Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Проблема стафилококковых инфекций 10
1.2. Классификация и краткая характеристика бактерий рода cтафилококк 11
1.3. Колонизация покровов макроорганизма золотистым стафилококком 13
1.4. Проникновение стафилококка через барьеры кожи и слизистых оболочек 16
1.5. Защитная реакция макроорганизма НА S. AUREUS 18
1.5.1. Развитие воспаления в ответ на проникновение S. aureus 18
1.5.2. Значение нейтрофилов в защите от стафилококковой инфекции 20
1.5.3. Значение гуморального иммунитета в защите от стафилококковой инфекции 23
1.5.3.1. Значение иммуноглобулинов в защите от стафилококковой
инфекции 23
1.5.3.2. Значение цитокинов в защите от стафилококковой инфекции 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1. Подготовка объектов фагоцитоза 39
2.1.1. Подготовка клеток стафилококков 39
2.1.1.1. Окраска клеток S. aureus флюоресцеина изотиоцианатом 39
2.1.1.2. Опсонизация клеток S. aureus препаратами антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов 40
2.1.2. Подготовка опсонизированного зимозана 40
2.1.3. Получение модельных иммунных комплексов 40
2.2. Исследование иммуноглобулинсвязывающей активности штаммов стафилококка 41
2.3. Определение средних размеров частиц взвеси стафилококков 41
2.4. Источник биологического материала 42
2.5. Культуры крови и определение концентрации цитокинов в супернатанах 42
2.6. Исследование поглотительной активности лейкоцитов 43
2.7. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов (лзхл) 44
2.8. Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Влияние антител на фагоцитоз s. Aureus 46
3.1. Связывание антител различными штаммами стафилококка в зависимости от содержания белка a в клеточной стенке бактерии 46
3.2. Зависимость поглотительной активности гранулоцитов и моноцитов от опсонизирующей функции антител 47
3.2.1. Характер поглощения неопсонизированного S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами 47
3.2.2. Влияние нормального иммуноглобулина на фагоцитоз S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами 49
3.3. Влияние аси на поглощение s. aureus гранулоцитами 53
3.3.1. Исследование поглощения неопсонизированных стафилококков 53
3.3.2. Влияние АСИ на поглощение S. aureus Wood 46 54
3.3.3. Влияние АСИ на поглощение S. aureus Cowan I 56
3.3.4. Влияние штамма стафилококков на поглотительную активность гранулоцитов 57
3.3.5. Сравнительная характеристика опсонизирующих свойств антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов 58
3.4. Спектротурбидиметрическое определение изменения средних размеров частиц стафилококковых суспензий под влиянием иммуноглобулинов 59
3.5. Исследование влияния аси на лзхл лейкоцитов 61
3.6. Обсуждение 63
глава 4. Влияние цитокинов на фагоцитоз s. Aureus Cowan i 68
4.1. Цитокиновый профиль суточных культур клеток цельной крови, Активированных различными стимуляторами 68
4.1.1. Секреция TNF- в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I 68
4.1.2. Секреция IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I 68
4.1.3. Секреция TNF-, IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных LPS, PHA и зимозаном 70
4.2. Влияние супернатантов культур клеток цельной крови, стимулированных s. aureus cowan i, на поглотительную активность фагоцитов 74
4.2.1. Влияние супернатантов на поглотительную активность гранулоцитов 74
4.2.2. Влияние супернатантов на поглотительную активность моноцитов 75
4.3. Влияние супернатантов культур крови на лзхл лейкоцитов 76
4.3.1. Влияние супернатантов культур клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I, на уровень ЛХЗЛ лейкоцитов, поглотивших стафилококк 76
4.3.2. Отмена тренталом усиливающего влияния САК на ЛЗХЛ лейкоцитов, поглотивших S. aureus Cowan I 77
4.4. ЛЗХЛ лейкоцитов в ответ на s. Aureus и другие объекты фагоцитоза 78
4.5. Обсуждение 80
Заключение 92
Выводы 96
Список сокращений и условных обозначений 97
Список литературы 98
- Проникновение стафилококка через барьеры кожи и слизистых оболочек
- Опсонизация клеток S. aureus препаратами антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов
- Характер поглощения неопсонизированного S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами
- Секреция IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan
Введение к работе
Актуальность темы. S. aureus является основным возбудителем
нозокомиальных инфекций во всем мире (Смирнов В. В., 1988; Fry D. E. et al., 2011; May A. K. et al., 2011; Phakade R. S. et al., 2012). Одной из причин распространённости стафилококковых инфекций является отсутствие надёжных средств специфической профилактики (Weems J. J. et al., 2006; Simor A. E. et al., 2011) и лечения. Вакцины, предотвращающие развитие стафилококковых инфекций, отсутствуют. Антибиотики могут оказаться неэффективными в результате развития у бактерий антибиотикорезистентности (Выгодчиков Г. В., 1963; Graves S. F. et al., 2010). Учитывая, что наличие антибиотикоустойчивости стафилококков является серьёзной проблемой, надежда на создание альтернативных средств лечения возлагается на препараты, действие которых направлено на макроорганизм.
