Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
2. Обзор литературы
2.1. Лекарственные средства для лечения тревожных расстройств 12
2.2. Препараты растительного происхождения в терапии тревожных расстройств 19
3. Материал и методы исследования 33
3.1. Лабазник обыкновенный 33
3.2. Получение экстрактов лабазника обыкновенного 33
3.3. Методы фитохимического исследования биологически активных веществ лабазника обыкновенного 34
3.4. Экспериментальные животные 35
3.5. Поведенческие методы исследования анксиолитического действия экстрактов лабазника обыкновенного 36
3.5.1. Влияние на поведение в приподнятом крестообразном лабиринте... 37
3.5.2. Влияние на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле 38
3.5.3. Влияние на эмоциональную реакцию по методу J. Brady и W. Nauta 39
3.5.4. Влияние на поведение в условиях конфликтной ситуации 42
3.6. Оценка противосу дорожного действия при судорожных состояниях, вызванных бикукуллином и тиосемикарбазидом 43
3.7. Модели экспериментальной энцефалопатии 44
3.7.1. Экспериментальная постгипоксическая энцефалопатия
3.7.2. Экспериментальная энцефалопатия, вызванная нарушением Р-окисления жирных кислот 44
3.8. Исследование функционального состояния митохондрий головного мозга 45
3.8.1. Получение гомогената головного мозга 45
3.8.2. Полярографическая регистрация дыхания митохондрий 45
3.9. Изучение процессов липопероксидации в гомогенате головного мозга 47
3.9.1. Определение скорости образования малонового диальдегида 47
3.9.2. Получение липидного экстракта 48
3.9.3. Определение диеновых конъюгатов и оснований Шиффа 49
ЗЛО. Статистическая обработка результатов 49
4. Результаты исследования 50
4.1. Влияние водного, 40, 70 и 95% водно-этанольных экстрактов лабазника обыкновенного на поведение мышей при моделях тревоги 50
4.2. Токсичность водного экстракта лабазника обыкновенного и влияние его в различных дозах на поведение мышей при моделях тревоги 57
4.3. Противотревожное действие фракций водного экстракта лабазника обыкновенного и их фитохимический состав 62
4.4. Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на поведение животных в конфликтной ситуации 67
4.5. Противосудорожное действие водного экстракта лабазника обыкновенного при судорожных состояниях, вызванных бикукуллином и тиосемикарбазидом 69
4.6. Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на биоэнергетику и перекисное окисление липидов головного мозга крыс при постгипоксической энцефалопатии 73
4.7. Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на биоэнергетику и перекисное окисление липидов головного мозга крыс при экспериментальной энцефалопатии, вызванной 4-пентеноевой кислотой 82
5. Обсуждение результатов исследования 93
Выводы 105
Список литературы
- Препараты растительного происхождения в терапии тревожных расстройств
- Поведенческие методы исследования анксиолитического действия экстрактов лабазника обыкновенного
- Исследование функционального состояния митохондрий головного мозга
- Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на поведение животных в конфликтной ситуации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Многоплановые и интенсивные нагрузки, испытываемые современным человеком, сопряжены с высоким уровнем психоэмоционального напряжения и риском развития пограничных психопатологических состояний. В популяционных исследованиях синдромально очерченные тревожные расстройства диагностируются у 6,5% населения (Kessler R. et al., 2002), а в течение жизни - у 25-50% (Воробьева О.В., 2006; Strine Т. et al., 2005). Отдельные симптомы тревоги или субсиндромальные тревожные расстройства проявляются свыше, чем у 70% населения (Рачин А.П., 2004; Sansone R. et al., 2003).
Тревожные расстройства встречаются как в рамках нарушений психической деятельности, так и входят в структуру многих соматических и неврологических заболеваний. Они являются одним из самых распространенных психопатологических состояний у пациентов соматической сети (Акарачкова Е.С. и соавт., 2007; Медведев В.Э., 2007). Медико-социальные исследования показывают, что повышенная тревожность увеличивает вероятность инфаркта миокарда в 2,3 раза и внезапной смерти в 4,5 раза. Треть от всех затрат на лечение психических заболеваний приходится на лечение тревоги (Воробьева О.В., 2006; Zwanzger P. et al., 2007).
Тревожные расстройства являются пограничным состоянием системы психической адаптации и характеризуются обратимостью изменений в интегративной деятельности, прежде всего, нарушаются поиск, восприятие, переработка информации и эмоциональное реагирование (Александровский Ю.А., 2007). В развитии тревожных расстройств значительную роль играет дефицит энергетического обеспечения психофизиологических процессов (Александров Ю.И., 2003).
