп, виды моно- или (ди-) сахариды, входящие в состав молекулы полимера, электрические заряды- все это влияет на биологическую активность, в том числе и антикоагулянтную [51; 111; 164; 186].
Таким образом, актуален поиск как новых химических соединений для последующего создания лекарственных средств, обладающих антикоагулянтной активностью, так и поиск возможного антидота к ним. В экспериментах in vitro возможно определить специфическую активность соединений, подобрать антидот, в экспериментах ex vivo - оценить фармакодинамику, определить дозу введения АК и антидота на экспериментальных животных.
Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте тромбинового времени
Для определения механизма действия исследуемых образцов мы провели анализ ингибирования активности фактора Ха или тромбина (Па) по отношению к хромогенным субстратам S 2222 и S 2238, соответственно [234, 265]; в присутствии антитромбина (ингибитора сериновых протеаз свертывающей системы крови) или без антитромбина.
В инкубационных смесях тромбина или фактора Ха с хромогенними субстратами без добавления антитромбина определить концентрации исследованных соединений и НФГ, снижающих оптическую плотность растворов за минуту в 2 раза, в сравнении с контролем, не удалось, так как достоверных изменений с показаниями в контроле без добавления антикоагулянтов (для тромбина А4о5 нм/мин = 0,297 ± 0,022, для фактора Ха А4о5 ш/мин = 0,325 ± 0,021, рис. 12) не наблюдали (в диапазоне концентраций сульфатов полисахаридов от 0,032 до 323 мкг/ мл инкубационной смеси); для НФГ этот диапазон составил 0,026 - 0,26 мкг/мл фактора Ха без добавления антитромбина. В таблице 5 показаны концентрации ( АА 405/ мин, мкг/мл) соединений, при которых скорость гидролиза хромогенных субстратов тромбином или фактором Ха в присутствии антитромбина снижалась в 2 раза, в сравнении с показаниями в контроле (без добавления антикоагулянтов).
Примечание: % АА 40 мин - концентрация соединений, при которой скорость гидролиза хромогенного субстрата снижается в 2 раза, в сравнении с показаниями в контроле (без АК); alia - антитромбиновая активность; в контроле (без АК) изменение оптической плотности с S 2238 за минуту равно 0,296±0,020; аХа - анти Ха активность; в контроле (без АК) изменение оптической плотности с S 2222 за минуту равно 0,326±0,006; - р 0,05 -достоверность различий с показаниями для НФГ; # - для сульфатов целлюлозы; ## - для сульфатов инулина и сульфатов пектина.
Отмечено, что добавление образцов СЦ 615-2, СЦ 676, СЦ 614-1 и СЦ 906 в инкубационную смесь с антитромбином приводило к снижению скорости гидролиза хромогенного субстрата S 2238 в 2 раза (рис 13а), в сравнении с контролем, и ингибированию амидолитической активности тромбина в концентрациях до 22,10±5,40; 11,10±2,70; 3,00±0,70; 2,88±0,69 мкг/мл, соответственно; антитромбиновая активность составила 15,60±1,30; 79,01±19,10; 104,00±9,61; 77,40±9,72 Ед/мг, соответственно (таблица 5).
Добавление образцов СЦ 615-2, СЦ 676, СЦ 614-1 и СЦ 906 в инкубационную смесь с антитромбином приводило и к снижению скорости гидролиза хромогенного субстрата S 2222 в 2 раза, в сравнении с контролем, и к ингибированию амидолитической активности фактора Ха (рис. 13 б) в концентрациях до 68,0±11,0; 25,0±6,1; 1,7±0,4; 7,5±0,2 мкг/мл, соответственно; анти-Ха активность составила 10,30±0,50; 17,90±2,10; 33,50±1,90; 17,40±4,92 Ед/мг, соответственно (таблица 5).
Концентрации 1А АА 405/ мин (мкг/мл) СИ 715-1 при анализе ингибирования амидолитической активности тромбина или фактора Ха в присутствии антитромбина составили 3,10±0,70 и 459,0±36,0 мкг/ мл, соответственно; alia активность достигала 2,51±0,60 ЕД/мг, а аХа - 3,30±0,40 ЕД/мг (таблица 5). Концентрации 1А АА 405/ мин (мкг/мл) СИ 715/2 и СИ 719 при влиянии на гидролиз тромбином хромогенного субстрата были 200 мкг/мг, а их alia активности не достигали и 1 ЕД/мг. При этом диапазон аХа активностей образцов СИ составил 1,40±0,20 - 4,70±0,50 Ед/мг.
