Введение к работе
Актуальность проблемы
Успехи в области вакцинопрофилактики коклюша подтвердили правильность принятых ранее научно-организационных и медицинских решений, направленных на борьбу с коклюшной инфекцией, вызываемой Bordetella pertussis, передающейся воздушно-капельным путем. Тем не менее, коклюш продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения.
Заболеваемость коклюшем в Европе и других развитых странах мира, остается высокой. Несмотря на массовую вакцинацию ежегодно заболевают около 600 000 взрослых, растет заболеваемость подростков и детей первого года жизни. Начиная с середины 90-х годов прошлого столетия, во многих странах мира, несмотря на широкий охват прививками населения, начали регистрировать подъем заболеваемости коклюшем (T. Tan. et.al., 2005; Г.Г. Чистякова и др., 2005; O. He et.al., 2008; R. Lilloa-Guierrez et.al., 2008), в том числе среди привитых - детей, подростков, а также части взрослых (A.K.Leung et.al., 2007; E.Grimprel et.al., 2007; N.Guiso et.al., 2011). Достаточно высоким во всех странах мира остаётся уровень скрытой заболеваемости, cерологические маркёры инфицирования выявляют у 13 - 32% подростков и взрослых (J.J. Hu et. al., 2006; J.D.Cherry et.al., 2005; В.К.Таточенко, 2010).
В России охват прививками выше 95% привел к снижению заболеваемости с 19,06 на 100000 населения в 1998 г до 2,51 на 100000 в 2008 г. Однако публикуемые данные не отражают истинного положения по заболеваемости коклюшем. В связи с тем, что в России исследования по иммунологическому мониторингу коклюша часто проводятся в неполном объеме, установить истинный уровень заболеваемости в стране не представляется возможным. Для серологической диагностики коклюша и оценки напряженности гуморального иммунитета в отечественной медицинской практике традиционно используется, главным образом, реакция агглютинации, а отсутствие на рынке более информативных иммуноферментных (ИФА) тест-систем отечественного производства, существенно обостряет данную проблему (И.В. Фельдблюм и др., 2005; М.В.Сухинин, 2005). Кроме того, сведения о состоянии иммунитета к коклюшу в России у детей имеют ограниченный характер, а у взрослых практически отсутствуют. При этом известно, что определяемые различия в спектрах антител к антигенам вакцинных и циркулирующих (диких) штаммов B. pertussis у больных коклюшем и здоровых, привитых против коклюша детей, являются одним из ключевых факторов понимания механизмов формирования постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунного ответа.
Одним из наиболее эффективных методов слежения за эпидемическим процессом коклюша, в том числе на фоне стертых и атипичных форм болезни, является иммунологический мониторинг, позволяющий оценить реальный уровень заболеваемости. За рубежом постоянно совершенствуется серологическая диагностика коклюша (D.Xing et.al., 2009; M.L.Tondella et.al., 2009; T.Ishida et.al., 2010; N.Guiso et.al., 2011; N. Miyashita et.al., 2011), проводятся исследования, отражающие распространенность данной инфекции в популяции (V.Socan et.al., 2006; Y.Quinn et.al., 2007; A.M. Kapaskelis et.al., 2008), изучается иммунологический статус привитых против коклюша (H.О.Hallander et.al., 2009; T.Dalby et.al., 2010). Однако, несмотря на широкое применение в борьбе с коклюшной инфекцией новых диагностических приёмов, в том числе ИФА, в области диагностики существуют определённые проблемы.
В настоящее время назрела необходимость в увеличении информативности иммуноферментного анализа (Г.Я.Ценева и др., 2003; S.L.Menzies et.al., 2006). Стала очевидной важность исследований по определению диагностической значимости антител различных изотипов/субизотипов к антигенам B. рertussis. Проведение подобных исследований при коклюшной инфекции и вакцинации против коклюша невозможно без создания новых ИФА тест-систем, предназначенных для углублённого изучения гуморального иммунитета, процесса антителообразования при инфекции и вакцинации. Можно полагать, что подобный серологический анализ позволит определить критерии, необходимые, в частности, для надёжной дифференцировки постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Таким образом, в борьбе с коклюшной инфекцией необходимо использовать приёмы современной лабораторной диагностики, которые в сочетании с мерами по активной иммунопрофилактике болезни среди восприимчивых контингентов, включая подростков и взрослых, позволят значительно увеличить эффективность противоэпидемических мероприятий и существенно снизить уровень заболеваемости (N.Guiso, 2008; L.J.Scott, 2010; H.О. Hallander et.al., 2011).