Известно, что ключевым механизмом защиты макроорганизма от стафилококка является фагоцитоз (Quie P. G. et al., 1977; Lekstrom-Himes J. A. et al., 2000; Molne L. et al., 2000). На эффективность фагоцитоза оказывает влияние локальное микроокружение, важнейшими компонентами которого являются антитела и цитокины. Антитела обладают наиболее выраженной опсонизирующей активностью по сравнению с другими молекулами (Williams A. J. et al., 1980; Szejda P. et al., 1984; Munro C. S. et al., 1985). Цитокины участвуют в регуляции количества лейкоцитов в очаге инфекции (Kimura M. et al., 1997; Matsukawa A. et al., 1997) и осуществляют прайминг фагоцитов (Sheppard F. R. et al., 2005; El-Benna J. et al., 2008).
При создании иммунотропных средств лечения основные усилия
разработчиков были сосредоточены на улучшении опсонизации бактерий с помощью
введения или индукции in vivo образования антител. Однако препараты с указанными
свойствами не смогли успешно пройти клинические испытания (Projan S. J. et al.,
2006; Middleton J. R., 2008). В России в качестве дополнительного средства лечения
стафилококковых инфекций в клинической практике используется
антистафилококковый иммуноглобулин. Следует отметить, что этот препарат не проходил испытаний согласно требованиям доказательной медицины (Kelly J., 2000).
Неудачные попытки создания иммунопрепаратов для лечения стафилококковых инфекций свидетельствуют о недостаточном понимании их патогенеза (Franois P. et al., 2009; Garcia-Lara J. et al., 2009; Кузьменко О. М. и др., 2010). Всё это
обуславливает необходимость вновь обратиться к вопросам изучения механизмов фагоцитоза S. aureus и факторов, определяющих его эффективность.
Цель работы исследование влияния антител и цитокинов на эффективность фагоцитоза S. aureus.
Основные задачи исследования:
-
Оценить выраженность влияния опсонизации S. aureus антителами на реакцию интернализации и выработку активных форм кислорода лейкоцитами человека при поглощении стафилококков в системе in vitro.
-
Оценить опсонизирующую и агрегационную активность коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S. aureus и сравнить указанные свойства специфического препарата со свойствами нормального иммуноглобулина человека.
-
Определить закономерности продукции основных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов клетками крови при контакте со стафилококком, а также оценить выраженность влияния цитокинов на процессы интернализации и продукции активных форм кислорода лейкоцитами при фагоцитозе S. aureus в системе in vitro.
Научная новизна. Впервые показано, что антитела в несколько раз усиливают
процесс поглощения стафилококков, однако это не приводит к адекватному
повышению выработки активных форм кислорода фагоцитами. Впервые обнаружено,
что опсонизирующие свойства препарата коммерческого антистафилококкового
иммуноглобулина по отношению к S. aureus уступают таковым препарата
нормального иммуноглобулина человека. Впервые показана возможность применения
спектротурбидиметрии для оценки агрегационных свойств антител. Впервые
получены данные о зависимости интенсивности синтеза провоспалительных и
противовоспалительных цитокинов в суточных культурах цельной крови от широкого
диапазона концентраций S. aureus. Впервые показано, что цитокины,
вырабатываемые при контакте клеток крови со стафилококком, преимущественно
усиливают выработку активных форм кислорода фагоцитами, оказывая
незначительное влияние на интенсивность поглощения бактерий.