Известен широкий спектр лекарственных средств - анксиолитиков, ослабляющих не только психические проявления тревоги, но и процесс ее соматизации. Наиболее популярны анксиолитики бензодиазепиновой структуры (Fricchione G., 2004; Rouillon F., 2004). Они оказывают выраженное противотревожное действие - уменьшают тревогу, беспокойство, повышают резистентность к стрессогенным факторам, но не лишены побочных эффектов - вызывают дневную сонливость, нарушение когнитивных процессов, формирование лекарственной зависимости (Fassaert Т. et al., 2007; Barbui С. et al., 2011). Перечисленные побочные эффекты ограничивают применение синтетических анксиолитиков, так как они нарушают важные функции высшей нервной деятельности и снижают качество жизни пациентов. Кроме того, столь активные лекарственные средства, как бензодиазепиновые анксиолитики, в основном рекомендуются больным с клинически очерченными синдромами тревожного расстройства.
В настоящее время в психофармакологии приоритетное значение придается безопасности лечения, акцентируется внимание на важности сопоставления клинической эффективности (польза лечения) и нежелательного, побочного действия (риск лечения). Отсутствие безопасных анксиолитиков, не оказывающих побочных эффектов, делает актуальным разработку и внедрение во врачебную практику новых препаратов с противотревожным действием (Штрыголь СЮ. и соавт., 2005).
С целью коррекции легких субсиндромальных и вегетативных проявлений тревоги успешно используют лекарственные средства растительного происхождения (Медведев В.Э., 2007; Sarris J., 2007; Khanum F. et al., 2010). В клинической практике применяют препараты валерианы, пустырника, шлемника байкальского и другие растительные средства для уменьшения внутреннего беспокойства, страха и тревоги. По данным ВОЗ предпочтение лекарственным средствам растительного происхождения отдают 80% населения планеты, при этом доверие пациента к лекарству - важный фактор, способствующий успеху лечения (Ушкалова А.В. и соавт., 2007; Werneke U., 2009).
Перспективным растением является лабазник обыкновенный (Filipendula vulgaris, сем. Rosaceae). Водный экстракт надземной части лабазника обыкновенного обладает антиоксидантным, противогипоксическим и ноотропным действием (Шилова И.В. и соавт., 2010). Представляется актуальным изучить в эксперименте противо-тревожные эффекты экстракта лабазника обыкновенного и его влияние на биоэнергетику головного мозга при моделях тревоги и энцефалопатии.
Цель работы. Изучение влияния экстрактов лабазника обыкновенного и фракций наиболее активного экстракта на поведение животных при моделях тревоги и на биоэнергетику головного мозга при экспериментальной энцефалопатии.
Задачи исследования.
-
Изучить влияние водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение животных при моделях тревоги.
-
Исследовать фитохимический состав экстракта лабазника обыкновенного, обладающего наибольшим противотревожным действием. Определить группы биологически активных веществ экстракта лабазника обыкновенного, отвечающие за про-тивотревожный эффект.
-
Исследовать противосудорожное влияние водного экстракта лабазника обыкновенного при экспериментальных судорожных состояниях, вызванных нейро-токсинами бикукуллином и тиосемикарбазидом.
-
Изучить влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на функциональное состояние системы митохондриальной энергопродукции и перекисное окисление липидов в головном мозге при экспериментальной энцефалопатии, вызванной
гипоксической травмой и нарушением Р-окисления средне- и длинноцепочечных жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой).
Научная новизна.
Впервые изучено влияние водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение животных при моделях тревоги. Установлено, что водный экстракт лабазника в дозе 50 мг/кг обладает максимальной про-тивотревожной активностью при стрессе новизны, снижает эмоциональную реакцию на внешние раздражители и уровень агрессии при попадании животных в конфликтную ситуацию. В составе водного экстракта лабазника обыкновенного наиболее полную сумму веществ фенольной природы содержит этилацетатная фракция, она оказывает более выраженный противотревожный эффект при моделях тревожных состояний по сравнению с действием бутанольной фракции и водного остатка. Впервые показано, что водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели митохондриального дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирования, снижает интенсивность процессов липопероксидации при энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением р-окисления жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой). Энерготропное действие водного экстракта лабазника обыкновенного сопровождается активацией быстрого пути поставки восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь митохондрий головного мозга.
Практическая значимость работы.