К настоящему времени устанавливают генотипические и антигенные различия между вакцинными и дикими штаммами коклюшного микроба (D.J. Litt et.al., 2009; F.R. Mooi et.al., 2010), проводится мониторинг антигенных профилей циркулирующих штаммов коклюшного микроба. Эти результаты необходимы для обоснования штаммового и антигенного состава новых коклюшных вакцин (Б.Ф. Семенов и др., 2002; A. Advani et.al., 2007).
Таким образом, эффективные меры по борьбе с коклюшной инфекцией, включая повышение уровня управления эпидемическим процессом коклюша, возможны лишь при активном совершенствовании иммунологического контроля с использованием наиболее современных лабораторных методов изучения особенностей формирования постинфекционного и поствакцинального иммунитета у населения.
Имеющиеся в литературе данные не дают полного представления об особенностях антигенного состава вакцинных и циркулирующих штаммов B. рertussis, специфичности и изотипе антител, продуцирующихся при коклюшной инфекции и вакцинации против коклюша, уровне популяционного иммунитета разных возрастных групп населения в условиях высокого охвата прививками и продолжающейся циркуляции возбудителя. Решение этих вопросов позволит найти новые подходы к обоснованию штаммового и антигенного состава вакцин для профилактики коклюша, повысить эффективность лабораторной диагностики коклюшной инфекции, определить возрастные «группы риска» с низким уровнем противококлюшного иммунитета, подлежащих ревакцинации против коклюша.
Цель работы - выявление особенностей формирования постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунитета к коклюшу, разработка подходов к созданию высокоинформативных методов серологической диагностики коклюшной инфекции и контроля напряженности популяционного иммунитета к коклюшу.
Задачи исследования:
1. Исследовать антигенный профиль вакцинных и свежевыделенных (диких) штаммов B. pertussis для обоснования включения бактериальных антигенов в состав новых диагностических ИФА тест-систем.
2. Разработать и сконструировать ИФА тест-системы, предназначенные для выявления антител изотипов - IgG, IgМ, IgА и субизотипов - IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 к антигенам B. pertussis.
3. Провести сравнительный анализ процессов IgG-, IgМ- и IgА-антителообразования у экспериментальных животных при различных способах их иммунизации антигенами B. pertussis.
4. Оценить процесс продукции антител основных изотипов/субизотипов к антигенам B. pertussis у пациентов с коклюшной инфекцией, изучить закономерности динамики антителообразования в разные фазы заболевания.
5. Провести популяционный анализ формирования антител основных изотипов/субизотипов к антигенам B. pertussis в различных возрастных группах населения.
Научная новизна
Впервые установлены закономерности в динамике образования антител различных изотипов и субизотипов к антигенам B. pertussis при развитии коклюшной инфекции, а также формировании поствакцинального иммунитета в различных возрастных группах населения. Предложен новый перспективный подход к серологической диагностике коклюша и оценке поствакцинального иммунитета, учитывающий особенности выработки антикоклюшных антител различных изотипов и субизотипов, в разные фазы коклюшной инфекции и при иммунизации.
Впервые показано, что коклюшная инфекция сопровождается нарастанием титров сывороточных антител изотипов IgМ, IgА, IgG и IgG1-, IgG2-, IgG3-, IgG4- субизотипов к белковым антигенам (коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, агглютиногенам 1,2,3) и липополисахариду (ЛПС) B. pertussis. При коклюшной инфекции динамика образования антител к липополисахариду B. pertussis отличается от динамики антителообразования к белковым антигенам возбудителя, при этом, в фазу реконвалесценции, отмечается снижение титров специфических IgG- и IgА-антител.
Впервые показано, что для острой фазы коклюшной инфекции характерно:
- нарастание титров IgМ-антител к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, агглютиногенам 1,2,3 и липополисахариду B. pertussis с последующим снижением их уровня в фазе реконвалесценции.
- титры IgG-, IgG1-, IgG2-, IgG4- и IgА-антител к белковым антигенам B. pertussis достигают максимальных значений в конце острой фазы заболевания с последующей стабилизацией показателей до конца фазы реконвалесценции.