Теоретическое и практическое значение работы. В теоретическом плане полученные результаты расширяют представления о механизмах фагоцитарных реакций по отношению к S. aureus. Показано, что основная проблема антистафилококковой защиты макроорганизма заключается в низком уровне кислородзависимой бактерицидности фагоцитов, поглотивших стафилококк. В практическом плане результаты работы позволяют по-новому взглянуть на эффективность повышения опсонизации S. aureus и применение цитокинов для усиления бактерицидного потенциала лейкоцитов при лечении стафилококковых инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
-
Опсонизация стафилококков антителами в значительной степени усиливает интернализацию S. aureus лейкоцитами, оказывая при этом слабое стимулирующее влияние на выработку клетками активных форм кислорода.
-
Действие препарата коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина на процесс поглощения S. aureus и агрегационная активность специфических антител уступают соответствующим свойствам нормального иммуноглобулина человека. Оба препарата в равной степени влияют на продукцию активных форм кислорода фагоцитами при поглощении S. aureus.
-
Цитокины, вырабатываемые клетками цельной крови при контакте со стафилококком, усиливают образование активных форм кислорода лейкоцитами, фагоцитирующими S. aureus; влияние цитокинов на реакцию поглощения стафилококков выражено в меньшей степени.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были представлены в виде докладов и обсуждены на II Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов с международным участием «Симбиоз Россия 2009» (25–29 мая 2009 г. – г. Пермь); VII конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной, клинической иммунологии и аллергологии» (29 июня – 3 июля 2009 г. – г. Архангельск); VIII конференции иммунологов Урала (28–30 июня 2010 г. – г. Сыктывкар); IX конференции иммунологов Урала (21–24 июня 2011 г. – г. Челябинск); X конференции иммунологов Урала (1–3 июля 2012 г. – г. Тюмень).
Основные результаты исследования представлены в 4 печатных работах, из них 3 статьи вышли в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных результатов исследований, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, из них 18 отечественных и 176 зарубежных, списка иллюстративных материалов, содержащего 13 рисунков и 12 таблиц.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Исследования поддержаны программой Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», № проекта: 09-П-4-1015.
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Проникновение стафилококка через барьеры кожи и слизистых оболочек
Актуальность темы исследования. S. aureus является основным возбудителем нозокомиальных инфекций во всем мире [16; 61; 110; 136]. В настоящее время регистрируется рост числа стафилококковых заболеваний [22; 126].
Одной из причин распространённости стафилококковых инфекций является отсутствие надёжных средств специфической профилактики [158; 184] и лечения. Вакцины, предотвращающие развитие стафилококковых инфекций, отсутствуют. Антибиотики могут оказаться неэффективными в результате развития у бактерий антибиотикорезистентности [2; 69].
Другим объектом терапевтического воздействия при лечении инфекций является организм человека. Учитывая, что наличие антибиотикоустойчивости стафилококков является серьёзной проблемой, надежда на создание альтернативных средств лечения возлагается на препараты, действие которых направлено на макроорганизм.
Известно, что ключевым механизмом защиты макроорганизма от стафилококка является фагоцитоз [102; 114; 144]. На эффективность фагоцитоза оказывает влияние локальное микроокружение, важнейшими компонентами которого являются антитела и цитокины. Антитела обладают наиболее выраженной опсонизирующей активностью по сравнению с другими молекулами [115; 171; 189]. Дефицит антител приводит к развитию гноеродных инфекций, большей частью вызванных S. aureus [23]. Цитокины участвуют в регуляции количества лейкоцитов в очаге инфекции [92; 109] и осуществляют прайминг фагоцитов [47; 155].
Исходя из вышесказанного, основные усилия рзработчиков при создании иммунотропных средств лечения были сосредоточены на улучшении опсонизации бактерий с помощью введения или индукции in vivo образования антител. Тем не менее, четыре препарата с указанными свойствами не смогли успешно пройти клинические испытания [112; 141]. В России в качестве дополнительного средства лечения стафилококковых инфекций в клинической практике используется антистафилококковый иммуноглобулин, который, однако, не проходил испытаний согласно требованиям доказательной медицины [90].