Водный экстракт лабазника обыкновенного оказывает выраженное противотре-вожное действие при моделях тревожных состояний в эксперименте. В отличие от экстракта валерианы водный экстракт лабазника обыкновенного не угнетает исследовательскую активность животных. Водный экстракт лабазника обыкновенного улучшает биоэнергетический метаболизм головного мозга при моделях постгипоксиче-ской и токсической энцефалопатии. Установленные особенности механизма противо-тревожного действия и выраженный положительный энерготропный эффект обосновывают необходимость углубленного доклинического исследования водного экстракта лабазника обыкновенного для создания фитоанксиолитика, эффективного при невротических и тревожных расстройствах, сопряженных с нарушениями биоэнергетики головного мозга.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. При моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, «открытое поле», тест эмоциональной реакции) наибольшее противотревожное действие оказывают водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного. Основными компонентами водного экстракта надземной части лабазника обыкновенного,
оказывающими противотревожное действие, являются простые фенолы, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые и тритерпеновые кислоты.
-
Водный экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг повышает эффективность ориентировочно-исследовательского поведения, увеличивает двигательную активность животных в условиях стресса новизны, снижает проявления агрессии при воздействии внешних раздражителей, повышает стрессоустойчивость в конфликтной ситуации.
-
При моделях энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением Р-окисления жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой), водный экстракт лабазника обыкновенного проявляет более выраженные энерготропные и ан-тиоксидантные свойства по сравнению с действием экстракта валерианы. В механизме противотревожного действия этих растений участвуют антиоксидантныи эффект и восстановление регуляции энергетического обмена в головном мозге.
Апробация работы. Материалы работы обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета и лаборатории физиологии, молекулярной и клинической фармакологии НИИ фармакологии СО РАМН (2008-2011), научно-практической конференции «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009), Российском XI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), симпозиуме «Фармакологическая регуляция энергетического обмена» (Томск, 2010), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010), Российском XII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2011), региональном семинаре «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (Томск, 2011), конкурсе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2011). Материалы диссертации опубликованы в 10 научных статьях и материалах конференций, в том числе 5 статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатской диссертации.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, характеризующей результаты экспериментальных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 125 страницах, иллюстрирована 20 таблицами, 6 рисунками и схемой. Библиография включает 182 источника, из них 99 - зарубежных.
Препараты растительного происхождения в терапии тревожных расстройств
Биологически активные вещества экстракта корня валерианы метабо-лизируются системой цитохрома Р-450, но практически не взаимодействуют с лекарственными средствами, окисляемыми изоферментами цитохрома Р-450 [124].
Препараты валерианы назначают в качестве нейропротективных, ноо-тропных, анксиолитических, седативных средств. Они облегчают засыпание, удлиняют сон, улучшают его качество, потенцируют действие снотворных, антипсихотических средств и анксиолитиков. Клиническое значение имеет также влияние валерианы на сердечно-сосудистую систему. Она усиливает сердечные сокращения, препятствует тахикардии, обладает противоаритми-ческими свойствами, расширяет коронарные сосуды и улучшает кровоснабжение сердца, снижает артериальное давление, оказывая миотропное спазмолитическое влияние на артериолы. Препараты валерианы показаны при кар-дионеврозе, экстрасистолии, пароксизмальной тахикардии, стенокардии, пограничной артериальной гипертензии, климактерических расстройствах, заболеваниях органов пищеварения, сопровождающихся спастической болью.
Клинические исследования демонстрируют эффективность экстракта валерианы при органических расстройствах сна [111, 114]. В рандомизированных, двойных слепых, плацебо-контролируемых и многоцентровых исследованиях, выполненных на 186 пациентах, изучали эффекты 600 мг водно-спиртового экстракта валерианы (соответствует 2,7 г сухой растительной субстанции). Качество сна пациентов значимо улучшалось через 2, 4 и 6 нед лечения. У 30,4% испытуемых, получавших экстракт валерианы, увеличивалась продолжительность сна, появлялось чувство отдыха после сна, проходило чувство нервно-психического истощения вечером [114].
