Введение к работе
Актуальность проблемы
Сульфатированные полисахариды (СП) представляют собой большую и сложную группу макромолекул, которые обладают широким спектром важных биологических свойств. У них обнаружены антигипоксические, противовоспалительные, иммунотропные, противоопухолевые, противовирусные, противомикробные, сорбционные, антикоагулянтные (АК) свойства (Алексеенко и соавт. 2007, Chen et al 2009, Hayashi et al 2008, Kiphuth et al 2009, Li et al 2005, Medeoris 2008). В настоящее время интерес к полисахаридам растительного происхождения, как к соединениям, обладающим низкой токсичностью (Mauray et al 1995), значительно возрос. Если ранее полисахариды, в основном, применялись в качестве вспомогательных компонентов в производстве различных лекарственных форм, то в последние годы их в большей степени рассматривают как биологически активные вещества.
Сульфатированный полисахарид (гликозаминогликан) нефракционированный гепарин (НФГ) - один из широко используемых в клинической практике антикоагулянтов прямого действия, который выделяют из тканей млекопитающих (легкие крупного рогатого скота или слизистая оболочка кишечника свиней) (Hirsch et al 2001, Linhardt et al 2003). АК активность (способность подавлять образование фибрина) НФГ связана с увеличением скорости ингибирования активированных факторов свертывающей системы крови – фактора IIа (тромбин), активированных факторов Х (фактор Х), IX, XI, в основном, посредством активации плазменного ингибитора сериновых протеаз (серпина) – антитромбина (АТ) (Guermazi et al 2009, Izaguirre et al 2009). При активации еще одного серпина - кофактора гепарина II (КГ II), происходит ингибирование только тромбина. НФГ катализирует подавление активности фактора Ха и тромбина в одинаковой степени, то есть соотношение активностей анти-фактор Ха (аХа) к анти-фактор IIa (aIIa) составляет 1 к 1 (Alban et al 2002).
В качестве антитромботических (АТБ) средств, кроме НФГ, в настоящее время применяют ряд полусинтетических низкомолекулярных гепаринов (НМГ) с подобным НФГ механизмом действия, но средним распределением молекулярной массы (ММ) от 4 до 7 кД и отношением аXа/aIIa от 1,5 до 3,8 (Weitz et al 2004), а также синтетические пентасахариды только с аХа активностью – фондапаринукс и идрапаринукс. Интенсивно используют в разработках по поиску АТБ средств и другие СП природного происхождения: фукоиданы, галактаны и сульфаты хитозана, маннанов, галактоманнанов, пектинов (Витязев и соавт. 2010, Дрозд и соавт. 2008, Henry et al 2010, Pittler et al 2005). Известно, что существует корреляция между структурой и АК/АТБ активностями НФГ, НМГ и гепариноподобных соединений (сульфаты дерматана, гепарана, хондроитина, кератана и гиалуроновой кислоты) из тканей млекопитающих (Neha et al 2008). Эту информацию используют для направленного получения соединений с необходимой активностью. Для придания необходимой активности в настоящее время применяют как химическое модифицирование макромолекул нативных соединений, так и технологии синтеза (Brihton 2004, Chaidedgumjorn et al 2002, Dace et l 1997, Franz et al 1995, Gustafsson et al 2004, Nimje 2005).
К синтетическим ингибиторам тромбина и фактора Ха относят такие соединения, как апиксабан, дабигатран, бивалирудин, аргатробан, мелагатран/ксимелагатран, аптамеры (Schulman et al 2007, Scott et al 2011, Weitz et al 2004). В настоящее время научный мир все больше проявляет интерес к аптамерам - олигонуклеотидам (молекулы одноцепочечной ДНК {оцДНК} или РНК), которые специфически связываются с целевой молекулой в наномолярных концентрациях (Bock et al 1992, Buddai et al 2010, Long et al 2008, Wu et al 1992). Неоспоримым преимуществом аптамеров является вероятность подбора высокоспецифичного антидота - аптамера (Dyke et al 2006, Kim et al 2008, Nimjee et al 2006). Так, Rusconi C.P. и соавт. (2004) разработали и РНК аптамер (RB006; pegnivaco) с ингибиторной активностью по отношению к фактору IXa, и его комплементарный антидот - аптамер (RB007; anivamersen) для нейтрализации антикоагулянтной активности.