Добавление в инкубационную смесь, содержащую антитромбин, сульфатов пектина приводило к снижению скорости гидролиза тромбином или фактором Ха хромогенных субстратов. Концентрации 1А АА 405/ мин (мкг/мл) СПКТ 639-2 и СПКТ 639-1 в реакции с тромбином составили 2,15±0,50 и 1,18±0,21 мкг/мл, соответственно; alia активность достигала 28,71±2,90 и 35,60±4,10 Ед/мг. Концентрации Vi АА 405/ мин (мкг/мл) СПКТ 639-2 и СПКТ 639-1 в реакции с фактором Ха составили 55,0±3,0 и 34,0±4,0 мкг/мл, соответственно; аХа активность достигала 9,80±1,20 и 15,60±1,40 Ед/мг (таблица 5).
При добавлении несульфатированного пектина абиенана оптическая плотность реакционной смеси достоверно не отличалась от таковой в контроле, т.е. без антикоагулянта.
В ходе испытаний было выявлено, что исследуемые соединения увеличивали ингибиторную активность антитромбина по отношению к тромбину и фактору Ха. Без добавления антитромбина снижения скорости гидролиза не наблюдали. Наибольшую alia активность в присутствии антитромбина показала группа СЦ. 3.1.7. Влияние соединений на агрегацию тромбоцитов человека.
Помимо исследований, направленных на изучение влияния соединений на плазменный гемостаз, проводили анализ исследуемых полисахаридов на агрегационную активность тромбоцитов человека при добавлении АДФ в качестве индуктора.
Агрегацию тромбоцитов проводили в богатой тромбоцитами плазме (PRP-плазме) с оптической плотности 0,291-0,388, что соответствовало 271-384 тыс/мкл тромбоцитов (норма 250-400 тыс/мкл [33]).
Добавление индуктора агрегации к смеси плазмы с образцам СЦ 615-2, СЦ 906 в диапазоне плазменных концентраций от 1,28 до 106,4 мкг/мл не вызывало достоверных изменений в сравнении с нулевой точкой (без антикоагулянта) и составило 72,7- 82,7%. Агрегация без индуктора АДФ составила для СЦ 615-2 -0%, а для СЦ 906 - 7,2% , что сопоставимо с результатами для НФГ (Рис 14).
При увеличении плазменных концентраций от 1,28 до 106,4 мкг/мл введение СИ 715-2 и СИ-719 вместе с индуктором АДФ не вызывало достоверных изменений в сравнении с «нулевой» точкой. Степень агрегации тромбоцитов при добавлении СИ-719 с большей степенью сульфатирования была выше (81, 3 -87,9%), но достоверных различий с показаниями СИ 715-2 (71,5 - 75,9%) не фиксировали (Рис 146). При анализе влияния исследуемых соединений самостоятельно индуцировать агрегацию тромбоцитов отмечали, что инулины не влияли на изменение степени агрегации. Образец СПКТ 639-2 самостоятельно индуцировал агрегацию кровяных пластинок до 62,0±0,9% в плазменной концентрации 34 мкг/мл (Рис. 14а). 60 I 40
Помимо того, что исследуемые соединения обладали антикоагулянтной активностью и не влияли на тромбоцитарный гемостаз, важно было подобрать соединение, снижающее их активность, т.е. антидот.
При помощи метода - биоспецифического электрофореза, была продемонстрирована способность связывания и появления пиков преципитации в агарозном геле между сульфатированными полисахаридами и сульфатом протамина или сульфатом хитозана. В таблице 6 и на рисунке 15 продемонстрировано, что при увеличении количества полисахаридов в лунке, увеличивались пики преципитации с СПТ в форме «ракеток».
Проведение горизонтального биоспецифичного электрофореза с поликатионами в геле агарозы
Однако продолжать исследования фармакологической активности СЦ хлопка мы предпочли с образцом СЦ (полученным из хлопка другого производителя) с другими структурными параметрами, другими специфическими активностями и большим отношением активностей alla/aXa. Поэтому для опытов ex vivo нами был выбран образец сульфата целлюлозы хлопка (СЦ 906; ММ 50 кДа, СС 2,4; получен сульфатированием хлопка - ГОСТ 595-79, марка 35, Ферганского химического завода, Узбекистан) с антитромбиновой активностью 88,2±4,7 Ед/мг, аХа - 7,4±1,6 Ед/мг (отношение активностей alla/aXa = 11,9), не влияющий самостоятельно на агрегацию тромбоцитов человека и с возможностью вероятного использования сульфата протамина в качестве антидота. Величина антитромбиновой активности СЦ 906 ( 70 ЕД/мг) соответствует критериям отбора перспективных образцов.
Для изучения влияния СЦ 906 на антикоагулянтную активность плазмы кроликов исследуемое соединение в различных дозах вводили внутривенно в краевую ушную вену. В полученной в разные интервалы времени после введения СЦ плазме кроликов определяли время свертывания в тестах АЧТВ / РеаКлот-Гепарин и рассчитывали alia, аХа активности плазмы при сравнении с НФГ.