Неудачные попытки создания иммунопрепаратов для лечения стафилококковых инфекций свидетельствуют о недостаточном понимании их патогенеза [10; 63]. Всё это обуславливает необходимость вновь обратиться к вопросам изучения механизмов фагоцитоза S. aureus и факторов, определяющих его эффективность. Цель работы исследование влияния антител и цитокинов на эффективность фагоцитоза S. aureus.
Основные задачи исследования:
1. Оценить выраженность влияния опсонизации S. aureus антителами на реакцию интернализации и выработку активных форм кислорода лейкоцитами человека при поглощении стафилококков в системе in vitro.
2. Оценить опсонизирующую и агрегационную активность коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S. aureus и сравнить указанные свойства специфического препарата со свойствами нормального иммуноглобулина человека.
3. Определить закономерности продукции основных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов клетками крови при контакте со стафилококком, а также оценить выраженность влияния цитокинов на процессы интернализации и продукции активных форм кислорода лейкоцитами при фагоцитозе S. aureus в системе in vitro.
Научная новизна. Впервые показано, что антитела в несколько раз усиливают процесс поглощения стафилококков, однако это не приводит к адекватному повышению выработки активных форм кислорода фагоцитами. Впервые обнаружено, что опсонизирующие свойства препарата коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S. aureus уступают таковым препарата нормального иммуноглобулина человека.
Впервые показана возможность применения спектротурбидиметрии для оценки агрегационных свойств антител. Агрегационная активность коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S. aureus выражена в меньшей степени, чем соответствующая функция препарата нормального иммуноглобулина.
Впервые получены данные о зависимости интенсивности синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в суточных культурах цельной крови от широкого диапазона концентраций S. aureus. Результаты позволяют проследить синтез цитокинов от уровня базовой секреции до уровня её запредельного торможения.
Впервые показано, что цитокины, вырабатываемые при контакте клеток крови со стафилококком, преимущественно усиливают выработку активных форм кислорода фагоцитами, оказывая незначительное влияние на интенсивность поглощения бактерий.
Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане полученные результаты расширяют представления о механизмах фагоцитарных реакций по отношению к S. aureus. Показано, что основная проблема антистафилококковой защиты макроорганизма заключается в низком уровне кислородзависимой бактерицидности фагоцитов, поглотивших стафилококк. В практическом плане результаты работы позволяют по-новому взглянуть на эффективность повышения опсонизации S. aureus и применение цитокинов для усиления бактерицидного потенциала лейкоцитов при лечении стафилококковых инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
1. Опсонизация стафилококков антителами в значительной степени усиливает интернализацию S. aureus лейкоцитами, оказывая при этом слабое стимулирующее влияние на выработку клетками активных форм кислорода. 2. Действие препарата коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина на процесс поглощения S. aureus и агрегационная активность специфических антител уступают соответствующим свойствам нормального иммуноглобулина человека. Оба препарата в равной степени влияют на продукцию активных форм кислорода фагоцитами при поглощении S. aureus.
3. Цитокины, вырабатываемые клетками цельной крови при контакте со стафилококком, усиливают образование активных форм кислорода лейкоцитами, фагоцитирующими S. aureus; влияние цитокинов на реакцию поглощения стафилококков выражено в меньшей степени.
Опсонизация клеток S. aureus препаратами антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов
Ранее (раздел 1.5.2) мы упоминали о том, что дефициты иммуноглобулинов клинически выражаются в повышенной чувствительности макроорганизма к стафилококковой инфекции. В научной литературе также присутствуют описания экспериментов, раскрывающих основную роль антител в защите от бактерий -опсонизацию объектов фагоцитоза. Так, при поглощении S. aureus, опсонизированного сывороткой пациентов с гипоглобулинемией, нейтрофилы вырабатывают меньше свободных радикалов, чем при опсонизации стафилококка сывороткой здоровых доноров [115; 189]. Интенсивность поглощения некоторых штаммов стафилококка (с низким содержанием белка А в клеточной стенке) в большой степени зависит от содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови [179]. Наконец, поглощение клеток стафилококка, фрагментов его клеточной стенки или очищенного пептидогликана (полимер клеточной стенки) нейтрофилами в отсутствии опсонинов ничтожно [54; 135; 179]. И, хотя в опсонизации стафилококка принимают участие не только антитела [78; 167; 179; 189], приведённые примеры показывают, что опсонизирующая функция антител является существенной для защиты макроорганизма от S. aureus.