Таким образом, актуален поиск новых АК средств с разным механизмом действия.
Экспериментальные исследования и анализ новых соединений с разным механизмом АК действия является актуальным для поиска и создания потенциальных фармакологических препаратов. Исследование связи структура - активность сульфатов целлюлозы позволит направленно получить наиболее активные полисахариды. Оценка in vitro АК потенциала ДНК аптамера RA36 позволит определить направления и дозовый диапазон для дальнейшего углубленного доклинического изучения на моделях in vivo.
Цель работы
Исследование влияния ДНК аптамера RA36 (in vitro) и сульфатированной целлюлозы, выделенной из древесины Ppulus trmula, Abies sibirica Ledeb хлопка Gossypium, (in vitro и ex vivo) на фибриногенсвертывающую и амидолитическую активность тромбина, активированного фактора Х и агрегацию тромбоцитов человека.
Задачи исследования
-
Исследовать влияние сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Ppulus trmula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 – 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 – 0,61 на амидолитическую активность тромбина и активированного фактора Х в присутствии и без антитромбина, на время свертывания плазмы человека in vitro в тестах активированное частичное тромбопластиновое время, РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, протромбиновое время, эхитоксовое время и анцистроновое время.
-
Оценить возможность образования комплексов между полианионами сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Ppulus trmula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 – 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 – 0,61 и поликатионом антидотом – сульфатом протамина с помощью биоспецифичного электрофореза, и провести нейтрализацию антитромбиновой активности образцов сульфатов целлюлозы сульфатом протамина в тесте тромбиновое время.
-
Оценить фармакодинамические параметры сульфата целлюлозы, выделенной из хлопка (Gossypium), с молекулярной массой 30-60 кД и степенью сульфатирования 0,8-2,5, при внутривенном введении кроликам в дозах 0.3, 1.0 и 5.0 мг/кг и сульфата целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeb), при подкожном введении в дозах 5, 20, 40 мг/кг; исследовать антитромботическую и геморрагичекую активности сульфатированной целлюлозы из древесины пихты.
-
Исследовать влияние аптамера RA36 на амидолитическую активность тромбина в присутствии и без антитромбина, на время свертывание плазмы/крови человека, кроликов, крыс in vitro в тестах РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, эхитоксовое время, время рекальцификации, время свертывания крови в сравнении с нефракционированным гепарином и рекомбинантным гирудином.
-
Оценить влияние сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Ppulus trmula) и древесины пихты (Abie ssibirica Ledeb), аптамера RA36 на скорость и агрегационную способность тромбоцитов человека, индуцированную аденозиндифосфорной кислотой.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Впервые была исследована АК активность шести образцов сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Ppulus trmula), с ММ 12,7 – 18,9 кД и СЗS 0,54 – 0,61; причем антитромбиновая активность данных СЦ преобладала над анти-фактор Ха активностью. Показана способность протамина сульфата образовывать комплексы с образцами исследуемых сульфатов целлюлозы, а также нейтрализовать их антитромбиновую активность in vitro в тесте ТВ. Впервые проанализировано влияние СЦ из древесины осины на плазму человека in vitro при активации свертывания коагулазами из ядов змей и определены эффективные дозы СЦ, выделенной из хлопка (Gossypium, ММ 30-60 кД, СC 0,8-2,5) и древесины пихты (Abies sibirica Ledeb, ММ 3,6 кД, СС 1,65), при введениях экспериментальным животным. Впервые исследовано АТБ действие сульфата целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeb), с молекулярной массой 3,6 кД и степенью сульфатирования 1,65 при моделировании венозного тромбоза у крыс, а также геморрагическая активность при внутривенном введении крысам.