- нарастание титра IgG3-антител к антигенам B. pertussis с 3 – 4 недель от начала коклюшной инфекции с последующим снижением их уровня в фазу реконвалесценции позволяет дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции.
Впервые, с учётом определением титра IgG3-антител к антигенам B. рertussis, разработан перспективный серологический метод лабораторной диагностики коклюша, позволяющий дифференцировать острую фазу заболевания от фазы реконвалесценции, а также иммунный ответ вследствие текущего заболевания и вакцинации.
Поствакцинальный гуморальный иммунный ответ к антигенам B. pertussis у детей младшего возраста, привитых АКДС вакциной, характеризуется отсутствием IgМ- и IgА-антител, а также узким спектром субизотипов IgG антител(IgG1 и IgG2).
Показано, что увеличение титра специфических IgМ-антител у больных коклюшем, отмечено как у категории лиц, не привитых против коклюша, так и у пациентов иммунизированных АКДС вакциной.
У детей 2 - 5-летнего возраста, привитых АКДС вакциной, уровень IgG- антител к антигенам B. pertussis, максимальный и постепенно снижается, достигая минимальных значений у детей 9 лет и старше, без существенного изменения динамики антителообразования у подростков и взрослых. Нарастание титра антител изотипа А к антигенам B. pertussis наблюдается, преимущественно, у лиц старшего возраста, что может быть обусловлено перенесенной стертой формой инфекции. Это подтверждается данными по аэрозольной вакцинации экспериментальных животных антигенами B. pertussis , при которой происходит стимуляция продукции сывороточных IgG-, IgМ- и IgА-антител. Инъекционные способы иммунизации вызывают активную выработку антител IgG- и IgМ-изотипов, но не вызывают процесс IgА-антителообразования.
Впервые показано, что антигенные профили вакцинных и свежевыделенных диких штаммов B. pertussis имеют сходные характеристики, однако, для диких штаммов, характерен более широкий диапазон содержания коклюшного токсина в надосадочной жидкости при культивировании. Концентрация коклюшного токсина в культурах вакцинных и свежевыделенных диких штаммов B. pertussis не связана со структурой гена ptхА, кодирующего ферментативно активную S1субъединицу.
Материалы работы включены в Национальное руководство «Вакцины и вакцинация».
Практическая значимость
Разработанная ИФА тест-система для определения антител основных изотипов (IgG, IgМ, IgА) и субизотипов (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) к комплексу антигенов B. pertussis (коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, липополисахариду, агглютиногенам 1, 2, 3) может быть использована для:
- в качестве дополнительной серологической диагностики коклюша;
- для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции по оценке уровня нарастание титра IgG3-антител к антигенам B. pertussis с 3 – 4 недель от начала коклюшной инфекции с последующим снижением их уровня в фазу реконвалесценции, позволяя дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции;
- контроля популяционного иммунитета к коклюшу;
- оценки иммунологической эффективности вакцин для профилактики коклюша;
- обоснования дополнительных критериев формирования постинфекционного иммунитета к коклюшу, включающих определение IgG-, IgG3-, IgМ- и IgА-антител к антигенам B. pertussis, и установление диагностических титры этих антител;
- оценки напряженности популяционного иммунитета к коклюшу, включающие определение IgG- и IgА-антител к комплексу антигенов B. pertussis, в разных возрастных группах населения;
- определения интенсивности циркуляции возбудителя в старших возрастных группах населения и их значимость как резервуара и источника инфекции, что свидетельствует о необходимости разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 9 лет, подростков и взрослых
В результате проведенных исследований получен патент на изобретение «Способ серологической диагностики коклюша» № 2424530 от 20.07. 2011 г. Изготовлены и испытаны на клиническом материале 3 опытные серии тест-наборов, разработан проект инструкции по изготовлению и контролю тест- системы и проект инструкции по применению тест-системы.
Разработаны ИФА тест-системы, которые могут быть использованы для количественного определения антигенов B. рertussis - коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина и агглютиногенов 1,2,3, а также для мониторинга антигенного состава и уровня токсинообразования штаммов B. рertussis и контроля антигенного состава коклюшных вакцин.
С помощью разработанной ИФА тест-системы можно определять уровень экспрессии коклюшного токсина и других антигенов вакцинными и свежевыделенными штаммами B. pertussis.