Среди всех классов иммуноглобулинов основную долю сывороточных антистафилококковых антител составляют антитела класса G [45; 142]. Хотя IgA, взаимодействующие с поверхностными антигенами бактерии, также представлены в большом количестве [142]. Кроме того IgG являются основным видом антител, присутствующих в экссудате ран: количество IgG в десятки раз превышает содержание иммуноглобулинов других классов. В гнойных ранах (возбудителем инфекции в которых является S. aureus) концентрация IgG в 5 раз больше, чем в экссудате стерильных ран. Тогда как концентрации других иммуноглобулинов при наличии или отсутствии инфицирования раны остаются неизменными [17]. Численное превосходство антистафилококковых IgG в сыворотке крови и большое количество IgG в раневом содержимом подчёркивают роль антител этого класса в противостафилококковой защите организма.
Сыворотка здоровых людей содержит иммуноглобулины, распознающие как поверхностные структуры, так и секретируемые продукты S. aureus [26; 40; 45; 80; 142; 188; 191]. По данным Dryla A. et al. от 0,1% до 3% всех IgG, присутствующих в сыворотке крови, взаимодействуют с антигенами клетки стафилококка. Такие сыворотки считаются сыворотками с низким и высоким титром антистафилококковых антител соответственно [45]. Репертуар анти-S. aureus IgG большей частью представлен иммуноглобулинами, распознающими липотейхоевые кислоты (60% - 85%) и пептидогликан (15% - 25%) [45].
IgG проявляют более выраженные опсонизирующие свойства, чем иммуноглобулины других классов и комплемент. При контакте с адсорбированным на поверхности IgG нейтрофилы генерируют больше перекиси водорода, чем при контакте с поверхностно-адсорбированными IgM. Фагоцитоз IgA-опсонизированных бактерий протекает менее интенсивно по сравнению с поглощением бактерий, опсонизированных IgG [67]. Опсонизация объектов фагоцитоза иммуноглобулинами класса G приводит к более интенсивному их поглощению нейтрофилами человека, чем опсонизация комплементом. При этом фагоциты вырабатывают больше активных соединений кислорода, если опсонином является IgG [67]. Таким образом, наиболее мощными (по сравнению с другими молекулами) опсоническими свойствами обладают антитела класса G, поскольку в их присутствии поглощение объектов фагоцитоза и выработка активных форм кислорода фагоцитами происходят интенсивнее.
IgG-опсонизированные частицы взаимодействуют с нейтрофилами при участии низкоаффинных FcRIIA и FcRIIIB и высокоаффинного рецептора FcRI [149; 152]. Интернализация IgG-опсонизированных частиц осуществляется при участии FcRIIA и FcRIIIB (экспрессируются на поверхности нейтрофилов постоянно). При этом поглощение с помощью FcRIIA происходит более эффективно [149]. FcRI на клетках отсутствует, а его появление (может быть индуцировано IFN-) на мембране нейтрофила не приводит к усилению интернализации опсонизированных частиц [149].
Следует также отметить, что IgG, связанные с антигеном, способны фиксировать компоненты классического пути активации комплемента. Поэтому IgG-опсонизированные частицы помимо контакта с Fc-рецепторами могут взаимодействовать с нейтрофилами через рецепторы к комплементу (complement receptor, CR), которые присутствуют на этих клетках: CR1, CR3 и CR4 [138]. Из числа рецепторов к комплементу наибольшее значение для фагоцитоза нейтрофилов имеет CR3. Посредством этой молекулы нейтрофилы осуществляют адгезию и поглощение до 70% опсонизированных комплементом частиц [138]. Таким образом, FcR и CR выполняют различные функции в процессе фагоцитоза. Среди этих рецептров можно выделить основные и вспомогательные.