Настой корня и корневища валерианы готовят из расчета 6-10 г на 200 мл воды, принимают по 1-2 столовых ложки 3-4 раза в день. Дозу увеличивают в то время суток, когда больной испытывает наибольшее волнение. Се-дативное действие валерианы появляется через 15-20 мин, длительность курса терапии - 10 дней. Препараты валерианы не кумулируют [66]. Валериана входит в состав следующих комбинированных седативных средств: Валокормид (настойки валерианы, ландыша, красавки, натрия бромид, ментол); Валокордин, корвалол (этиловый эфир а-бромизовалериановой кислоты, фенобарбитал, масло мяты перечной); Дормиплант (экстракты валерианы и мелиссы); Ново-пассит (экстракты валерианы, боярышника, зверобоя, хмеля, пассифлоры и других растений); Персен (экстракты валерианы, мелиссы лекарственной и мяты перечной). Валериану следует применять с осторожностью лицам с физической зависимостью из-за риска развития синдрома отмены, сходного с синдромом отмены бензодиазепинов. Рекомендуется воздерживаться от употребления валерианы накануне хирургического вмешательства, при беременности, лактации, детям до 12 лет. Существуют сведения о гепатотоксичности этого растения [81].
Одним из наиболее эффективных растительных седативных препаратов является пассифлора инкарнатная. Трава растения содержит индольные алкалоиды (гарман, гармин, гармол, способные ингибировать МАО), флаво-ноиды (витексин, изовитексин, апигенин, лютеолин), кумарины, хиноны. Механизм седативного действия экстракта надземной части пассифлоры реализуется через ГАМК-ергическую систему, включая активацию рецепторов ГАМКА и одновременную блокаду рецепторов ГАМКВ [144].
Рецепторы ГАМКв локализованы в центральной и периферической нервной системе, относятся к метаботропным и связаны с тримерным G-белком. Состоят из двух субъединиц типа В і и В2 и представляют аллостери-чески регулируемые гетеро димеры. Рецепторы повышают продукцию цАМФ. Пресинаптические рецепторы ГАМКВ участвуют в высвобождении нейромедиаторов. Постсинаптические рецепторы отвечают за долговремен 26 ную потенциацию сигнала. Активация рецепторов ГАМКВ повышает выход ионов калия из нейронов и вызывает гиперполяризацию клеточной мембраны, секрецию мозгового нейротрофического фактора (BDNF), участвующего в нейрогенезе и обеспечении синаптической пластичности. Фармакологические эффекты агонистов зависят от композиции субъединиц рецепторов ГАМКв и могут включать снижение болевой чувствительности, ослабление лекарственной зависимости (в том числе зависимости от алкоголя), уменьшение спастичности скелетной мускулатуры и тревоги [51, 89, 105, 173].
Водно-этанольный экстракт надземной части пассифлоры в дозе 10 мг/кг, а также соединения бензофлавоновой природы, выделенные из растения, оказывают выраженное противотревожное действие на мышей при модели тревоги в приподнятом крестообразном лабиринте [87, 107, 108, 109].
Пассифлора уменьшает беспокойство и напряжение, улучшает сон, обладает противосудорожными свойствами. Ее назначают больным с неврастеническими жалобами и нарушениями на фоне заболеваний нервной системы (атеросклероз, артериальная гипертензия, состояния после церебральных сосудистых кризов, посттравматическая энцефалопатия, постгриппозные энцефалиты и арахноидиты). Экстракт пассифлоры применяют для лечения алкоголизма, так как он ослабляет влечение к алкоголю, уменьшает экзальтацию и нормализует поведение.
В рандомизированных, двойных, плацебо-контролируемых клинических исследованиях установлено противотревожное действие экстракта пассифлоры на пациентов с генерализованным тревожным расстройством. Лечебный эффект пассифлоры развивается более медленно, чем действие препарата сравнения оксазепама, но со значительно меньшим угнетением когнитивных функций [130, 152].
Экстракт пассифлоры входит в состав комбинированного седативного препарата Ново-пассит.
Седативные свойства выявлены у ряда растений семейства губоцветные (яснотоковые) - пустырника, шлемника, мелиссы, душицы, мяты. В качестве седативного средства широко используют траву пустырника сердечного (обыкновенного) и пустырника пятилопастного. В надземной части растений содержатся алкалоиды (леонурин, леонуринин, стахидрин), флавоноиды (кверцетин, рутин, квинквелозид, гиперозид, космосиин), ири-доиды (аюгол, аюгозид, галиридозид), холин, ситостерин, сапонины, дубильные вещества, сахаристые и горькие вещества, витамины А и С, эфирное масло (до 0,03%), каротин, л-кумаровая кислота [116, 141].
Препараты пустырника успокаивают ЦНС, улучшают сон, уменьшают одышку, повышают мочеотделение, устраняют отеки. Седативное действие травы пустырника сравнимо с эффектами валерианы, пустырник может оказаться эффективнее валерианы при неврозе сердца. Пустырник препятствует развитию аритмии, снижает частоту сердечных сокращений и увеличивает их силу, обладает сосудорасширяющим и гипотензивным действием [96, 112, 131,132,181].