Впервые частично определен механизм действия синтезированного аптамера RA36 с молекулярной массой 10000, который является антикоагулянтом прямого действия, и оценена АК активность RA36 in vitro в плазмах человека, крыс и кроликов в сравнении с НФГ и рекомбинантным гирудином.
Практическая значимость работы
Экспериментально обоснована возможность конструирования новых АК на основе сульфатов целлюлозы, выделенной из травянистых и древовидных растений для профилактики и лечения тромбозов. Рассчитаны дозы для оценки фармакологической активности аптамера RA36 при введении экспериментальным животным.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Показано, что сульфаты целлюлозы, выделенной из древесины осины (Ppulus trmula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 – 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 – 0,61 катализируют ингибирование антитромбином скорости гидролиза тромбином и активированным фактором Х хромогенных субстратов, увеличивают время образования фибринового сгустка в плазме человека in vitro в коагулологических тестах: активированное частичное тромбопластиновое время, РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, протромбиновое время, эхитоксовое время и анцистроновое время.
-
Показано комплексообразование между полианионами сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Ppulus trmula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 – 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 – 0,61, и используемым в клинической практике антидотом сульфатом протамина, а также исследована in vitro нейтрализация сульфатом протамина антитромбиновой активности сульфатов целлюлозы.
-
Определены зависимость от дозы и время действия сульфата целлюлозы, выделенной из хлопка (Gossypium, ММ 30-60 кД, СC 0,8-2,5), вводимом внутривенно кроликам в дозах 0,3-5 мг/кг, в сравнении с дозой НФГ 5 мг/кг. Выяснено, что сульфат целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeb, ММ 3,6 кД, СС 1,65) как in vitro, так и ex vivo при подкожном введении кроликам, эффективно удлиняет время свертывания плазмы, проявляет антитромботическую активность на модели венозного стаза у крыс и геморрагическую активность.
-
Показано, что аптамер RA36, в отличие от рекомбинантного гирудина, не оказывает влияния на ингибирование скорости гидролиза тромбином хромогенного субстрата как в буфере, так и в плазмах человека, крыс, кроликов; кроме того, исследованный аптамер увеличивает фибриногенолитическую активность плазмы/крови человека, крыс in vitro в тестах РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, эхитоксовое время, время рекальцификации, время свертывания крови, тогда как время свертывания плазмы кроликов при добавлении RA36 возрастает только в тестах время рекальцификации и тромбиновое время.
-
Обнаружено, что сульфаты целлюлозы из древесины осины (Ppulus trmula) и древесины пихты (Abies sibirica Ledeb), а также аптамер RA36 не влияют как на способность тромбоцитов человека агрегировать при индуцировании аденозиндифосфорной кислоты, так и на скорость агрегации.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертации были представлены на Всесоюзных и Международных конференциях, конгрессах, симпозиумах: XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2010, секция «Биология», Москва 2010; 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва 2010; III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» – Нижний Новгород 2010; Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», Москва 2010; Пятая всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), Москва, 2011; Russian-Indian Symposium on Glycosciences, Moscow, Russia, 2011; 10th International conference of the European Chitin Society, St.-Petersburg, Russia, 2011; XXIII Congress of the international Society on Thrombosis and Haemostasis, Kyoto, Japan, 2011; 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 2011; Конгресс гематологов России, Москва, 2012.
Публикации.
Основные положения и результаты работы отражены в 15 научных работах, в том числе: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 11 статей и тезисов, опубликованных в материалах российских и международных конференций и симпозиумов.
Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно выполняла анализ литературы по теме исследования, проводила экспериментальные исследования, получала и анализировала результаты ко всем главам диссертации, интерпретировала, проводила статистическую обработку полученных данных и формулировала выводы. По результатам работы при непосредственном участии автора подготовлены публикации.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы материалы и методы, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 364 источника, из них 22 отечественных, 342 зарубежных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 32 рисунками.