Зная роль иммуноглобулинов в опсонизации бактерий, логично было бы предположить, что увеличение количества опсонизирующих антител в сыворотке крови должно усиливать противостафилококковую защиту макроорганизма. Действительно, вацинация мышей коньюгированной вакциной, состоящей из стафилококкового капсульного полисахарида (capsular polysaccharide, CP) 5 типа и протеина А Pseudomonas aeruginosa, позволяла увеличить выживаемость лабораторных животных до 73% при введении им летальной дозы стафилококков. В параллельном эксперименте тот же показатель у животных контрольной группы, «иммунизированных» фосфатно-солевым буферным раствором, составил 13%. Исследователи отмечают, что концентрация сывороточных анти-CP5 антител в группе выживших животных в 2,3 раза превышала концентрацию специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови у погибших животных [51]. В качестве другого примера удачной антистафилококковой иммунотерапии лабораторных животных можно привести увеличение концентрации сывороточных IgG, специфичных к липотейхоевым кислотам (LTA, lipoteichoic acid, компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий), путём вакцинации.
Характер поглощения неопсонизированного S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами
Опсонизация специфическим иммуноглобулином усиливала поглощение стафилококка штамма Cowan I. В присутствии небольшого числа бактерий (106 кл/мл) ИПП гранулоцитов составил 19,9 (ln=2,992±0,107) и в 3,2 раза превышал (P 0,001) уровень поглощения неопсонизированных объектов. При высоком содержании микробов (108 кл/мл) ИПП гранулоцитов оказался равен 621,8 (ln=6,433±0,170). Показатель вырос в 3,7 раза относительно соответствующего ИПП, полученного без опсонизации стафилококка (P 0,01).
В контрольном исследовании опсонизация S. aureus Cowan I НИ способствовала ещё более интенсивному поглощению бактерий. При малой концентрации микробов значение ИПП гранулоцитов достигло 33,4 (ln=3,508±0,132), что в 5,3 раза больше показателя (P 0,001) при поглощении стафилококков в отсутствие опсонинов. В условиях избытка бактерий величина ИПП составила 1114,0 (ln=7,016±0,082). Интенсивность поглощения возросла в 6,7 раза (P 0,001) по сравнению с активностью захвата неопсонизировнаных стафилококков.
Таким образом, опсонизирующие свойства антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к другому штамму S. aureus (содержащему белок A на своей поверхности) вновь уступают свойствам препарата сравнения. Показатели контрольного исследования с НИ достоверно превышали соответствующие значения, полученные при опсонизации Cowan I АСИ (PАСИ-НИ 0,01 и PАСИ-НИ 0,05 при малой и большой концентрации бактерий соответственно; Рисунок 6, Б). Сила влияния (2) фактора опсонизации в контрольном исследовании составила 27% (Таблица 1), тогда как в эксперименте с антистафилококковым иммуноглобулином она оказалась равна 15,7% (Таблица 5). Объединяя эти данные с результатами, предствленными в разделе 3.3.2, можно утверждать, что независимо от присутствия белка А на поверхности стафилококка опсонизирующие свойства специфического иммуноглобулина выражены слабее, чем опсонизирующие свойства нормального иммуноглобулина.
На основании данных в разделах 3.3.1-3.3.3 можно дать оценку влияния штамма стафилококков на интенсивность их поглощения гранулоцитами. Как было показано ранее (см. раздел 3.3.1), фагоциты менее активно захватывали неопсонизированный S. aureus Wood 46 по сравнению с бактериями штамма Cowan I. При опсонизации бактерий антителами ситуация менялась. При невысоком содержании микробов Wood 46 и Cowan I, опсонизированных специфическим иммуноглобулином, соответствующие значения ИПП гранулоцитов составили 214,3 (ln=5,367±0,118) и 19,9 (ln=2,992±0,107; различие в 10 раз; P 0,001). При 100-кратно большей концентрации бактерий соответствующие значения ИПП были 2149,0 (ln=7,673±0,087) и 621,8 (ln=6,433±0,170; различие в 3,5 раза; P 0,001). То есть показатели фагоцитоза опсонизированных бактерий штамма Wood 46 превосходили ИПП фагоцитов при поглощении S. aureus Cowan I.