Препараты на основе пустырника назначают при тревожных состояниях, тиреотоксикозе, кардионеврозе, миокардите, стенокардии, на ранних стадиях артериальной гипертензии. Настой травы пустырника готовят из 15 г травы на 200 мл воды, принимают по 1 столовой ложке 3-4 раза в день [39].
Недавние клинические эксперименты с участием больных артериальной гипертензией 1 и 2 стадий, сопровождающейся тревожными расстрой-ствомами и нарушением сна, показали, что масляный экстракт травы пустырника сердечного значительно улучшает психо-эмоциональное состояние и снижает артериальное давление [112].
Поведенческие методы исследования анксиолитического действия экстрактов лабазника обыкновенного
Для оценки фармакологического действия получали экстракты из надземной части лабазника обыкновенного, собранного в период цветения в июле 2009 г. в экологически чистом регионе Томской области. Измельченное воздушно-сухое сырье настаивали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин при 80С. В качестве экстрагентов использовали воду очищенную и водно-спиртовые растворы с содержанием этанола 40, 70 и 95%. Экстракцию проводили трехкратно при соотношении сырья и экстра-гента 1:15. Данный способ экстракции обеспечивает наиболее полное истощение растительного сырья при сохранении нативных биологически активных веществ (БАВ) [80]. Полученные порции объединяли, воду удаляли при температуре не выше 60С. Выходы экстрактов, полученных экстракцией водой очищенной, 40, 70 и 95% водно-этанольными растворами, составили 27,5; 27,1; 24,4 и 12,9% соответственно от массы исходного сырья.
Для выявления действующих групп БАВ водный экстракт лабазника обыкновенного растворяли в воде в соотношении 1:2 и обрабатывали последовательно этилацетатом (4x100 мл) и бутанолом-1, насыщенным водой (5 х 100 мл). Таким образом, получали этилацетатную, бутанольную фракции и водный остаток с выходами 1,0, 6,0 и 93,0% соответственно от массы исходного экстракта. Полученные фракции упаривали под вакуумом при температуре не выше 60С и подвергали химико-фармакологическому исследованию.
Стандартизацию надземной части лабазника обыкновенного проводили по суммарному содержанию флавоноидов (1,7±0,1%) с использованием метода дифференциальной спектрометрии [49].
БАБ лабазника обыкновенного исследовали с помощью общепринятых методов фитохимического анализа, используя качественные химические реакции и молекулярную адсорбционную спектроскопию [79].
Для обнаружения флавоноидов использовали следующие реакции: - цианидиновую пробу Дж. Синода и ее модификацию по К. Бриан-ту: после проведения цианидиновой пробы реакционную смесь разбавляли равным количеством октанола и после разделения фаз оценивали окраску. Окрашивание октанольного слоя указывало на агликоновую природу исследуемого вещества, водного слоя - на гликозидную форму соединения; - реакцию с 5% раствором алюминия хлорида в 95% этаноле; - реакцию с борно-лимонным реактивом. Дубильные вещества и их групповую принадлежность выявляли следующими реакциями с: -1% раствором желатина; - 1% раствором железоаммонийных квасцов; - формальдегидом и хлористоводородной кислотой. Антраценпроизводные определяли с использованием: - реакции Борнтрегера; -реакции с 1% раствором магния ацетата в 95% этаноле. Сапонины идентифицировали: - гемолитической пробой; - по способности к пенообрзованию; - в реакции Либермана-Бурхарда; - в реакции с 25% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты в 95% этаноле; - в реакции с концентрированной серной кислотой. Алкалоиды обнаруживали с помощью реакций с общеосадительными реактивами Шейблера, Зонненштейна, Драгендорфа, Вагнера, Бушарда и раствором пикриновой кислоты. Для обнаружения иридоидов применяли реактив Трим-Хилла. Аминокислоты определяли по реакции со свежеприготовленным 0,2% раствором нингидрина в 95% этаноле.
Анксиолитические и противосудорожные свойства экстрактов лабазника обыкновенного оценивали в экспериментах на 300 белых аутбредных мышах обоего пола массой 20-25 г. Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на энергетический метаболизм головного мозга исследовали в экспериментах на 60 белых аутбредных крысах-самцах массой 200-220 г. Животных получали из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется); содержали в стандартных условиях в пластиковых клетках по 10 особей при 12-часовом цикле день/ночь, свободном доступе к воде и без ограничения в приеме пищи. Все экспериментальные процедуры и введение препаратов осуществляли в одинаковое время суток, в 10-15 ч, чтобы избежать варьирования результатов, вызванных суточными колебаниями метаболизма. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» [58].