Отобранный штамм B. pertussis, отличающийся от вакцинных штаммов высокой способностью к токсинообразованию в перспективе может быть использован для создания новой коклюшной вакцины. Штамм депонирован в коллекции штаммов ГИСК им Л.А. Тарасевича (Свидетельство № 01-12/27 от 08.06.09 г.). Получен патент на изобретение «Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина» № 2407788 от 27.12. 2010 г.
Материалы диссертации использованы при разработке технологии получения комплекса антигенов В. рertussis, включающего коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, липополисахарид и агглютиногены 1,2,3. Получены патенты на изобретение «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis» (№ 2227746 от 27.04.2004 г., № 2285540 от 20.10.2006 г.). Показана перспективность использования комплекса антигенов для создания препаратов для вакцинопрофилактики и диагностики коклюша. На основе комплекса антигенов разработана технология изготовления и контроля бесклеточной коклюшной вакцины. На базе ОАО «Биомед» им. И.И Мечникова изготовлены опытно – промышленные серии препарата для проведения доклинических испытаний, разработаны проекты фармакопейной статьи и опытно – промышленного регламента.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Анализ генотипических, иммунобиологических и антигенных свойств возбудителя коклюша выявил сходство антигенного состава вакцинных и свежевыделенных штаммов B. рertussis при более широким диапазоне содержания коклюшного токсина в супернатантах культур свежевыделенных штаммов. Наличие в современной популяции B. pertussis штаммов с повышенным уровнем токсинообразования, указывает на необходимость мониторинга уровня токсинообразования циркулирующими штаммами возбудителя и селекции таких штаммов для усовершенствования вакцинных препаратов.
2. Использование комплекса антигенов B. pertussis (коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, липополисахарид, агглютиногены 1, 2.3) в качестве специфического лиганда в иммуноферментном анализе и антивидовых пероксидазных коньюгатов к основным изотипам и субизотипам иммуноглобулинов человека обеспечивает выявление широкого по специфичности и изотипу спектра противококлюшных антител у больных коклюшем и здоровых лиц разного возраста в ИФА.
3. Определены показатели уровня изотипов (IgМ, IgА, IgG) и субизотипов (IgG3) антител к антигенам B. pertussis, имеющие диагностическую значимость при коклюшной инфекции с 3 – 4 недель от начала заболевания и позволяющие дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции.
4. Показана, что у вакцинированных АКДС - вакциной детей и иммунизированных непарэнтерально животных не происходит значимого IgА ответа, развивающегося при поступлении антигенов B. pertussis через слизистые органов дыхания при коклюшной инфекции у людей или аэрозольной иммунизации экспериментальных животных, в связи с чем выявление антител этого класса у здоровых лиц можно рассматривать как серологический признак перенесенной инфекции, позволяющий оценить распространенность коклюша в популяции.
5. Выявленное снижение популяционного иммунитета к коклюшу в возрастных группах населения старше 9 лет сопровождается нарастанием частоты выявления IgА антител к антигенам B. pertussis, что указывает на интенсивность циркуляции возбудителя в старших возрастных группах населения и их значимость как резервуара и источника инфекции и свидетельствует о необходимости разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 9 лет, подростков и взрослых.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены и обсуждены на VII, VIII и XV Российских национальных конгрессах « Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2001, 2008); VII съезде эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (Москва, 2002); первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекции» (Москва, 2004); Fourth World Congress on Vaccines and Immunization (Tsukuba Science city/Tokyo, Japan, 2004); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008» Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010» (Москва, 2010); XIII и XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009, 2011).
Апробация диссертации состоялась 26 мая 2011года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Работа выполнена в рамках подпрограмм «Вакцинопрофилактика» и «Совершенствование методов диагностики заболеваний, контролируемых средствами спецпрофилактики: дифтерии, коклюша, краснухи» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально-значимыми заболеваниями (2007 – 2011 годы)», Международного проекта №1439 Международного научно-технического центра (МНЦТ).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 39 печатных работ, из них 19 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получено 4 патента РФ на изобретения.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, «Обзора литературы», главы «Материалы и методы», 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 359 источников, из которых 50 отечественных и 309 зарубежных. Материалы диссертации отражены на 274 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 38 рисунками и 55 таблицами.