Известно, что для контроля за терапией НФГ определяют время свертывания крови, время свертывания плазмы в тесте АЧТВ, активированное время свертывания крови, антитромбиновую и аХа активности плазмы. АЧТВ -наиболее широко используемый тест для определения степени АК действия после введения НФГ в терапевтических дозах [135; 167; 192].
В 1970-ых годах установили необходимый для АК эффекта диапазон АЧТВ (1,5 - 2,5 раза, в сравнении с контролем) для снижения риска рецидивирующих тромбоэмболии у людей [71]. При концентрации гепарина в плазме 0,3 аХа ЕД/мл, среднее время в тесте АЧТВ достигает диапазона 48 - 108 секунд, в зависимости от используемого в лаборатории метода. Терапевтические уровни гепарина (0.3 - 0.7 аХа ЕД/мл) в современных тестах АЧТВ демонстрируют отношения к контролю 1,6 - 2,7 и 3,7 - 6,2 раза [35; 47].
В нашей работе мы заметили достоверное увеличение свертывания плазмы кроликов в тестах АЧТВ и РеаКлот-Гепарин с увеличением дозы СЦ (3, 5 и 7 мг/кг) или НФГ (0,75 и 1 мг/кг) при внутривенном введении. Время действия (по АЧТВ и РеаКлот-Гепарин) при введении НФГ в дозах 0,75 и 1 мг/кг достигало 60 мин и 120 мин, соответственно. Большая продолжительность антикоагулянтного эффекта СЦ 906, в сравнении с НФГ, связана с большими дозами. Для достижения одинакового эффекта по времени свертывания плазмы в тесте АЧТВ (на 15 мин после введения) СЦ 906 потребовалось в 7 раз больше.
Максимальные alia и аХа активности плазмы мы отметили на 5 минуте после введения СЦ 906 и НФГ в кровь, что совпадает с литературными данными при внутривенном введении антикоагулянта прямого действия НФГ [126]. Полное исчезновение alia и аХа активностей плазмы кроликов наблюдали при введении только НФГ в дозах 0,75 и 1 мг/кг через 180 и 120 минут, что совпадает с данными по времени свертывания плазмы в тестах АЧТВ и РеаКлот-Гепарин.
Мы наблюдали закономерно большие антитромбиновые активности плазмы кроликов, в сравнении с аХа активностями после введения СЦ 906 в разных дозах. Это объяснимо, так как удельная alia активность субстанции СЦ 906 больше, чем аХа активность.
Для нейтрализации антикоагулянтного эффекта НФГ в клинической практике используют введение сульфата протамина [230]. Последовательное введение сульфата протамина за сульфатом целлюлозы или за нефракционированным гепарином (в одинаковых дозах) приводило к снижению времени свертывания плазмы кроликов в тестах АЧТВ / РеаКлот-Гепарин и к снижению alia / аХа активностей плазмы. Так, через 15 мин после введения СЦ и СПТ время свертывания плазмы в тесте АЧТВ в зависимости от дозы было в 2,3 - 4,4 раз меньше, чем при введении только СЦ; для НФГ и СПТ эта разница на 15 мин составила 6 и 9 раз, в зависимости от дозы. При анализе плазмы через 15 мин после введения СЦ и СПТ с использование теста РеаКлот-Гепарин время свертывания было ниже в зависимости от дозы в 1,5 - 2,0 раза; для НФГ и СПТ эта разница на 15 мин составила 1,9 и 3,4 раза, в зависимости от дозы. Такой эффект СПТ на НФГ давно известен [179].
При введении НФГ и последующей нейтрализации его эффекта на 15 минуте после введения мы отметили снижение антитромбиновой активности в 10 раз. Последовательное ведение сульфата протамина приводило к снижению alia активности плазмы кроликов после введения СЦ 906 в среднем в 3 раза, в сравнении с результатами без введения антидота.
Введение антидота после введения СЦ 906 или НФГ приводило к снижению и аХа активности плазмы кроликов. Так, на 5-й минуте аХа активность плазмы при введении СЦ 906 и СПТ в дозах 3, 5, 7 мг/кг в среднем снизилась практически в 2 раза, в сравнении с введением только СЦ 906; с исчезновением аХа активности плазмы через 180 мин. При введении СПТ за НФГ аХа активность плвазмы снижалась в 15 раз.
В экспериментах in vitro мы определили, что для нейтрализации антикоагулянтного эффекта СЦ 906, в зависимости от концентрации, может потребоваться добавление сульфата протамина в весовых отношениях к антикоагулянту от 1 до 10. В опытах на экспериментальных животных мы показали, что для нейтрализации антикоагулянтной активности СЦ 906 может быть достаточно использование сульфата протамина и антикоагулянта в одинаковых дозах.