Для исследования анксиолитического действия фитопрепаратов мышам вводили в желудок экстракты лабазника обыкновенного (дозы соответствуют выходу экстрактов от массы сырья, дозы фракций - от массы экстракта) (схема) или препарат сравнения - экстракт корня валерианы (Даль-химфарм, Россия) в дозе 50 мг/кг [178]. Экстракты растворяли в воде очищенной.
Схема Исследование влияния экстрактов лабазника обыкновенного на поведение мышей при моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, открытое поле, тест эмоциональной реакции) водный (мг/кг) водно-этанольные этилацетатная бутанольная водный остаток 40% 70% 95% (0,5 мг/кг) (3 мг/кг) (46,5 мг/кг) (49 мг/кг) (44 мг/кг) (24 мг/кг) фракции Во всех поведенческих методиках введение фитопрепаратов начинали за 4 дня до исследования, в 4-й день - за 1 ч до исследования. Мыши контрольной группы получали эквиобъемное количество воды очищенной. Компоненты поведения регистрировали с 10 до 14 ч, в тот период суток, когда активность животных достаточно выражена и значимо не изменяется.
Анксиолитические эффекты оценивали по поведению животных в приподнятом крестообразном лабиринте [97]. Лабиринт состоял из 4-х рука-вов с размерами в горизонтальной проекции 6,5x30 см . Рукава, соединенные в виде креста перпендикулярно друг к другу, образовывали в центре площад-ку размером 6,5x6,5 см (рис. 2). Пол лабиринта был выполнен из прозрачного оргстекла. Два рукава, расположенные напротив друг друга, открыты, два других с трех сторон (кроме торцевой стороны, обращенной к центру) огорожены стенками высотой 6,5 см и крышкой. Лабиринт размещался на высоте 1 м от пола на стойке. Мышь помещали на центральную площадку, после чего в течение 5 мин подсчитывали количество заходов в закрытые рукава лабиринта, выходов в открытые рукава, суммарное время пребывания в закрытых и открытых рукавах.
Влияние на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение изучали в тесте «открытое поле» [13, 83, 159]. Экспериментальная установка «открытое поле» представляла собой камеру размером 40x40x20 см3 с квадратным полом и стенками белого цвета (рис. 3). Ее пол, разделенный на 16 квадратов, имел в каждом квадрате круглое отверстие диаметром 3 см. Сверху камеру освещали электрической лампой накаливания мощностью 100 вт, расположенной на высоте 1 м от пола. Мышь помещали в один из углов камеры и в течение 3 мин, раздельно в первую и две последующие минуты, регистрировали количество перемещений с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество обследований отверстий (норковый рефлекс), количество умываний (груминг) и количество актов дефекации (по количеству фекальных болюсов). Вычисляли коэффициент асимметрии поведения в процентах, как отношение количества горизонтальных перемещений к общей двигательной активности.
Исследование функционального состояния митохондрий головного мозга
Для установления БАВ водного экстракта лабазника обыкновенного, отвечающих за противотревожный эффект, было проведено его фракционирование с помощью жидкость-жидкостной экстракции. Полученные этилаце-татную, бутанольную фракции и водный остаток изучали химико-фармакологическими методами. Распределение групп БАВ, установленных методами фитохимического анализа, по фракциям представленно в таблице 9. В результате качественного анализа в надземной части растения не выявлены антраценопроизводные соединения, алкалоиды, иридоиды.