Схожие результаты были получены при опсонизации Wood 46 и Cowan I нормальным иммуноглобулином. Соответствующие пары значений ИПП составили: при концентрации микробов 106 кл/мл – 350,3 (ln=5,859±0,317) и 33,4 (ln=3,508±0,132; различие в 10,5 раз; P 0,001), 108 кл/мл – 2883,8 (ln=7,967±0,054) и 1114,0 (ln=7,016±0,082; различие в 2,6 раза; P 0,001). Вновь поглощение опсонизированного S. aureus Wood 46 превосходило интенсивность фагоцитоза бактерий штамма Cowan I. Таким образом, опсонизированный антителами белок A-негативный S. aureus Wood 46 является более «привлекательным» объектом фагоцитоза, чем опсонизировнный теми же антителами белок A-позитивный S. aureus Cowan I. Учитывая, что поглощение S. aureus Wood 46 в отсутствие антител происходит достаточно слабо, опсонизация иммуноглобулинами имеет большее значение для фагоцитоза S. aureus Wood 46.
В предыдущих разделах были представлены доказательства того, что фактор опсонизации оказывает значительное влияние на интенсивность поглощения стафилококков. Чтобы оценить влияние специфичности препратов на эффективность поглощения, статистический анализ полученных значений ИПП нужно провести без учёта данных по интернализации неопосонизированных бактерий. Результаты дисперсионного анализа, представленные в Таблицах 6 и 7, показывают, что интенсивность интернализации стафилококков обоих штаммов зависит от специфичности иммуноглобулинов не более чем на 4%. Для биологических объектов такую величину вряд ли можно считать существенной, несмотря на высокую достоверность статистической оценки (PF 0,01 в обоих случаях). Это означает, что различия в содержании опсонизирующих антител в двух препаратах невелики. И основным фактором, который обуславливает интенсивность поглощения опсонизированных стафилококков, становится концентрация объектов фагоцитоза.
Секреция IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan
Широкое распространение стафилококковых инфекций главным образом связано с отсутствием надёжных средств лечения этих заболеваний. Последняя проблема возникает как следствие неполного понимания патогенеза инфекций, вызванных стафилококком. Однако установлено, что основным механизмом защиты макроорганизма от S. aureus является фагоцитоз. Следовательно, поиск методов лечения (помимо создания новых антибактериальных препаратов) должен быть сосредоточен на способах увеличения эффективности фагоцитоза.
Исследования по разработке лекарственных препаратов, усиливающих фагоцитоз стафилококков, начались несколько десятилетий назад и продолжаются в настоящее время. Можно выделить два основных направления по созданию препаратов для иммунотерапии стафилококковых инфекций: повышение опсонизации бактерий путём пассивной или активной вакцинации и нейтрализация токсинов стафилококка. К сожалению, ни одна из предложенных идей не была реализована в эффективное лекаственное средство. Всё вышесказанное обуславливает необходимость вновь обратиться к изучению патогенеза стафилококковых инфекций и механизмов фагоцитоза S. aureus.
Важнейшими компонентами фагоцитарных реакций являются антитела и цитокины. Антитела обладают наиболее мощной опсонизирующей активностью по сравнению с другими молекулами. В связи с чем нам представляется важным оценть их вклад в различные фагоцитарные реакции при поглощении S. aureus. Другой незаменимый компонент фагоцитоза, оказывающий регуляторное влияние на клетки очага воспаления, это цитокины. Благодаря эффекту прайминга цитокины способны усиливать фагоцитарные реакции. Поэтому количественная оценка влияния цитокинов на фагоцитоз S. aureus также стала предметом нашего исследования.
Полученные результаты показывают, что опсонизирующая функция антител существенна для процесса интернализации стафилококков: активность поглощения бактерий под влиянием антител возрастает в десятки раз. Однако при этом не происходит столь же мощного усиления бактерицидности фагоцитов: количество активных форм кислорода, вырабатывающихся при поглощении опсонизированных антителами стафилококков, лишь в полтора раза выше, чем при фагоцитозе неопсонизированных бактерий. Обнаруженный диссонанс фагоцитарных реакций позволяет сделать ряд выводов.
Во-первых, эти факты могут послужить объяснением неудачных попыток создания антистафилококковых иммунопрепаратов на основе антител. Возможно, что причина отсутствия успеха заключается не столько в особенностях гуморального ответа на стафилококк (см. раздел 1.5.3.1), сколько в отсутствиии адекватного усиления бактерицидности фагоцитов под действием опсонинов. Следует отметить, что в антистафилококковой защите основную роль играет именно кислородзависимая бактерицидность: инактивация NADPH-оксидазы в несколько раз уменьшает способность нейтрофилов уничтожать стафилококк [73]. Поскольку повышение опсонизации стафилококков антителами не приводит к значительному увеличению выработки свободных радикалов, эта мера не приведёт и к нужному конечному результату уничтожению бактерии.
