Введение к работе
Актуальность темы. Инактивированные вирусные вакцины в течение последних 50 лет широко используются в борьбе с вирусными заболеваниями. Однако некоторые из них обладают серьезными недостатками. Так, в частности, гриппозные вакцины являются недостаточно эффективными для лиц пожилого возраста [Gross et al., 1995; Palachi, 1997; Khurana et al., 2012; Kositanont et al., 2012] и не способны защищать от дрейфовых вариантов вируса гриппа [Belshe et al., 2000; De Yong, 2000; Cox et al., 2004]. С другой стороны, инактивированные полиомиелитные вакцины обладают относительно низкой иммуногенностью, и для создания прочного иммунитета против полиомиелита требуется многократная иммунизация.
В настоящее время для повышения эффективности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные соли (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины – QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК) и др. [Kovacs-Nolan et al. 2009; Olafsdottir et al. 2009].
Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподобные частицы (VLP – virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс (ISCOM - immunostimulating complex) [Valiante et al., 2003; Baudner et al. 2009]. Зарубежные коммерческие гриппозные вакцины выпускаются лишь с одним адъювантом MF-59, и такие вакцины оказались более иммуногенными при вакцинации пожилых лиц, однако, обладали повышенной реактогенностью [Podda, 2001; Podda, Del Guidici,2003].
В литературе появились сообщения об использовании природного катионного полисахарида – хитозана в качестве мукозо-адгезивного адъюванта для инактивированных гриппозных и некоторых других вакцин, вводимых мукозально [Bacon et al, 2000; Illum et al., 2001; Thanou et al., 2001; Illum, 2003; van der Lubben et al.,2003; Kang et al., 2009; Prego et al.,2010]. Хитозан является линейным полимером, состоящим из мономеров D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, и отличающимся низкой токсичностью, биодеградируемостью и биосовместимостью. В последние годы было показано, что хитозан повышает эффективность инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин при парентеральном введении [Zacharow et al., 2007; Ghendon et al, 2008; Ghendon et al, 2011]. Однако, несмотря на большой интерес к данному полимеру, многие аспекты иммунологической активности хитозана и его практического применения остаются до настоящего времени малоисследованными. Отсутствует информация о сравнительной адъювантной активности различных форм производных хитозана (растворимых, мелкодисперсных и.т.д.), а также о влиянии производных хитозана на врожденные механизмы иммунитета при парентеральной и мукозальной иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами.
Цель исследования: изучение адъювантных свойств производных хитозана на модели гриппозных и полиомиелитных вакцин с оценкой молекулярно-клеточных механизмов их действия на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета.
Задачи:
1. Исследовать адъювантные свойства производных хитозана различной химической природы.
2. Изучить влияние производных хитозана на активацию адаптивного иммунитета при иммунизации мышей инактивированными и живыми вирусными вакцинами.
3. Исследовать экспрессию Толл-подобных рецепторов дендритными клетками и спленоцитами мышей в ответ на введение инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов.
4. Оценить цитокиновый профиль мышей при введении инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана.
5. Определить особенности иммунофенотипа спленоцитов мышей при иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами в комбинации с препаратами хитозана.
Научная новизна работы
Впервые исследовано воздействие высокомолекулярного (ММ 200 kDa) глютамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония при парентеральном и мукозальном методах введения с инактивированными и живыми гриппозными вакцинами на стимуляцию врожденного и адаптивного иммунитета мышей. Установлена возможность повышения иммуногенности инактивированной полиомиелитной вакцины при включении в ее состав производных хитозана в качестве адъювантов.
Показано, что при парентеральном введении производных хитозана в комбинации с инактивированной гриппозной сплит-вакциной происходило усиление активации врожденного и адаптивного иммунитета у мышей, что проявлялось в экспрессии эндосомальных Толл-подобных рецепторов ДК (TLR7, TLR8, TLR9), индукции синтеза цитокинов в крови IL-12, INF-, IL-17, IL-1 и IL-5; повышении численности Т (CD3, CD4, CD8, T), В лимфоцитов (CD19, CD5), NK (CD16/32), NKT (CD3/NK), T-reg (CD4/CD25/Foxp3) клеток. Включение в состав полиомиелитных вакцин производных хитозана приводило к увеличению численности СD3, CD8, NK, CD3/NK, CD4/CD25/Foxp3 и T позитивных клеток и ДК с экспрессией эндосомальных TLRs.
Выявлены общие закономерности цитокиного профиля при иммунизации животных инактивированными и живыми гриппозными и инактивированными полиомиелитными вакцинами: резкое повышение IL-12, умеренное повышение IFN- и снижение TNF-.
Установлено, что мукозальная иммунизация мышей живой гриппозной вакциной в комбинации с производными хитозана способствовала повышению уровней IgG и sIgA в респираторном тракте мышей и препятствовала размножению вирулентного штамма вируса гриппа в легких мышей; увеличивала содержание TLR2 и TLR9-экспрессирующих клеток, а также субпопуляций В1 (CD5) и T-лимфоцитов (CD3, CD8 и CD4) и NK.
Включение производных хитозана в состав инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин мобилизует различные звенья врожденного иммунитета, приводя к поляризации иммунного ответа по Th1-типу.
Научно-практическая значимость
Получено положительное решение Федерального Института промышленной собственности РФ на заявку № 2010114819/15 (020894) «Способ повышения иммуногенности холодоадаптированного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин» от 14.04. 2010.
Показана целесообразность использования глютамата хитозония и суспензии микро/наночастиц сульфата хитозония для повышения иммуногенности и защитной эффективности инактивированных и живых гриппозных вакцин, активирующих мукозальный и системный иммунитет при парентеральной иммунизации.
Включение в состав инактивированной полиомиелитной вакцины модифицированных препаратов хитозана в качестве адъювантов позволит повысить иммуногенность полиомиелитных вакцин.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Выявлена зависимость адъювантных свойств производных хитозана от особенностей их химической природы при наибольшей активности глютамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония, которые существенно не различались по адъювантным свойствам при введении с гриппозными и полиомиелитными вакцинами.
2. Введение производных хитозана в состав живых и инактивированных гриппозных вакцин способно повысить их иммуногенность и защитную эффективность. Введение производных хитозана в состав инактивированных полиовакцин повышает их иммуногенность.
3. Производные хитозана в составе вирусных вакцин при иммунизации животных приводят к повышению в крови количества Т и В лимфоцитов, NK клеток; уровня провоспалительных (IL-1, IL-6) и регуляторных (IFN-, IL-12, IL-17) цитокинов и снижению TNF-, что устраняет последствия иммуносупрессии, индуцированной вирусными вакцинами, и нейтрализует гиперактивацию иммунной системы при введении живых вакцин.
Апробация материалов диссертации и публикации
Основные материалы диссертационной работы доложены на: Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2010); IX Конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2010), VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2010), научно-практической конференции молодых учёных НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2011), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «От теории – к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011), X Латино-американском конгрессе иммунологов (Перу, 2012).
Апробация диссертации состоялась 29 мая 2012 г на совместной конференции Кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, лаборатории механизмов регуляции иммунитета и лаборатории РНК-содержащих вирусов ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, девяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 189 источников (68 отечественных и 121 зарубежный). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 29 таблицами.