С целью стандартизации сырья в надземной части лабазника обыкновенного количественно было определено суммарное содержание флавонои-дов, которое в пересчете на кверцетин составило 1,7±0,1%. Таблица 9 Химический состав фракций водного экстракта надземной части лабазника обыкновенного
Этилацетатная фракция Бутанольная фракция Водный остаток простые фенолы, простые фенолы, дубильные вещества, флавоноиды, флавоноиды, тритерпеновые кумарины, фенолкарбоновые сапонины, фенолкарбоновые кислоты, водорастворимые кислоты, тритерпеновые сапонины, полисахариды, тритерпеновые дубильные вещества, углеводы, кислоты, углеводы, аминокислоты. тритерпеновые сапонины. аминокислоты. Фармакологическое действие фракций водного экстракта лабазника обыкновенного оценивали этологическими методами в сравнении с эффектами суммарного водного экстракта в дозе 50 мг/кг. Этилацетатную, бутаноль-ную фракции и водный остаток вводили в дозах, пропорциональных их содержанию в суммарном экстракте, - 0,5; 3 и 46,5 мг/кг соответственно. В этих экспериментах водный экстракт лабазника в дозе 50 мг/кг обыкновенного уменьшал количество выходов мышей в открытые рукава приподнятого крестообразного лабиринта более чем в 4 раза, но при этом увеличивал время нахождения в центре лабиринта на 24% и количество выходов в центр на 22% по сравнению с данными показателями в контроле (табл. 10). Мыши, получавшие этилацетатную и бутанольную фракции, находились в центральной части лабиринта на 26-29% длительнее, чем животные контрольной группы. Этилацетатная фракция максимально снижала время нахождения в закрытых рукавах (на 8%, р 0,05) и увеличивала время нахождения в открытых рукавах лабиринта (на 32%). Водный остаток значимо снижал только показатели выхода в открытые рукава и пребывания в них. Таблица 10 Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного и его фракций на поведение мышей в приподнятом крестообразном лабиринте (X±Sx; п=10)
Различия статистически значимы при р 0,05 по сравнению с показателями: 1 - контрольных животных, 2 - животных, получавших водный экстракт лабазника обыкновенного.
Таким образом, наибольшие снижение уровня тревоги и увеличение эффективности эксплоративного поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте регистрировались при введении этилацетатной фракции водного экстракта лабазника обыкновенного.
Изучение в «открытом поле» ориентировочно-исследовательского поведения мышей, получавших исследуемые фитопрепараты, показало, что в первую минуту эксперимента водный экстракт лабазника обыкновенного в наибольшей степени, на 22%, снижал общую двигательную активность (табл. 11). При этом на 26% уменьшалось число горизонтальных перемещений, более чем вдвое снижалась вертикальная активность, коэффициент асимметрии поведения значимо не изменялся по сравнению с показателями в контроле. После введения этилацетатной и бутанольной фракций суммарная двигательная активность уменьшалась на 12,6%) и 14,5%), количество вертикальных стоек становилось в 5,7 и 2,4 раза соответственно меньше, чем в контроле. Только у мышей, получавших этилацетатную фракцию водного экстракта лабазника обыкновенного, коэффициент асимметрии поведения возрастал на 7,6% (р 0,05). Водный остаток не оказывал значимого влияния на показатели локомоторной активности животных во время их нахождения в «открытом поле» в первую минуту эксперимента.
В последующие минуты нахождения в «открытом поле» у животных, получавших как водный экстракт лабазника обыкновенного, так и его фракции, суммарная двигательная активность снижалась по сравнению с активностью в контроле (табл. 11). Максимально (на 30% ) этот показатель уменьшался у мышей, получавших этилацетатную фракцию. Во всех экспериментальных группах общая двигательная активность тормозилась за счет снижения количества горизонтальных перемещений и угнетения норкового рефлекса; коэффициент асимметрии поведения при этом значимо не изменялся, но возникала тенденция к его увеличению у мышей, получавших водный экстракт, этилацетатную и бутанольную фракции.
Таким образом, фракции водного экстракта лабазника обыкновенного оказывают неодинаковое действие при моделях тревоги. Лучше всего поведение мышей в условиях экспериментального тревожного расстройства нормализуют фракции, содержащие наиболее полную сумму фенольных БАВ. По показателям поведения в приподнятом крестообразном лабиринте и «открытом поле» максимальную противотревожную активность проявляет этил-ацетатная фракция, содержащая простые фенолы, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые и тритерпеновые кислоты.
Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на поведение животных в конфликтной ситуации
На функциональном уровне нарушаются специфические для нервной ткани энергозависимые функции - реполяризация, синаптогенез, хранение и передача поступающей информации, поддержание пространственной функциональной архитектоники мозга, образование функциональных ансамблей нейронов. Эти изменения обусловлены подавлением аэробного синтеза энергии и дефицитом АТФ. Уменьшение внутриклеточного содержания АТФ всего на 15-20% приводит к подавлению импульсной активности. При снижении уровня АТФ на 30% она полностью прекращается. Аналогичная зависимость свойственна и для других энергозависимых реакций, в том числе синтетических процессов [37].
Нарушения биоэнергетики головного мозга крыс при постгипоксиче-ской энцефалопатии характеризуются активацией быстрого пути доставки восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь при умеренной степени нагрузки на митохондрии и сохранении их способности синтезировать АТФ (табл. 15, 16). Снижаются коэффициенты АДФ/О, СД и ДК, функционирование системы митохондриальной энергопродукции переходит в фазу резистентности [31]. Значительно активируются процессы ПОЛ (табл. 17).