Во-вторых, несоответствие между количеством поглощённых бактерий и уровнем бактерицидности может способствовать внутриклеточному выживанию S. aureus. Наконец, из полученных результатов очевидно, что управление реакцией интернализации стафилококков с помощью терапевтических средств выполнимая задача. Было показано, что препараты антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов человека обладают опсонизирующей активностью по отношению к белок А-положительным и белок А-отрицательным штаммам S. aureus. Фагоцитоз бактерий даже с высоким содержанием фактора, препятствующего опсонизации антителами, усиливается в несколько раз. Всё вышеперечисленное заставляет переключить внимание с процесса захвата на процесс уничтожения стафилококков.
Поэтому на следующем этапе работы мы провели оценку праймирующего эффекта цитокинов, вырабатываемых клетками крови при контакте со стафилококком, на фагоцитоз S. aureus. Цитокины оказались именно тем фактором, который преимущественно усиливал кислородзависимую бактерицидность фагоцитов, оказывая слабое влияние на процесс захвата бактерий. Более того, S. aureus был самым мощным индуктором образования цитокинов среди всех использованных нами стимуляторов, что давало надежду на значительное усиление выработки свободных радикалов за счёт прайминга.
Тем не менее, эффект цитокинов оказался довольно слабым: кратность усиления люминесценции под влиянием медиаторов составила лишь 1,7 раз. Существенно, что эта величина отражает максимально возможный модулирующий эффект цитокинов на бактерицидность фагоцитов при поглощении S. aureus. Это означает, что дальнейшее увеличение концентрации цитокинов не принесёт желаемого результата и может даже усугубить ситуацию, приведя к запредельному торможению выработки активных форм кислорода.
Таким образом, результаты исследования показывают, что ни антитела, ни цитокины не в состоянии повлиять на бактерицидность фагоцитов в той же степени, в какой антитела способны усилить реакцию интернализации стафилококков. Более того, при фагоцитозе иных объектов люминесценция лейкоцитов может достигать величин, в несколько раз превосходящих значения, регистрируемые при поглощении стафилококков. Чем можно объяснить такой относительно невысокий эффект антител и цитокинов на фагоцитоз S. aureus? Маловероятно, что в присутствии большого количества опсонинов и наличия медиаторов в высоких концентрациях фагоциты не реализуют весь свой бактерицидный потенциал.
Вероятнее всего причина заключается в следующем. При наличии достаточного количества факторов, необходимых для осуществления фагоцитоза, лейкоцит работает на пределе своих возможностей, в том числе вырабатывая максимальное количество радикалов. Однако стафилококк (даже будучи в обезвреженном состоянии!) довольно легко разрушает большую часть образующихся активных форм кислорода. Ранее (см. раздел 3.6) мы уже упоминали о факторах стафилококка, которые обладают подобным эффектом. Развивая эту мысль дальше, можно предположить, что, выжив за счёт разрушения активных форм кислорода, стафилококк может начать действовать против клетки-хозяина. Так, при фагоцитозе изменяется экспрессия многих генов стафилококка, в том числе повышается синтез токсинов. В последующем эти события приведут к разрушению фагоцита [70; 95; 132; 180].
Подводя итог, следует сказать, что полученные нами результаты позволяют заострить внимание на основной проблеме в защите макроорганизма от стафилококков низкой бактерицидности фагоцитов. В свою очередь это ставит перед исследователями другую, более сложную задачу усилить, насколько возможно, или хотя бы поддержать на достаточном уровне данную функцю клеток. Добиваться последнего вряд ли стоит путём усиления опсонизации стафилококков или стимуляцией лейкоцитов цитокинами. На наш взгляд дальнейшие направления исследований должны быть сосредоточены на изучении особенностей функционирования иммунной системы людей, у которых стафилококковые инфекции не возникают на протяжении всей жизни. Такой подход в решении поставленной задачи позволит обнаружить другие факторы макроорганизма, возможно имеющие первостепенное значение для фагоцитоза стафилококков и антистафилококковой защите.