Водный экстракт лабазника обыкновенного улучшает кинетику мито-хондриального дыхания, увеличивает сопряженность окислительного фосфо-рилирования, предотвращает активацию липопероксидации. Снижается вклад быстрого окисления сукцината в НАД-зависимое дыхание, что препятствует переходу системы энергопродукции в состояние истощения (табл. 15, 16, 17). Митохондрии головного мозга крыс, подвергнутых гипоксии, продолжают функционировать в фазе резистентности. Это позволяет, удовлетворять энергетические запросы нейронов.
Более тяжелая энцефалопатия развивается при интоксикации 4-ПК. Одним из преобладающих патологических процессов при этом является ин-гибирование Р-окисления длинно- и среднецепочечных жирных кислот, обеспечивающего свыше 50% энергии в клетках. При дефиците р-окисления снижается пул макроэргов, что влечет накопление ионов кальция и рост проницаемости митохондриальной мембраны для этих ионов с последующим повреждением ионных насосов. В результате нарушения транспорта и депонирования ионов кальция активируется митохондриальная фосфолипаза А2, нарушающая перенос электронов в субмитохондриальных частицах между флавопротеином НАД«Н-дегидрогеназы и коэнзимом Q (I пункт), а также между цитохромами Ъ и с і [63, 93].
Жирные кислоты блокируют в митохондриях нейронов головного мозга пируватдегидрогеназный комплекс (тормозится превращение пирувата в ацетилкоэнзим А), ингибируют цитратсинтетазу и глутаматдегидрогеназу с развитием энергетического дефицита и лактат-пируватного ацидоза [160, 161]. Митохондрии набухают, содержат матрикс с низкой электронной плотностью, утолщенные мембраны, деформированные кристы.
В головном мозге крыс после инъекций 4-ПК увеличивается количество нейронов с локальным, тотальным хроматолизом и гиперхроматозом, про-лиферирует нейроглия, возникает спазм капилляров микроциркуляторного русла [43].
На фоне токсической энцефалопатии, вызванной 4-ПК, значительно снижаются дыхательная активность митохондрий головного мозга и сопряженность окислительного фосфорилирования (табл. 18, 19). Регистрируется выраженное торможение СДГ, что свидетельствует о деэнергизованном состоянии митохондрий и истощении адаптационного потенциала системы митохондриальной энергопродукции [31]. При этом значительно возрастает интенсивность ПОЛ в головном мозге (табл. 20), снижается поведенческая активность животных.
Введение крысам водного экстракта лабазника повышает скорости ми-тохондриального дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирова-ния. Увеличивается вклад СДГ в НАД-зависимое дыхание, что компенсирует энергетический дефицит в нейронах, повышает уровень энергизованности митохондрий [31]. Экстракт лабазника обыкновенного оказывает выраженное антиоксидантное действие (табл. 17, 20).
При обеих моделях энцефалопатии водный экстракт лабазника обыкновенного проявляет более выраженные энерготропные и антиоксидантные свойства по сравнению с действием экстракта валерианы. Полученные данные указывают на то, что в механизме противотревожного действия этих растений участвуют антиоксидантный эффект и восстановление регуляции энергетического обмена в клетках головного мозга.
Таким образом, среди изученных водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного водный экстракт обладает наибольшей противотревожной активностью. За анксиолитические свойства отвечают главным образом фенольные БАВ, которые максимально переходят в этилацетатную фракцию водного экстракта. При постгипоксической и токсической энцефалопатии водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели митохондриального дыхания, сопряженность окислительного фосфорилирования, снижает интенсивность ПОЛ в головном мозге животных. Антиоксидантный эффект и восстановление биоэнергетики головного мозга участвуют в механизме противотревожного действия экстракта лабазника. По противотревожному, энерготропному и антиоксидантному эффекту водный экстракт лабазника обыкновенного превосходит действие препарата сравнения - экстракта валерианы. В механизме противотревожно го эффекта водного экстракта лабазника обыкновенного не участвует влияние на ГАМК-ергическую систему торможения в головном мозге.
![Влияние гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена на биоэнергетику головного мозга при нарушении [В]-окисления жирных кислот](/i/i/4422/313245.png "Влияние гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена на биоэнергетику головного мозга при нарушении [В]-окисления жирных кислот Слепичев Владимир Анатольевич")
